A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är en kraftfull teknik för att studera diffusion av molekyler inom biologiska membran med hög spatial och temporal upplösning. FCS kan kvantifiera den molekylära koncentrationen och diffusionskoefficienten av fluorescensmärkta molekyler i cellmembranet. Denna teknik har förmågan att utforska de molekylära diffusionsegenskaper av molekyler i plasmamembranet av immunceller i stationärt tillstånd (det vill säga, utan processer som påverkar resultatet under själva mättid). FCS är lämplig för att studera diffusion av proteiner som uttrycks på nivåer som är typiska för de flesta endogena proteiner. Här är en enkel och robust metod för att bestämma diffusionshastigheten av cellmembranproteiner på primära lymfocyter påvisats. Ett effektivt sätt att utföra mätningar på antikropps färgade levande celler och vanligt förekommande observationer efter förvärvet beskrivs. De senaste framstegeni utvecklingen av fotostabila fluorescerande färgämnen kan utnyttjas genom att konjugera antikropparna av intresse till lämpliga färgämnen som inte bleka utför under mätningarna. Dessutom möjliggör detta för påvisande av långsamt diffunderande enheter, vilket är en vanlig egenskap hos proteiner som uttrycks i cellmembran. Förfarandet analys för att extrahera koncentrations- och spridningsparametrar molekyl från de genererade autokorrelationskurvorna är markerat. Sammanfattningsvis är en grundläggande protokollet för FCS mätningar tillhandahålls, det kan följas av immunologer med en förståelse för konfokalmikroskopi men med någon annan tidigare erfarenhet av metoder för att mäta dynamiska parametrar, såsom molekylär diffusion priser.
Många immunceller funktioner är beroende av molekylär diffusion och interaktioner inom membran. Biologiska membran är komplexa, och många faktorer som kan vara viktiga för funktionen av immunceller kan påverka hastigheten på translationell diffusion av proteiner inom cellulära membran 1. Vi visade nyligen att naturliga mördarceller (NK), lymfocyter som tillhör det medfödda immunförsvaret, uppvisar differentiell diffusion av två studerade proteiner på cellmembranet beroende på tillståndet hos NK-cellsaktivering 2.
Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är en teknik som är i stånd att kvantifiera molekylär diffusion priser inom biologiska membran. Den rapporterar den genomsnittliga diffusionshastigheten för fluorescensmärkt molekyler i en fixerad volym, typiskt i fokus för ett konfokalt mikroskop. Den är baserad på mätning av fluktuationer i fluorescens som uppstår på molekylär rörelse iett system i stabilt tillstånd. FCS har använts i stor utsträckning för att studera spridningen av fluorescerande färgämnen och proteiner, både i lösning och i lipidmembran. Andra utgångsparametrar som påverkar diffusionshastigheten kan också indirekt studeras på detta sätt (t.ex., konformationsändringar i proteiner eller interaktioner av molekyler på cellmembran) 3, 4. FCS står ut i förhållande till andra tekniker på grund av dess höga känslighet, vilket gör att möjligheten till enda molekyl detektering. Det fungerar bra för molekylära koncentrationer i nanomolar till millimolar intervall, vilket är typiskt för endogena expressionsnivåer av de flesta proteiner 5. Dessutom kan FCS ge en approximation av det absoluta antalet proteiner i den studerade volymen, medan de flesta andra tekniker ger endast relativ information om proteinuttrycksnivåer. Andra metoder för att mäta molekylär diffusion priser inom membran innefattar fluometoder rescence återhämtning efter fotoblekning (FRAP), enda partikel spårning (SPT), flertal hål FCS och bildkorrelations. FRAP och bildkorrelationsmetoder är ensembletekniker, som i allmänhet inte ger information om det absoluta antalet molekyler 10. Jämfört med SPT, är genomströmningen av FCS högre i fråga om karakterisering av befolkningsgenomsnittet. Analysen är också mindre krävande eftersom den genomsnittliga diffusionshastigheten för de molekyler som är närvarande i den laserfokus mäts, snarare än graden av enskilda molekyler. Dessutom, om inte särskilda mikroskop finns 11, SPT kan inte ge någon information om koncentrationer, eftersom standard SPT märkningen måste vara mycket låg för att möjliggöra identifiering av enskilda molekyler. Å andra sidan, kräver FCS de molekyler under studie för att vara mobila. Det kommer helt enkelt inte upptäcka några förmodade orörliga fraktioner eller molekyler som rör sig mycket långsamt. Diffusionshastigheten för molekyler somuppehålla sig inom fokus längre än ungefär en tiondel av förvärvstiden inte vara korrekt representerade i FCS mätningar 3, 12. Därför diffusionskoefficienter registrerats av FCS tenderar att vara snabbare än diffusion som rapporterats från tekniker som FRAP och SPT, där nära till orörliga och mycket långsamma fraktioner beaktas också. SPT kommer också att ge en mer detaljerad beskrivning av variationen i diffusionshastigheter inom molekylär befolkningen än FCS kommer.
