で脂肪レベルを決定するの浮力に基づく方法<em>ショウジョウバエ</em
Summary
ここでは、三齢（L3） キイロショウジョウバエの幼虫期における生物の脂肪レベルを測定するための方法を提示します。この方法は、変更された脂肪店との幼虫を区別するために、脂肪組織の比較的低密度を利用します。浮力ベースの分析、迅速な再現性、および経済的なスクリーニングのための貴重なツールです。
Abstract
Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.
Introduction
キイロショウジョウバエは遺伝学および他の基本的な生物学的な質問の研究で一世紀以上にわたって使用されてきました。過去数十年では、 ショウジョウバエは 、多くのヒト疾患の研究における強力なツールであることが明らかになりました。ヒトの疾患に関連する遺伝子の80％に同定フライオルソログ1持っている– – 70のように4を 、 ショウジョウバエは、複雑な疾患を研究する中で簡略化し、まだ翻訳可能なシステムを提供します。特に代謝は、このような研究から恩恵を受けています。だけでなく、よくハエとヒトの間で保存代謝の遺伝学がありますが、関連する器官および細胞型はまた、2,5非常によく似ています。例えばフライストアの両方トリアシルグリセリド（TAG）およびグリコーゲン、哺乳動物の肝臓および白色脂肪組織6で行われたものと類似の機能の、脂肪体。人間の肥満のモデルとしてショウジョウバエを使用すると、大幅に脂質の我々の理解を改善しました代謝と肥満7の遺伝学。開発の幼虫期は、それが供給およびpupariation時に使用するエネルギーの貯蔵に専用されているような記憶や利用に栄養素の分離を研究するために特に有用です。
現在、 ショウジョウバエにおける脂肪蓄積レベルを決定する多くの異なる定量的な方法があります。最も広く使用されている方法は、結合された比色アッセイ（CCA）8,9です。 CCAは、ヒト血清中のTAGのレベルを決定するために開発され、トリグリセリド骨格から遊離グリセロールを最終的に着色された生成物を生成する酸化還元結合反応を生じ、いくつかの反応を受けることを前提に動作しました。光の特定の波長の吸光度は、その後、グリセロール存在の初期量を決定するために測定されます。しかし、グリセリンは、タグに加えて、モノ – およびジアシルグリセリドから遊離させることができるので、複数の正確な測定値ではないかもしれませんtored体脂肪9。さらに、破砕大人のハエの目の顔料は、いくつかの吸光度の読み取りを妨げ、結果9,10を複雑にすることができます。したがって、CCAが同行し、デンシトメトリー10,11によって定量することができるほとんどの脂質ファミリーの分離を可能に薄層クロマトグラフィー（TLC）、によって検証されなければなりません。しかし、ステロールのようないくつかの脂質クラスを分析することができず、別の方法12を定量化する必要があります。質量分析（MS）は、主要な細胞脂質12,13のすべてのクラスを定量するための正確な方法です。しかし、MSによって分析するために必要な脂質抽出手順は、両方の時間がかかり（ほとんど終日ほぼ服用）と高価です。ここでは、迅速かつ安価にキイロショウジョウバエのL3幼虫に生物の脂肪レベルを決定するための別の方法を提示します。
以下に示す方法は、脂肪組織と除脂肪組織の密度差を利用します。哺乳動物のファトンの組織は、1.06グラム/ミリリットル15の密度の約0.9グラム/ミリリットル14一方、骨格筋の密度を有します。この違いは、脂肪の高い店舗を持つ動物はそれらを固定濃度の溶液中でよりよく浮くことができます脂肪の低い店舗、を有する動物よりも低い密度を有することを意味します。安価で非侵襲性の両方でありながらこのプロパティは、多数の動物の非常に迅速なスクリーニングを可能にします。浮力に基づく分析は、脂肪レベルの公知の調整を変えるの表現型を確認するだけでなく、肥満16,17の新たな遺伝的および神経学的調節因子を同定するための両方に使用されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
10 –脂質レベル8を測定するために開発された技術の多くがあります。しかし、これらの各方法は、上記で概説した浮力ベースのアッセイによって対処されているいくつかの大きな欠点が付属しています。まず、このアッセイは非常に迅速です。 60分 – フル濃度勾配をテストしても30以上を取りません。これは、現在使用されている技術のほとんどに大きな改善です。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.
Materials
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50mL Conical | Fisher | 50-869-569 |
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