Abstract
Gastrulation est le premier ensemble d'événements morphologiquement dynamiques qui se produisent pendant le développement embryonnaire des animaux pluricellulaires tels que la drosophile. Cette altération morphologique est également reconnu comme transition épithélio mésenchymateuse (EMT). Dysrégulation de EMT est associée à la fibrose et les métastases du cancer. Il existe des preuves émergentes que EMT est contrôlé par un certain nombre de mécanismes moléculaires. En tant que tels, de nombreux gènes clés qui contrôlent la constriction apicale sont également connus pour être des facteurs importants dans l'OGD observée dans les métastases du cancer. Comme EMT pendant la drosophile gastrulation, les cellules épithéliales peuvent être amenés à changer leur forme et être reprogrammées pour rediriger le destin des cellules vers d'autres types de cellules. Ici , nous fournissons une méthode d'imagerie robuste de Drosophila gastrulation pour doser l'initiation des mouvements cellulaires morphogénétiques et l' identification du destin cellulaire au cours de ce stade de développement embryonnaire. En utilisant cette méthode, nous identifions cell réarrangement au moment de la gastrulation et de démontrer l'importance de la constriction apicale pendant la gastrulation utilisant GFP marquées DE-cadhérine.
Introduction
Gastrulation est le premier ensemble d'événements morphologiquement dynamiques qui se produisent au cours du développement embryonnaire des animaux pluricellulaires tels que la drosophile 1,2. Il est intéressant de nouvelles preuves suggèrent que ce processus est régi par l'interaction entre les mécanismes mécaniques et moléculaires 3. En outre, la transition épithélio - mésenchymateuse (EMT), qui est un processus crucial dans la gastrulation, est également impliquée dans des processus pathologiques humains tels que les métastases du cancer 8/4. En tant que tels, de nombreux gènes qui contrôlent la constriction apicale sont également connus pour être des facteurs clés dans l'OGD observée dans les métastases du cancer 9. Ainsi, constriction apicale au moment de la gastrulation est un excellent modèle pour étudier les mécanismes de régulation précités et d'améliorer notre compréhension des métastases du cancer. L'avantage de cette technique est que nous pouvons observer le mouvement des cellules au moment de la gastrulation en temps réel et, par conséquent, nous seronsen mesure de dépister les gènes impliqués dans la gastrulation, ainsi que les métastases du cancer.
Bien que relativement inconnu, l' adhésion de cellule à cellule est pensé pour jouer un rôle central dans la constriction apicale 1. Génétique de la Drosophile est bien adapté pour les enquêtes individuelles au niveau cellulaire explorant les mécanismes moléculaires de régulation. Ce modèle nous permettra de découvrir l'importance de la constriction apicale pendant la gastrulation. En outre, cette méthode peut être utilisée pour cribler des gènes impliqués dans la métastase du cancer. Capture d' images en direct de la drosophile gastrulation nous a en outre permis de comprendre plus en détail les mécanismes moléculaires qui régissent le réarrangement des tissus. Ici, nous fournissons une description complète d'une méthode simple pour y parvenir.
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Protocol
NOTE: Les mouches transgéniques utilisées dans cette étude sont les suivants: DE-cad :: GFP 10.
1. Préparation d'Apple Plate
- Préparer un mélange de 12,5 g d' agar, 125 mL 100% disponible dans le commerce de jus de pomme, 12,5 g de glucose et 375 ml H 2 O. Chauffer le mélange dans un micro - ondes et versez - le dans une boîte de culture de cellules de 3 cm. Stocker le mélange à 4 ° C pour une utilisation future.
- Après la préparation de la plaque de pomme, ajouter une fine couche de pâte malaxée de levure au-dessus de celui-ci pour permettre aux mouches de jeter l'œuf.
2. Embryon Préparation et direct Protocole d'imagerie
- Placez environ 50 mouches (25 mâles et 25 femelles) dans une bouteille pour accoupler et ensuite pondre des œufs durant la nuit sur une plaque de pomme couverte dans la levure malaxée. Placer la plaque de jus de pomme à l'embouchure de la bouteille. Gardez la bouteille à l'envers dans un incubateur. Envelopper les bouteilles en plastique Drosophila d'actions avec une feuille d'aluminium pour inciter ee vole à pondre plus d'œufs.
