Abstract
Gastrulation er det første settet med morfologisk dynamiske hendelser som inntreffer i løpet av den embryoniske utviklingen av flercellede dyr som Drosophila. Dette morfologisk endring er også anerkjent som epitelial til mesenchymale overgang (EMT). Feilregulering av EMT er forbundet med fibrose og kreft metastasering. Det er voksende bevis for at EMT styres av et antall av molekylære mekanismer. Som sådan, mange viktige gener som styrer apikale innsnevring er også kjent for å være viktige faktorer i EMT observert i kreftmetastaser. Som EMT under Drosophila gastrulation kan epitelceller bli overtalt til å endre sin form og omprogrammeres til å omdirigere celle skjebne mot ulike andre celletyper. Her gir vi en robust avbildningsmetode Drosophila gastrulation å analysere igangsetting av morfogenetiske cellulære bevegelser og celle skjebne identifikasjon i denne fasen av fosterutviklingen. Ved hjelp av denne metoden, identifiserer vi cell omleiring ved gastrulation og vise betydningen av sammensnøring apikale under gastrulation ved hjelp av GFP-merket DE-cadherin.
Introduction
Gastrulation er det første settet med morfologisk dynamiske hendelser som oppstår under embryonal utvikling av flercellede dyr som Drosophila 1,2. Interessant, nye bevis tyder på at denne prosessen er regulert gjennom samspillet mellom mekaniske og molekylære mekanismer 3. Videre er epiteliale til mesenchymal overgang (EMT), som er en viktig prosess i gastrulation, også implisert i humane sykdomsprosesser slik som cancer metastase 4-8. Som sådan, mange gener som styrer apikale innsnevring er også kjent for å være nøkkelfaktorer i EMT observert i kreftmetastaser 9. Således apikale innsnevring ved tidspunktet for gastrulation er en utmerket modell for å undersøke de nevnte regulatoriske mekanismer, og for å forbedre forståelsen av kreftmetastaser. Fordelen med denne teknikken er at vi kan observere celle bevegelse ved tidspunktet for gastrulation i sann tid, og derfor vil vi blii stand til å screene gener som er involvert i gastrulation, så vel som kreft metastasering.
Selv om relativt ukjent, celle-til-celle adhesjon tenkt å spille en sentral rolle i apikale innsnevring en. Drosophila genetikk er godt egnet for enkelt celle nivå undersøkelser som utforsker regulatoriske molekylære mekanismer. Denne modellen vil gjøre oss i stand til å avdekke betydningen av apikale innsnevring under gastrulation. Videre kan denne fremgangsmåte brukes til å screene gener som er involvert i cancer metastase. Fange levende bilder av Drosophila gastrulation har videre gjort oss i stand til å forstå mer i detalj de molekylære mekanismer som styrer vev omorganisering. Heri, tilbyr vi en omfattende beskrivelse av en enkel metode for å oppnå dette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: transgene fluer brukt i denne studien omfatter følgende: DE-cad :: GFP 10.
1. Utarbeidelse av Apple Plate
- Lag en blanding av 12,5 g agar, 125 ml 100% kommersielt tilgjengelig eplejuice, 12,5 g glukose, og 375 ml H 2 O. Varm opp blandingen i en mikrobølgeovn og hell den i en 3 cm cellekultur parabolen. Lagre blandingen ved 4 ° C for fremtidig bruk.
- Etter å forberede eple plate, legge et tynt lag med eltet gjær lim på toppen av det å la fluene til å legge egg.
2. Embryo Forberedelse og Live Imaging Protocol
- Plasser ca 50 fluer (25 menn og 25 kvinner) i en flaske for å parre seg, og deretter legge egg over natten på et eple plate dekket i knas gjær. Innstill eplejuice platen ved munningen av flasken. Hold flasken opp ned i en inkubator. Pakk plast Drosophila lager flasker med aluminiumsfolie for å be the fluer å legge flere egg.
- Neste morgen, erstatte den gamle eplejuice plate med en ny.
- La fluene legge egg for 3 til 4 timer ved å pakke flasken med aluminiumsfolie.
- Tre til fire timer senere, samle embryoene i et embryo sil fra eplejuice plate ved hjelp av en børste eller bomull dårlig og vask dem med PBS. Vask til embryoene 2 til 3 ganger med PBS i 12-brønners kulturskåler.
- Dechorionate embryoene med 50% blekemiddel i 5 min i 12-brønners kulturskåler.
- Ved å følge fremgangsmåten dechorionation, vaske embryoene 2 til 3 ganger med PBS.
- Overfør embryoene til et 3 cm cellekultur parabolen inneholder PBS og velg scenen 5 embryoer under mikroskop basert på graden av åpenhet i sine grenser. Pipetter de iscenesatte embryo ved hjelp av en 200 mL pipette tips.
- Deretter plasserer to valgte embryo på et dekkglass, og fjerne overflødig PBS med fint vridd silkepapir. Orienter embryoene dorsal siden opp pådekkglass ved hjelp av et fint, tvunnet silkepapir. Etter det, feste embryoene til dekkglass med silikonfett ved hjelp av en tynn nål og papir vridd vev.
- Legg en liten dråpe halocarbon olje 700 på embryoene og plassere dekkglass som inneholder embryoene opp ned på innrykket lysbilde, etterlot noen plass i bunnen av raset.
- Undersøke embryoene ved hjelp av et konfokalt avbildningssystem, en Argon / 488 laser, og en olje-neddykking objektiv (63X).
MERK: Identifisere embryo på riktig utviklingsstadiet er viktig å ta bilder av den gastrulation hendelsen. Under disse betingelsene observerer nesten alle embryoer utvikler seg normalt opp til minst scenen 14. analysert embryo kan dyrkes videre for å utvikle seg som en voksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi de gastrulation hendelsene i Drosophila embryo og en generell oversikt over embryoet forberedelse prosedyre (figur 1). Cellemembraner merkes ved bruk av DE-cadherin :: GFP og levende avbildning av celle bevegelser utføres samtidig med gastrulation i Drosophila (figur 2). Siden DE-cadherin GFP fluer tillate oss å visualisere celle etterlevelse veikryss, er vi i stand til å spore apikale cellen form og bevegelser ved hjelp av dette systemet. Enda viktigere, kan dette systemet også oss å spore endogene DE-cadherin uttrykk mønstre.
Figur 1: Generell Oversikt over Embryo fremstillingsprosedyre. A) Sett opp fluer for egglegging. B) Samle embryoer og plassere dem i et embryo sil. C) Etter vasking embryoene med PBS, dechorionate dem umiddelbart. D) Overfør embryoene til et 3 cm cellekultur rett med PBS. E) Pipet embryoene som er på riktig utviklingsstadiet og plassere dem på et dekkglass. F) Fest embryoene til dekk bruker vakuum fett. G) Deretter tilsettes en dråpe halokarbon olje på dekkglass. H) til slutt plassere dekk opp ned på innrykket lysbildet. Embryoene er nå klar for time-lapse imaging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Resultat av en eksperimentell prosedyre utnytte DE-cad :: GFP-basert live Imaging Under gastrulation. Cellemembranene ble merket ved hjelp av DE-cadherin ::GFP og levende avbildning av celle bevegelse ble deretter tatt for ca 500 s under gastrulation av Drosophila. Apikale celle utkant ble visualisert ved hjelp av GFP fluorescens av DE-Cad for å spore apikale deler av individuelle celler ved hjelp av et representativt sett av tid-lapse bilder; Scale bar = 20 mikrometer. Pilene viser hvor apikale innsnevring og invagination oppstår. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3 (2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
