Summary

Un método basado en la flotabilidad de la determinación de los niveles de grasa en<em> Drosophila</em

Published: November 01, 2016
doi:

Summary

Aquí presentamos un método para medir los niveles de grasa organísmicos en el tercer estadio (L3) larvas de Drosophila melanogaster. Este método aprovecha la relativamente baja densidad de tejido graso para diferenciar entre las larvas con las reservas de grasa alterados. análisis basado en la flotabilidad es una herramienta valiosa para la detección rápida, reproducible y económico.

Abstract

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

Introduction

Drosophila melanogaster se ha utilizado durante más de un siglo en el estudio de la genética y otras cuestiones biológicas básicas. En las últimas décadas, se ha hecho evidente que la Drosophila es una poderosa herramienta en el estudio de muchas enfermedades humanas. Un 70 – 80% de los genes asociados con enfermedades humanas tienen un ortholog identificado mosca de 1 4, Drosophila proporciona un sistema simplificado aún traducible en el que estudiar las enfermedades complejas. Metabolismo, en particular, se ha beneficiado de estos estudios. No sólo son la genética del metabolismo bien conservados entre las moscas y los seres humanos, pero los órganos y tipos de células son también muy similares 2,5. Por ejemplo, la grasa corporal de las tiendas de la mosca de ambos triacilglicéridos (TAG) y glucógeno, funciones análogas a las realizadas en el hígado de los mamíferos y el tejido adiposo blanco 6. Uso de Drosophila como modelo para la obesidad humana ha mejorado enormemente nuestro conocimiento de los lípidosmetabolismo y la genética de la obesidad 7. Las larvas de desarrollo es particularmente útil para estudiar la segregación de los nutrientes en el almacenamiento o utilización, ya que está dedicado a la alimentación y el almacenamiento de energía que se utilizará durante pupariation.

Actualmente, hay muchos diferentes métodos cuantitativos de determinación de los niveles de almacenamiento de grasa en Drosophila. El método más ampliamente utilizado es el ensayo colorimétrico acoplado (CCA) 8,9. CCA fue desarrollado para determinar los niveles de TAG en el suero humano y opera en la premisa de que el glicerol liberado de la columna vertebral de los triglicéridos se someterá a varias reacciones, lo que se traduce en una reacción redox acoplado a la generación de un producto coloreado. A continuación se mide la absorbancia de las longitudes de onda específicas de luz para determinar la cantidad inicial de glicerol presente. Sin embargo, el glicerol también puede ser liberada de mono y diacilglicéridos Además de TAG y por lo tanto puede no ser una medida precisa de sgrasa corporal reada 9. Por otra parte, pigmento de los ojos de las moscas adultas trituradas puede interferir con algunas lecturas de absorbancia y complicar los resultados 9,10. Por lo tanto, CCA debe ir acompañada y validado por cromatografía en capa fina (TLC), que permite la separación de la mayoría de las familias de lípidos que se puede cuantificar mediante densitometría 10,11. Sin embargo, algunas clases de lípidos como esteroles no pueden ser analizados y deben cuantificarse de manera diferente 12. Espectrometría de masas (MS) es una forma precisa para cuantificar todas las clases de los principales lípidos celulares 12,13. Sin embargo, los procedimientos de extracción de lípidos necesarias para analizar por MS consumen mucho tiempo (más la toma de casi un día completo) y costoso. Aquí presentamos un método alternativo para determinar rápida y barata niveles de grasa del organismo en las larvas L3 de Drosophila melanogaster.

El método presentado a continuación explota la diferencia de densidad entre el tejido de grasa y tejido magro. fa mamíferost tejido tiene una densidad de aproximadamente 0,9 g / ml 14 mientras que el músculo esquelético como una densidad de 1,06 g / ml 15. Esta diferencia significa que los animales con las tiendas más altos de grasa tienen menor densidad que los animales con las tiendas más bajos de grasa, que les permitan una mejor flotan en una solución de densidad fija. Esta propiedad permite la detección extremadamente rápida de un gran número de animales, mientras que ser barato y no invasivo. Análisis basado en la flotabilidad se ha utilizado tanto para confirmar los fenotipos de la alteración de los reguladores conocidos de los niveles de grasa, así como para identificar nuevos reguladores genéticos y neurológicos de la obesidad 16,17.

Protocol

1. recoger huevos de moscas con genotipos de interés NOTA: cruces Ideal constan de 150 moscas vírgenes y al menos 75 varones. colecciones de archivo debe consistir de por lo menos 200 moscas. Preparar placas de uva. Añadir 37,5 g de agar a 1,5 L de agua destilada en un matraz de 4 L. Autoclave mezcla de agua / agar durante 50 minutos a 121 ºC (250 ºF). Mientras que el agua / mezcla de agar es el tratamiento en autoclave, añadir 50 g de sacarosa al jugo de uva 500 ml …

Representative Results

La figura 1 representa un ejemplo de cómo el ensayo basado en la flotabilidad se puede detectar tanto las reservas de grasa más altos y más bajos en las larvas manipulado genéticamente. La Figura 1A muestra que la excitación o el silenciamiento de un cierto subconjunto de neuronas (E347) en el cerebro de las larvas induce grasa inferior y superior tiendas respectivamente. El mismo control antecedentes genéticos se utilizó en ambos casos. L…

Discussion

Hay una multitud de técnicas que se han desarrollado para medir los niveles de lípidos 8-10. Sin embargo, cada uno de estos métodos viene con algunas desventajas importantes que ya están contemplados en el ensayo basado en la flotabilidad se describe anteriormente. En primer lugar, este ensayo es extremadamente rápido. Prueba de un gradiente de concentración completa tarda no más de 30 – 60 min. Esta es una gran mejora en la mayoría de las técnicas actualmente en uso. Por ejempl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.

Materials

Bacto Agar VWR 214030
Welch's Original 100% Grape Juice
Sucrose Fisher S512
Tegosept Genesee Scientific 20-259
Ethanol 200 proof
Baker's yeast Fleichmann's
Yellow Corn Meal Quaker Enriched degerminated
Drosophila Agar Type II Apex 66-104
Soy Flour ADM Specialty Ingredients 062-100
Malt Extract Breiss 5748
Light Corn Syrup Karo
Propionic Acid VWR U330-09
Sodium chloride Fisher 50147491
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655-100G
Sodium phosphate anhydrous Fisher S3933
Potassium chloride Fisher P330-500
35 x 10mm petri plate Fisher 08-757-100A
50mL Conical Fisher 50-869-569

References

  1. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  2. Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development. Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).
  3. Ruden, D. M., Lu, X. Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics. Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).
  4. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circ. Res. 109, 794-806 (2011).
  5. Trinh, I., Boulianne, G. L. Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila. Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).
  6. Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus. Lipids Health Dis. 13, 71 (2014).
  7. Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models. Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).
  8. Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay. PLoS One. 6 (9), e23796 (2011).
  9. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68, 105-115 (2014).
  10. Al-Anzi, B., Zinn, K. Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila. PLoS One. 5 (8), e12353 (2010).
  11. Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry. J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).
  12. Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).
  13. Shui, G., et al. Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics. Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).
  14. Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia. Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).
  15. Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).
  16. Mosher, J., et al. Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat. Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).
  17. Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability. PLoS Genet. 6 (11), e1001206 (2010).
  18. Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism. Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).
  19. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).

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Cite This Article
Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e54744, doi:10.3791/54744 (2016).

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