- Le lendemain matin, remplacer l'ancienne plaque de jus de pomme avec un nouveau.
- Que les mouches pondent des œufs pendant 3 à 4 h en enveloppant la bouteille avec du papier d'aluminium.
- Trois à quatre heures plus tard, de recueillir les embryons dans une passoire à l'embryon de la plaque de jus de pomme à l'aide d'une brosse ou de coton mauvais et les laver avec du PBS. Laver les embryons de 2 à 3 fois plus avec PBS dans des boîtes de culture de 12 puits.
- Dechorionate les embryons avec 50% de javel pendant 5 min dans des boîtes de culture de 12 puits.
- Après le processus de dechorionation, laver les embryons de 2 à 3 fois plus avec PBS.
- Transférer les embryons dans une boîte de culture cellulaire 3 cm contenant du PBS et sélectionnez l'étape 5 embryons au microscope sur la base du niveau de transparence à leurs frontières. Pipeter les embryons mis en scène à l'aide d'une pipette de 200 pi.
- Ensuite, placez deux embryons sélectionnés sur une lamelle de verre, et éliminer l'excès de PBS avec du papier de soie finement torsadée. Orientez les embryons côté dorsal surla lamelle en utilisant un papier de soie finement torsadée. Après cela, fixer les embryons à la lamelle de verre avec de la graisse de silicium en utilisant une aiguille fine et du papier de soie torsadée.
- Ajouter une petite goutte d'huile d'halocarbures 700 sur les embryons et placer la lamelle contenant les embryons à l'envers sur la lame dentelée, en laissant un peu d'espace au bas de la diapositive.
- Examiner les embryons en utilisant un système d'imagerie confocale, une Argon / 488 laser, et un objectif à immersion (63X).
NOTE: Identification de l'embryon au stade de développement approprié est important de capturer des images de l'événement gastrulation. Dans ces conditions, observent presque tous les embryons se développent normalement au moins jusqu'à l'étape 14. L'embryon analysé peut être cultivé à développer davantage comme un adulte.
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Representative Results
Ici, nous montrons les événements gastrulation de l'embryon de drosophile et un aperçu général de la procédure de préparation de l' embryon (Figure 1). Les membranes cellulaires sont marquées en utilisant le document DE-cadhérine :: GFP et l' imagerie en temps réel des mouvements de cellules est effectuée au moment de la gastrulation chez la drosophile (figure 2). Depuis DE-cadhérine GFP mouches nous permettent de visualiser les jonctions d'adhérence cellulaire, nous sommes en mesure de retracer la forme et les mouvements à l'aide de ce système cellulaire apical. Plus important encore, ce système permet également de retracer les modèles endogènes d'expression DE-cadhérine.
Figure 1: Vue d' ensemble générale de l'embryon Procédure de préparation. A) Mettre en place des mouches pour la ponte. B) Recueillir les embryons et les placer dans une passoire à l' embryon. C) Après lavagetion des embryons avec du PBS, dechorionate immédiatement. D) Transférer les embryons dans une boîte de culture cellulaire de 3 cm en utilisant PBS. E) Pipet les embryons qui sont au stade de développement correct et les placer sur une lamelle. F) Fixer les embryons à la lamelle à l' aide de graisse à vide. G) Ensuite , ajoutez une goutte d'huile d'halocarbures sur la lamelle. H) placer Enfin la lamelle à l' envers sur la lame dentelée. Les embryons sont maintenant prêts pour l'imagerie time-lapse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Le résultat d'une procédure expérimentale utilisant DE-cad :: base GFP-imagerie en direct Pendant Gastrulation. Les membranes cellulaires ont été marquées à l'aide DE-cadhérine ::GFP et l' imagerie en direct du mouvement cellulaire a ensuite été capturé pendant environ 500 s pendant la gastrulation de la drosophile. périmètres de cellules apicales ont été visualisées en utilisant la fluorescence de la GFP de DE-Cad afin de tracer les zones apicales des cellules individuelles à l'aide d'un ensemble représentatif d'images en accéléré; Barre d'échelle = 20 pm. Les flèches indiquent où apical constriction et invagination se produisent. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
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