Um método baseado em flutuabilidade da determinação dos níveis de gordura no<em> Drosophila</em
Summary
Aqui apresentamos um método para medir os níveis de gordura organismais no terceiro estádio (L3) fase larval de Drosophila melanogaster. Este método explora a relativamente baixa densidade de tecido adiposo para diferenciar entre as larvas com reservas de gordura alterados. A análise à base de empuxo é uma valiosa ferramenta para a triagem rápida, reprodutível e econômico.
Abstract
Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.
Introduction
Drosophila melanogaster tem sido usado por mais de um século no estudo da genética e outras questões biológicas básicas. Nas últimas décadas, tem-se tornado claro que a Drosophila é uma ferramenta poderosa para o estudo de muitas doenças humanas. Como 70 – 80% de genes associados a doenças humanas têm uma mosca ortólogo identificado 1-4, um sistema de Drosophila fornece ainda traduzível simplificado em que para estudar doenças complexas. Metabolismo, em particular, beneficiou de tal estudo. Não só são os genética do metabolismo bem conservadas entre moscas e seres humanos, mas os órgãos e tipos de células relevantes são também muito semelhantes 2,5. Por exemplo, o corpo de gordura das lojas da mosca ambos triacilglicerídeos (TAG) e de glicogênio, funções análogas às realizadas no fígado de mamíferos e adiposo branco tecido 6. Usando Drosophila como modelo para a obesidade humana melhorou muito a nossa compreensão dos lípidosmetabolismo e a genética da obesidade 7. A fase larval de desenvolvimento é particularmente útil para o estudo da segregação de nutrientes para o armazenamento ou utilização, uma vez que é dedicado a alimentação e o armazenamento de energia para ser usado durante pupariation.
Atualmente, existem muitos métodos quantitativos diferentes de determinar os níveis de armazenamento de gordura em Drosophila. O método mais amplamente utilizado é o ensaio colorimétrico acoplado (CCA) 8,9. CCA foi desenvolvido para determinar os níveis no soro humano TAG e opera-se na premissa de que o glicerol libertado a partir da espinha dorsal de triglicéridos vai passar por várias reacções, resultando numa reacção de acoplamento de redox gerar um produto colorido. Absorbância de comprimentos de onda específicos da luz é então medido para determinar a quantidade inicial de glicerol presente. No entanto, o glicerol pode também ser libertada da mono e diacilglic�idos além de TAG e, portanto, pode não ser uma medida precisa da stored gordura corporal 9. Além disso, o pigmento do olho de moscas adultas esmagadas podem interferir com algumas leituras de absorbância e complicar resultados 9,10. Portanto, a CCA deve ser acompanhado e validado por cromatografia em camada fina (TLC), que permite a separação da maior parte das famílias de lípidos que podem ser quantificados por densitometria 10,11. Contudo, algumas classes de lípidos como os esteróis não podem ser analisadas e deve ser quantificado de forma diferente 12. Espectrometria de massa (MS) é uma maneira precisa para quantificar todas as classes principais de lípidos celulares 12,13. No entanto, os processos de extracção de lípidos necessários para analisar por MS são tanto demorado (mais levando quase completo de um dia) e dispendioso. Aqui apresentamos um método alternativo para determinar rápida e barata níveis do organismo de gordura nas larvas L3 de Drosophila melanogaster.
O método apresentado a seguir explora a diferença de densidade entre o tecido gordo e de tecido magro. fa MammalianT tecido tem uma densidade de aproximadamente 0,9 g / mL, enquanto 14 músculo esquelético como uma densidade de 1,06 g / mL de 15. Esta diferença significa que os animais com lojas mais elevados de gordura terá densidade mais baixa do que os animais com lojas mais baixos de gordura, o que permitirá que eles flutuem melhor numa solução de densidade fixa. Esta propriedade permite a triagem extremamente rápido de um grande número de animais, enquanto sendo tanto barato e não-invasiva. Análise à base de flutuabilidade foi usado tanto para confirmar os fenótipos de alterar reguladores conhecidos de níveis de gordura, bem como para identificar novos reguladores genéticos neurológicos e da obesidade 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há uma grande variedade de técnicas que têm sido desenvolvidos para medir os níveis de lípidos 8-10. No entanto, cada um destes métodos é fornecido com alguns dos principais inconvenientes que são resolvidos pelo ensaio baseado em flutuabilidade descrito acima. Em primeiro lugar, este ensaio é extremamente rápida. O teste de um gradiente de concentração total não leva mais de 30 – 60 min. Esta é uma grande melhoria sobre a maioria das técnicas correntemente em uso. Por exe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.
Materials
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50mL Conical | Fisher | 50-869-569 |
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