FCS kvantifierar fluktuationer i fluorescensintensiteten över tiden inom upphetsad volym. I fallet med membran mätningar, översätter detta till det belysta området av membranet. I detta dokument använder vi det faktum att sådana variationer induceras av molekyler som uppvisar Brownsk diffusion och därmed flyttar in och ut ur exciteringsvolymen. Det finns också flera andra möjliga källor för fluctuationer i fluorescenssignalen, såsom blinkande eller närvaron av en triplett tillstånd i fluoroforer, miljöeffekter, bindnings ej bindande av liganden, eller förflyttning av hela cellmembranet. Dessa förmodade felkällor måste beaktas när man utformar en FCS experiment för att korrekt tolka resultaten 12, 13. Typiskt, lateral diffusion priser i biologiska membran är låga på grund av trängsel och interaktioner, både mellan membranproteiner och mellan proteiner och cytoskelettet. Historiskt sett har användningen av FCS i membran därmed hämmats av brist på fotostabila fluoroforer, som krävs för att undvika blekning under de förlängda transittider genom excitation fokus 14. Men i dag, det finns gott om alternativ för lämpliga fotostabila färgämnen. Betydande förbättringar i detektorer och annan hårdvara gör det också möjligt att upptäcka fluorescerande proteins och färgämnen med lägre ljusstyrka. Här, en grundläggande protokollet för tillämpning av FCS med användning av murina primära lymfocyter, där proteinet av intresse är märkt med en fluorescensmärkta antikroppen, beskrivs. Ett tillvägagångssätt för att passa autokorrelationskurvor för att extrahera diffusionskoefficienten och molekyldensiteten visas också. Protokollet syftar till att lätt följt av immunologer med ingen tidigare erfarenhet av tekniker för att studera spridningen av molekyler. Emellertid är en grundläggande förståelse för konfokalmikroskopi förväntas (för att få denna grundläggande förståelse, se referens 15). Detta protokoll kan relativt lätt anpassas till andra suspensionsceller, både cellinjer och primära celler. För mer erfarna FCS användare, finns mer förfinade analysmetoder, av vilka några beskrivs i diskussionen.
Detta protokoll för FCS kan användas för bedömningen av de molekylära dynamiken i ytmolekyler på alla typer av immunceller (murin, human eller andra arter). FCS mäter spatio-temporala molekyldynamik ner till enda molekyl upplösning i levande celler. Den molekylära densitet, liksom diffusionshastigheten och klusterdynamik av proteinerna av intresse, kan extraheras från autokorrelationskurvor.
Den fluorescerande märkningen är av central betydelse för framgångsrika FCS experiment….
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Vladana Vukojeviç, Centrum för molekylär medicin, Karolinska Institutet för underhåll av Zeiss Confocor tre instrument och användbara tips om mätningar cell. Denna studie har finansierats genom anslag från Vetenskapsrådet (licensnummer 2012- 1629), Magnus Bergvalls stiftelse, och från Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
Clone JR9.318 | |||
Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
Clone 34.5.8S | |||
MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |