Qui vi presentiamo un metodo per misurare i livelli di grasso organismal nel terzo instar (L3) stadio larvale di Drosophila melanogaster. Questo metodo sfrutta la relativamente bassa densità di tessuto adiposo a distinguere tra le larve con depositi di grasso alterati. analisi di galleggiabilità-based è uno strumento prezioso per lo screening rapido, riproducibile, ed economico.
Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.
Drosophila melanogaster è stato utilizzato per più di un secolo nello studio della genetica e di altre questioni biologiche fondamentali. Negli ultimi decenni, è diventato chiaro che la Drosophila è un potente strumento per lo studio di molte malattie umane. Il 70 – 80% di geni associati a malattie umane hanno una mosca ortologo identificata 1 – 4, Drosophila fornisce un sistema semplificato ma traducibile in cui studiare le malattie complesse. Il metabolismo, in particolare, ha beneficiato di tale studio. Non solo la genetica del metabolismo ben conservati tra le mosche e gli esseri umani, ma gli organi competenti e tipi di cellule sono molto simili a 2,5. Ad esempio, il grasso corporeo dei negozi mosca entrambi Triacilgliceroli (TAG) e di glicogeno, funzioni analoghe a quelle svolte nel fegato dei mammiferi e del tessuto adiposo bianco 6. Utilizzando Drosophila come modello per l'obesità umana ha notevolmente migliorato la nostra comprensione di lipidiil metabolismo e la genetica di obesità 7. Lo stadio larvale di sviluppo è particolarmente utile per studiare la segregazione di nutrienti stoccaggio o utilizzo come è dedicata all'alimentazione e l'immagazzinamento di energia da utilizzare durante pupariation.
Attualmente, ci sono molti metodi quantitativi diversi della determinazione dei livelli di stoccaggio dei grassi in Drosophila. Il metodo più diffuso è il saggio colorimetrico accoppiato (CCA) 8,9. CCA è stato sviluppato per determinare i livelli TAG nel siero umano e opera sulla premessa che glicerolo liberato dalla spina dorsale di trigliceridi subirà diverse reazioni, che si traduce in una reazione redox-coupled generando un prodotto colorato. Assorbanza di specifiche lunghezze d'onda di luce viene poi misurata per determinare la quantità iniziale di glicerolo presente. Tuttavia, glicerolo può anche essere liberato da mono- e diacylglycerides oltre al TAG e quindi non può essere una misura accurata di storato grasso corporeo 9. Inoltre, l'occhio del pigmento di mosche adulte schiacciati può interferire con alcune letture di assorbanza e complicare i risultati 9,10. Pertanto, CCA deve essere accompagnato e convalidato cromatografia su strato sottile (TLC), che permette la separazione delle maggior parte delle famiglie di lipidi che può essere quantificata mediante densitometria 10,11. Tuttavia, alcune classi di lipidi, come steroli non possono essere analizzati e devono essere quantificati un modo diverso 12. La spettrometria di massa (MS) è un modo preciso per quantificare tutte le classi di grandi lipidi cellulari 12,13. Tuttavia, le procedure di estrazione dei lipidi necessari per analizzare da MS sono sia in termini di tempo (più presa quasi un giorno intero) e costosa. Qui vi presentiamo un metodo alternativo per determinare rapidamente ed economicamente livelli di grasso organismal nelle larve L3 di Drosophila melanogaster.
Il metodo presentato sotto sfrutta la differenza di densità tra tessuto adiposo e tessuto magro. fa mammiferit tessuto ha una densità di circa 0,9 g / ml 14 mentre il muscolo scheletrico come una densità di 1,06 g / ml 15. Questa differenza significa che gli animali con elevate riserve di grasso avranno densità inferiore rispetto agli animali con i negozi più bassi di grasso, che permetteranno loro di galleggiare meglio in una soluzione della densità fisso. Questa proprietà consente estremamente rapido lo screening di un gran numero di animali pur essendo sia poco costoso e non invasivo. Analisi di galleggiabilità-based è stato utilizzato sia per confermare i fenotipi di alterare regolatori noti di livelli di grasso, nonché di individuare nuovi regolatori genetici e neurologici di obesità 16,17.
Ci sono una moltitudine di tecniche che sono state sviluppate per misurare i livelli di lipidi 8 – 10. Tuttavia, ciascuno di questi metodi viene fornito con alcuni importanti inconvenienti che sono indirizzati mediante il saggio galleggiamento basato descritto sopra. In primo luogo, questo test è estremamente rapido. Test di un gradiente di piena concentrazione non richiede più di 30 – 60 min. Questo è un enorme miglioramento sulla maggior parte delle tecniche attualmente in uso. Ad e…
The authors have nothing to disclose.
K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.
Bacto Agar | VWR | 214030 | |
Welch's Original 100% Grape Juice | |||
Sucrose | Fisher | S512 | |
Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
Ethanol | 200 proof | ||
Baker's yeast | Fleichmann's | ||
Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
Malt Extract | Breiss | 5748 | |
Light Corn Syrup | Karo | ||
Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
35 x 10mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
50mL Conical | Fisher | 50-869-569 |