Molekylær diffusjon i plasmamembraner Primære lymfocytter målt ved fluorescens korrelasjon spektroskopi

Summary

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Abstract

Fluorescens korrelasjonsspektroskopi (FCS) er en kraftfull teknikk for å studere diffusjonen av molekyler i biologiske membraner med høy romlig og tidsmessig oppløsning. FCS kan kvantifisere den molekylære konsentrasjon og diffusjonskoeffisienten av fluorescensmerkede molekyler i cellemembranen. Denne teknikken har evnen til å utforske de molekylære diffusjon egenskapene til molekylene i plasmamembranen av immunceller i stabil tilstand (dvs. uten prosesser som påvirker resultatet under den egentlige måletiden). FCS er egnet for å studere diffusjon av proteiner som er uttrykt på nivåer som er typisk for de fleste endogene proteiner. Her blir en enkel og robust metode for å fastslå diffusjonshastigheten av cellemembranproteiner på primære lymfocytter demonstrert. En effektiv måte å utføre målinger på antistoff-farget levende celler og vanlig forekommende observasjoner etter kjøpet er beskrevet. De siste fremskritti utviklingen av fotostabile fluorescerende fargestoffer kan benyttes ved å konjugere antistoffene av interesse til passende fargestoffer som ikke blekemiddel i stor utstrekning under målingene. I tillegg gir dette for påvisning av langsomt diffundere enheter, noe som er et vanlig trekk av proteiner uttrykt i cellemembraner. Analysen prosedyre for å trekke molekylære konsentrasjon og diffusjon parametere fra de genererte autokorrelasjonskurver er uthevet. Oppsummert er en grunnleggende protokollen for FCS målinger gitt; det kan etterfølges av immunologer med en forståelse av konfokal mikroskopi, men uten annen tidligere erfaring med teknikker for måling av dynamiske parametre, så som molekylære diffusjon priser.

Introduction

Mange immunceller funksjoner er avhengige av molekylær diffusjon og samhandling innenfor membraner. Biologiske membraner er komplekse, og mange faktorer som kan være viktige for funksjonen av immunceller kan påvirke hastigheten på translasjonsforskning diffusjon av proteiner i cellemembraner ^1. Vi har nylig vist at natural killer (NK) celler, lymfocytter som tilhører den medfødte immunsystemet, oppviser differensial diffusjon av to undersøkte proteiner i cellemembranen, avhengig av tilstanden til NK-celleaktivering ^2.

Fluorescens korrelasjonsspektroskopi (FCS) er en teknikk som er i stand til å kvantifisere molekylære diffusjon priser innenfor biologiske membraner. Det melder den gjennomsnittlige diffusjon av fluorescensmerkede molekyler i en fast volum, typisk i fokus i en konfokal mikroskop. Den er basert på måling av svingningene i fluorescens som oppstår ved molekylær bevegelse iet system i stabil tilstand. FCS har blitt mye brukt for å studere diffusjon av fluorescerende fargestoffer og proteiner, både i løsning og i lipidmembraner. Andre utgang parametere som påvirker spredningen Frekvensen kan også indirekte studert på denne måten (f.eks konformasjonsendringer av proteiner eller interaksjoner av molekyler på cellemembraner) ^{3, 4.} FCS skiller seg ut i forhold til andre teknikker på grunn av sin høye følsomhet og gi mulighet for enkelt-molekyl deteksjon. Det fungerer godt for molekylære konsentrasjoner i nanomolar til millimolar rekkevidde, noe som er typisk for endogene ekspresjonsnivåer av de fleste proteiner ^5. Videre kan FCS gi en tilnærming av det absolutte antall proteiner i den undersøkte volum, mens de fleste andre teknikker bare gi relativ informasjon om protein ekspresjonsnivåer. Andre metoder for å måle molekylære diffusjon priser innen membraner inkluderer fluorescence utvinning etter fotobleking (FRAP), enkelt partikkel sporing (SPT), multippel pinhole FCS, og bildekorrelasjonsmetoder. FRAP og bilde korrelasjonsmetoder ensemble teknikker, som vanligvis ikke gir informasjon om det absolutte antallet molekyler ^10. Sammenlignet med SPT, gjennomstrømningen av FCS er høyere når det gjelder å karakterisere populasjonen gjennomsnittet. Analysen er også mindre krevende ettersom den gjennomsnittlige diffusjonshastigheten av molekylene som er tilstede i laserfokus er målt, snarere enn frekvensen av enkle molekyler. Også, med mindre spesialiserte mikroskoper er tilgjengelige ^11, SPT kan ikke gi noen informasjon om konsentrasjoner, ettersom standard SPT merking må være meget lav for å tillate identifisering av enkle molekyler. På den annen side krever FCS molekylene som studeres for å være mobil. Det vil rett og slett ikke merker noen antatte immobile fraksjoner eller molekyler beveger seg svært sakte. Diffusjonshastigheten av molekyler somligge innenfor fokus lenger enn omtrent en tiendedel av oppkjøpet tid vil ikke være riktig representert i FCS målinger ^{3, 12.} Derfor Diffusjonskoeffisientene registrert av FCS pleier å være raskere enn diffusjon priser rapportert fra teknikker som FRAP og SPT, hvor nær-til-immobile og svært langsomme fraksjoner blir tatt hensyn til også. SPT vil også gi en mer detaljert beskrivelse av variasjonen av diffusjon priser innen molekylær befolkningen enn FCS vil.

