Summary

Ein Auftriebskörper-basierte Methode zur Bestimmung Fettwerte in<em> Drosophila</em

Published: November 01, 2016
doi:

Summary

Hier präsentieren wir eine Methode organismal Fettwerte im dritten Larvenstadium (L3) Larvenstadium von Drosophila melanogaster zu messen. Dieses Verfahren nutzt die vergleichsweise geringe Dichte von Fettgewebe zwischen Larven mit einer veränderten Fettspeicher zu unterscheiden. Buoyancy-basierte Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für die schnelle, reproduzierbare und wirtschaftliche Screening.

Abstract

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

Introduction

Drosophila melanogaster ist seit mehr als einem Jahrhundert in der Erforschung der Genetik und andere grundlegende biologische Fragen verwendet. In den letzten Jahrzehnten hat es klar geworden , dass Drosophila ein mächtiges Werkzeug in der Studie von vielen menschlichen Krankheiten. Da 70-80% der mit menschlichen Krankheiten assoziierten Gene haben ein identifizierter Fliegen ortholog 1. 4. stellt Drosophila ein vereinfachtes noch übersetzbar System , bei dem komplexe Krankheiten zu studieren. Der Stoffwechsel hat vor allem von einer solchen Studie profitiert. Nicht nur sind die Genetik der Stoffwechsel gut konserviert zwischen Fliegen und Menschen, aber die zuständigen Organe und Zelltypen sind auch sehr ähnlich 2,5. Zum Beispiel kann die Fettkörper der Fliegen speichert beide Triacylglyceride (TAG) und Glykogen, die Funktionen analog zu denen in Säugetierleber und weißen Fettgewebe 6 durchgeführt. Mit Drosophila als Modell für menschliche Fettleibigkeit hat unser Verständnis von Lipid erheblich verbessertStoffwechsel und die Genetik der Adipositas 7. Larvenentwicklungsstadium ist besonders nützlich für die Untersuchung der Segregation von Nährstoffen Lagerung oder Verwendung, wie sie zum Zuführen und die Speicherung von Energie widmet sich während Puparium-Bildung verwendet werden.

Derzeit gibt es viele verschiedene quantitative Methoden der Fettlagerebenen in Drosophila zu bestimmen. Die am weitesten verbreitete Methode ist die gekoppelte kolorimetrischen Assay (CCA) 8,9. CCA wurde zur Bestimmung der TAG Niveaus in menschlichem Serum entwickelt und arbeitet auf der Prämisse, dass aus dem Rückgrat Triglyceriden freigesetzt Glycerin werden mehrere Reaktionen eingehen, letztlich in einer Redox-Reaktion gekoppelt ergeb ein gefärbtes Produkt erzeugen. Die Absorption bestimmter Wellenlängen des Lichts wird dann gemessen, um die anfängliche Menge an Glycerin vorhanden zu bestimmen. Jedoch Glycerin kann auch aus Mono- und Diacylglyceriden neben TAG freigesetzt werden und somit kann kein genaues Maß für s seinwachten Körperfett 9. Außerdem Auge Pigment des zerquetschten erwachsenen Fliegen kann mit einigen Extinktionsablesungen stören und 9,10 Ergebnisse erschweren. Daher muss CCA durch Dünnschichtchromatographie (TLC) begleitet und validiert werden, die für die Trennung der meisten Lipid Familien ermöglicht , die durch Densitometrie 10,11 quantifiziert werden kann. Allerdings können einige Lipidklassen wie Sterole nicht analysiert werden und muss eine andere Art und Weise 12 quantifiziert werden. Die Massenspektrometrie (MS) ist eine genaue Art und Weise alle Klassen der wichtigsten zellulären Lipiden 12,13 quantitativ zu bestimmen. die Lipidextraktionsverfahren jedoch notwendig, die von MS zu analysieren sind sowohl zeitaufwendig (die meisten Einnahme fast einen ganzen Tag) und kostspielig. Hier präsentieren wir eine alternative Methode , um schnell und kostengünstig organismal Fettwerte in der L3 – Larven von Drosophila melanogaster bestimmen.

Das Verfahren stellt sich wie folgt nutzt die Differenz in der Dichte zwischen Fettgewebe und magerem Gewebe. Mammalian fat Gewebe hat eine Dichte von etwa 0,9 g / ml 14 während der Skelettmuskulatur als einer Dichte von 1,06 g / ml 15. Dieser Unterschied bedeutet, dass Tiere mit höheren Vorräte an Fett geringere Dichte als Tiere mit geringeren Speicher des Fettes haben, die es ihnen ermöglichen besser fester Dichte in einer Lösung zu schweben. Diese Eigenschaft ermöglicht eine extrem schnelle Screening einer großen Anzahl von Tieren, während sowohl kostengünstige und nicht-invasive sind. Buoyancy-basierte Analyse wurde sowohl die Phänotypen der Änderung bekannten Regulatoren der Fettwerte sowie zu identifizieren , neue genetische und neurologische Regulatoren der Fettleibigkeit 16,17 zur Bestätigung verwendet.

Protocol

1. Sammeln Eier aus Flies mit Genotypen von Interesse HINWEIS: Ideal Kreuze bestehen aus 150 virgin Fliegen und mindestens 75 Männer. Auf Sammlungen sollten mindestens 200 Fliegen bestehen. Bereiten Sie Traubenplatten. Hinzufügen 37,5 g Agar 1,5 L destilliertem Wasser in einem 4 l-Kolben. Autoklav Wasser / Agar Mix für 50 min bei 121 ° C (250 ° F). Während Wasser / Agar Mix Autoklavierung ist, in den 500 ml Traubensaft 50 g Saccharose und rühren mit einem Rührstab …

Representative Results

Abbildung 1 zeigt ein Beispiel dafür , wie die Auftriebsbasierten Assay erkennen kann sowohl höhere als auch niedrigere Fettreserven in genetisch manipulierten Larven. 1A zeigt , daß bei Anregung oder Silencing einer bestimmten Untergruppe von Neuronen (E347) im Larven Gehirn induziert niedrigere und höhere Fett Geschäfte sind. Die gleichen genetischen Hintergrund – Kontrolle wurde in beiden Fällen verwendet. 1B zeigt ein Beispiel …

Discussion

Es gibt eine Vielzahl von Techniken , die entwickelt wurden Lipidspiegel 8 zu messen 10. Allerdings kommt jedes dieser Verfahren einige wesentliche Nachteile, die durch den Auftrieb basierenden Assay oben umrissenen adressiert sind. Erstens ist dieser Test sehr schnell. eine vollständige Konzentrationsgradienten Prüfung dauert nicht länger als 30 – 60 min. Dies ist eine große Verbesserung gegenüber den meisten der Techniken, die derzeit im Einsatz. Zum Beispiel Lipid-Quantifizieru…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.

Materials

Bacto Agar VWR 214030
Welch's Original 100% Grape Juice
Sucrose Fisher S512
Tegosept Genesee Scientific 20-259
Ethanol 200 proof
Baker's yeast Fleichmann's
Yellow Corn Meal Quaker Enriched degerminated
Drosophila Agar Type II Apex 66-104
Soy Flour ADM Specialty Ingredients 062-100
Malt Extract Breiss 5748
Light Corn Syrup Karo
Propionic Acid VWR U330-09
Sodium chloride Fisher 50147491
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655-100G
Sodium phosphate anhydrous Fisher S3933
Potassium chloride Fisher P330-500
35 x 10mm petri plate Fisher 08-757-100A
50mL Conical Fisher 50-869-569

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Cite This Article
Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e54744, doi:10.3791/54744 (2016).

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