Imaging Cell Shape Ändring och cellrörelse i<em> Drosophila</em> gastrulation Använda DE-cadherin Reporter Transgena Flugor

Summary

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Abstract

Gastrulation är den första uppsättningen av morfologiskt dynamiska händelser som inträffar under den embryonala utvecklingen av flercelliga djur såsom Drosophila. Denna morfologiska förändring är också erkänt som epitelceller till mesenkymala övergång (EMT). Dysreglering av EMT förknippas med fibros och cancermetastaser. Det finns växande bevis för att EMT styrs av ett antal molekylära mekanismer. Som sådan, många viktiga gener som styr apikala sammandragning är också kända för att vara viktiga faktorer i EMT observerats i cancermetastaser. Liknande EMT under Drosophila gastrulation, kan epitelceller induceras att ändra sin form och omprogrammeras för att omdirigera cellernas öde mot olika andra celltyper. Här ger vi en robust avbildningsmetod Drosophila gastrulation att analysera inledandet av morfogenetiska cellulära rörelser och cell öde identifiering under detta skede av embryonal utveckling. Med denna metod, vi identifierar cell ombildning vid tiden för gastrulation och visa vikten av apikala sammandragning under gastrulation använder GFP märkt DE-cadherin.

Introduction

Gastrulation är den första uppsättningen av morfologiskt dynamiska händelser som inträffar under embryoutvecklingen av flercelliga djur såsom Drosophila ^1,2. Intressant nya bevis tyder på att denna process regleras genom samspelet mellan mekaniska och molekylära mekanismer ^3. Dessutom är epitelceller till mesenkymala övergång (EMT), vilket är en viktig process i gastrulation, även inblandad i processer mänskliga sjukdomar såsom cancermetastas ^4-8. Som sådan, många gener som styr apikala sammandragning är också kända för att vara viktiga faktorer i EMT observerats i cancermetastaser ^9. Således, apikal förträngning vid gastrulation är en utmärkt modell för att undersöka de ovan nämnda regleringsmekanismer och att öka vår förståelse av cancermetastaser. Fördelen med denna teknik är att vi kan observera cellrörelse vid gastrulation i realtid och därför kommer vi attkunna screena gener involverade i gastrulation liksom cancermetastaser.

Även om relativt okänd, cell-till-cell-adhesion tros spela en central roll i apikala förträngning ^1. Drosophila genetik är väl lämpad för enskilda undersökningar cellnivå utforska molekylära mekanismer reglerings. Denna modell gör det möjligt för oss att avslöja vikten av apikala sammandragning under gastrulation. Dessutom kan denna metod användas för att screena gener involverade i cancermetastas. Fånga levande bilder av Drosophila gastrulation har vidare gjort det möjligt för oss att förstå mer i detalj de molekylära mekanismer som styr vävnads ombildning. Häri ger vi en utförlig beskrivning av en enkel metod för att uppnå detta.

Protocol

OBS: De transgena flugor som används i denna studie inkluderar följande: DE-cad :: GFP 10. 1. Framställning av Apple Plate Förbereda en blandning av 12,5 g agar, 125 ml 100% kommersiellt tillgänglig äppeljuice, 12,5 g glukos och 375 ml H2O Värm blandningen i en mikrovågsugn och häll det i en 3 cm cellodlingsskål. Lagra blandningen vid 4 ° C för framtida användning. Efter framställning av äppelplattan, lägg ett tunt lager av knådad jäst pasta o…

Representative Results

Här visar vi de gastrulation händelserna i Drosophila embryo och en allmän översikt av förfarandet embryot preparatet (Figur 1). Cellmembranen märks med DE-cadherin :: GFP och levande avbildning av cellrörelser utförs vid gastrulation i Drosophila (figur 2). Eftersom DE-cadherin GFP flugor tillåter oss att visualisera cellvidhäftnings korsningar, har vi möjlighet att spåra apikala cellform och rörelser med hjälp av detta system. Ä…

Discussion

Although we have previously reported a similar procedure to capture live images of the gastrulation process in Drosophilla¹, the method we describe here is detailed and easy to trace endogenous cadherin expression and thus is quite useful for genetic screening of key factors involved in gastrulation. To maximize success with this imaging procedure, it is essential to use an indented slide. Mechanical pressure sometimes causes embryonic death. Therefore, it is also important to handle the embryos as ge…

Materials

Halocarbon oil 700	Sigma	MKBH 5726
Vacuum grease Silicone	Beckman	335148
Glass coverslip	Matsunami glass	Thickness No1	24-36mm
Embryo stariner	Corning	Corning3477
Plastic Drosophilla Stock Bottles	Hitec	MKC-100
DE-Cadherin knock-in flies			REF (10)