FCS kvantifiserer svingning av fluorescens intensitet over tid innenfor spent volum. I tilfelle av membran målinger, oversetter dette til det belyste området av membranen. I denne artikkelen, benytter vi det faktum at slike svingninger blir indusert av molekyler som utviser Brownsk diffusjon og således beveger seg inn og ut av eksitasjon volum. Det finnes også flere andre mulige kilder for fluctuasjoner i fluorescens-signalet, slik som blinker eller nærvær av en triplett tilstand i fluoroforer, miljøskadelige virkninger, binding-uforpliktende av liganden, eller bevegelse av hele cellemembran. Disse antatte feilkilder som må tas i betraktning ved utformingen av en FCS eksperiment for å nøyaktig tolke resultatene ^{12, 13.} Vanligvis lateral diffusjon priser i biologiske membraner er lav på grunn av trengsel og samhandling, både mellom membran proteiner og mellom proteiner og cytoskjelettet. Historisk sett har bruken av FCS i membraner således vært hemmet av mangel på fotostabile fluoroforer, som er nødvendig for å unngå bleking i løpet av den utvidede transittider gjennom fokus eksitasjon ^14. Men i dag, er det nok av muligheter for egnede foto stabil fargestoffer. Betydelige forbedringer i detektorer og annen maskinvare også tillate påvisning av fluorescerende beskyttins og fargestoffer av lavere lysstyrke. Her, et grunnleggende protokollen for anvendelse av FCS ved hjelp av murine primære lymfocytter, hvor proteinet av interesse er merket med et fluorescent merket antistoff, er beskrevet. En tilnærming for å passe til autokorrelasjonskurver for å ekstrahere diffusjonskoeffisienten og molekyltettheten er også vist. Protokollen tar sikte på å være lett fulgt av immunologer med ingen tidligere erfaring med teknikker for å studere diffusjon av molekyler. Det er imidlertid en grunnleggende forståelse av konfokalmikroskopi forventet (for å få denne grunnleggende forståelse, se referanse ^15). Denne protokollen kan forholdsvis lett tilpasses andre suspensjonsceller, begge cellelinjer og primære celler. For mer erfarne FCS brukere, finnes mer raffinerte analysemetoder, hvorav noen er beskrevet i diskusjonen.

Protocol

1. Farging for FCS Isoler murine NK-celler fra milt lymfocytter ved hjelp av magnetiske kuler merking, som per produsentens protokoll 16. Bruk 2-3 x 10 5 celler per prøve for de neste trinnene. MERK: Bruk negativ seleksjon for å berike målcellen befolkningen, slik det urørt, slik at cellene kan merkes ved hjelp av primære antistoffer alene. Se referanse 2 for mer detaljert informasjon om celle isolert fra mus 2. </l…

Representative Results

Et typisk resultat vil generere en autokorrelasjonskurve med en transittiden i området fra 10 ms til 400 ms for membranproteiner. Antallet molekyler som kan variere mellom 0,5 til omkring 200 mikrometer pr 2 for endogent uttrykte proteiner. Sjekk nøye at CPM ikke er lavere enn forventet. Dette kan bety at det er en påvirkning av bakgrunnssignalet. Som en tommelfingerregel bør CPM signal på celler som er akseptert for analyse ikke være lavere enn 33% av CPM for fritt spre…

Discussion

Denne protokollen for FCS kan anvendes for vurdering av de molekylære dynamikk overflatemolekyler på alle typer av immunceller (murin, human, eller andre arter). FCS tiltak rom-tid-molekyldynamikk ned til single-molekyl oppløsning i levende celler. Molekyl tetthet, så vel som diffusjonshastigheten og clustering dynamikken i proteiner av interesse, kan utvinnes fra autokorrelasjonskurver.

Den fluorescerende merking er av sentral betydning for vellykkede FCS eksperimenter. Proteiner av int…

Materials

MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma-Adlrich	F7524	Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline	–	–	Made in house
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparent medium
Antibody clone 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody			Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody	BD Pharmingen	558915	Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride	Sigma-Aldrich	432202	Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20
Confocal microscope	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 wells, 1.0 borosilicate bottom