والأسلوب القائم على الطفو من تحديد مستويات الدهون في<em> ذبابة الفاكهة</em
Summary
نحن هنا نقدم وسيلة لقياس مستويات الدهون عضوي في الطور الثالث (L3) مرحلة اليرقات من ذبابة الفاكهة. هذه الطريقة يستغل كثافة منخفضة نسبيا من الأنسجة الدهنية للتمييز بين اليرقات مع مخازن الدهون المتغيرة. التحليل القائم على الطفو هو أداة قيمة لفحص السريع، واستنساخه، واقتصادية.
Abstract
Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.
Introduction
وقد استخدمت ذبابة الفاكهة لأكثر من قرن في دراسة علم الوراثة وغيرها من المسائل البيولوجية الأساسية. في العقود القليلة الماضية، أصبح من الواضح أن ذبابة الفاكهة هو أداة قوية في دراسة العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. كما 70-80٪ من الجينات المرتبطة مع الأمراض التي تصيب الإنسان لها ortholog الطيران تحديده و1-4، تقدم ذبابة الفاكهة نظام بعد للترجمة مبسطة للدراسة الأمراض المعقدة. وقد استفاد الأيض بشكل خاص من هذه الدراسة. ليست فقط في علم الوراثة من عملية التمثيل الغذائي المحفوظة جيدا بين الذباب والبشر، ولكن الأجهزة المختصة وأنواع الخلايا هي أيضا مشابهة جدا 2،5. على سبيل المثال، الدهون في الجسم من مخازن الطيران على حد سواء triacylglycerides (TAG) والجليكوجين، وظائف مماثلة لتلك التي تقوم في الكبد الثدييات والدهنية البيضاء الأنسجة 6. عن طريق ذبابة الفاكهة كنموذج للسمنة الإنسان قد تحسنت بشكل كبير من فهمنا للدهنالتمثيل الغذائي وعلم الوراثة من السمنة 7. مرحلة اليرقات التنمية هي مفيدة بشكل خاص لدراسة فصل المواد المغذية إلى تخزين أو استخدام لأنها مخصصة لتغذية وتخزين الطاقة لاستخدامها خلال pupariation.
حاليا، هناك العديد من الأساليب الكمية المختلفة لتحديد مستويات التخزين الدهون في ذبابة الفاكهة. الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع هو فحص اللونية إلى جانب (CCA) 8،9. وقد وضعت التقييم القطري المشترك لتحديد مستويات TAG في مصل الدم البشري وتعمل على فرضية أن الجلسرين تتحرر من العمود الفقري من الدهون الثلاثية سيخضع العديد من ردود الفعل، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى رد فعل يقترن الأكسدة توليد منتج ملون. ثم يتم قياس امتصاص موجات محددة من الضوء لتحديد المبلغ الأولي من الجلسرين الحاضر. ومع ذلك، الجلسرين ويمكن أيضا أن تتحرر من أحادية وdiacylglycerides بالإضافة إلى TAG، وبالتالي قد لا تكون مقياسا دقيقا لياليtored الدهون في الجسم 9. وعلاوة على ذلك، صبغة عين الذباب الكبار سحق يمكن أن تتداخل مع بعض قراءات الامتصاصية وتعقيد النتائج 9،10. لذلك، CCA يجب أن يصاحب ويصادق عليها طبقة رقيقة اللوني (TLC)، والذي يسمح لفصل معظم الأسر الدهون التي يمكن quantitated من كثافة 10،11. ومع ذلك، بعض الطبقات الشحمية مثل الجامدة لا يمكن تحليلها ويجب أن يكون كميا بطريقة مختلفة (12). مطياف الكتلة (MS) هو وسيلة دقيقة ل quantitate جميع الطبقات من الدهون الخلوية الرئيسية 12،13. ومع ذلك، فإن إجراءات استخراج الدهون اللازمة لتحليل بواسطة MS على حد سواء وقتا طويلا (أكثر جني ما يقرب من يوم كامل) ومكلفة. هنا نقدم طريقة بديلة لتحديد بسرعة وبتكاليف زهيدة مستويات العضوي الدهون في اليرقات L3 من ذبابة الفاكهة.
الطريقة المعروضة أدناه يستغل الفرق في الكثافة بين الأنسجة الدهنية والأنسجة العجاف. اتحاد كرة القدم الثديياتر الأنسجة لديها كثافة من حوالي 0.9 جم / مل 14 بينما العضلات والهيكل العظمي كما كثافة 1.06 جم / مل 15. هذا الاختلاف يعني أن الحيوانات مع مخازن أعلى من الدهون سيكون أقل كثافة من الحيوانات مع مخازن أقل من الدهون، والتي سوف تسمح لهم تطفو أفضل في حل من كثافة ثابتة. هذه الخاصية تسمح لفحص سريع للغاية لعدد كبير من الحيوانات في حين يجري كل غير مكلفة وغير الغازية. وقد تم استخدام التحليل القائم على الطفو على حد سواء لتأكيد الظواهر من تغيير التنظيمية المعروفة من مستويات الدهون وكذلك لتحديد المنظمين وراثية وعصبية جديدة من السمنة 16،17.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من التقنيات التي تم تطويرها لقياس مستويات الدهون 8-10. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب يأتي مع بعض العوائق الرئيسية التي تتم معالجتها بواسطة الفحص القائمة على الطفو المبينة أعلاه. أولا، هذا الاختبار هو سريع للغاية. اختبار التدرج التركيز الكام…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.
Materials
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50mL Conical | Fisher | 50-869-569 |
References
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development. Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).
- Ruden, D. M., Lu, X. Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics. Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).
- Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circ. Res. 109, 794-806 (2011).
- Trinh, I., Boulianne, G. L. Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila. Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).
- Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus. Lipids Health Dis. 13, 71 (2014).
- Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models. Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).
- Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay. PLoS One. 6 (9), e23796 (2011).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68, 105-115 (2014).
- Al-Anzi, B., Zinn, K. Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila. PLoS One. 5 (8), e12353 (2010).
- Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry. J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).
- Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).
- Shui, G., et al. Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics. Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).
- Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia. Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).
- Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).
- Mosher, J., et al. Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat. Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).
- Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability. PLoS Genet. 6 (11), e1001206 (2010).
- Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism. Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
