Abstract
Mange vigtige biomedicinske applikationer, såsom cell imaging og remote manipulation, der kan opnås ved mærkning af celler med superparamagnetiske jernoxid nanopartikler (SPIONs). At opnå tilstrækkelig cellulær optagelse af SPIONs er en udfordring, der traditionelt har været opfyldt ved at udsætte celler for forhøjede koncentrationer af SPIONs eller ved at forlænge eksponeringstider (op til 72 timer). Men disse strategier sandsynligvis til at mediere toksicitet. Her præsenteres syntesen af protein-baserede Spion magnetoferritin samt en let overfladefunktionalisering protokol, der muliggør hurtig celle magnetisering anvendelse af koncentrationer lave eksponeringsniveauer. Den Spion kerne af magnetoferritin består af cobalt-dopet jernoxid med en gennemsnitlig partikeldiameter på 8,2 nm mineraliseret inden i hulrummet af hestemilt apo-ferritin. Kemisk kationisering af magnetoferritin produceret en hidtil ukendt, stærkt membran-aktive Spion der magnetiseres humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) under anvendelse af inkubationstider somkort som et minut og jern koncentrationer som nedture som 0,2 mM.
Introduction
Surface binding eller internalisering af superparamagnetiske jernoxid nanopartikler (SPIONs) har gjort det muligt magnetisering af en række celletyper til applikationer såsom billedbehandling og remote manipulation. 1 imidlertid at opnå tilstrækkelig cellulær magnetisering kan være en udfordring, især når interaktionen mellem Spion og celleoverfladen er svag. 2 I koncentrationerne sidste, langvarig eksponering eller høj Spion er blevet ansat som strategier til at overvinde denne udfordring. 3,4 desto mindre er disse strategier er problematisk, fordi de øger toksicitet 5,6 og har meget begrænset succes i celletyper med lave internalisering priser, såsom lymfocytter. 7. For at øge cellulære optagelse af SPIONs, har flere overfladefunktionalisering tilgange blevet udforsket. For eksempel er antistoffer blevet anvendt til at fremme receptormedieret endocytose, 8 mens ikke-specifik optagelse kan opnås under anvendelse transfektion agents 9,10 eller celle-penetrerende arter, såsom HIV tat-peptid. 11,12 imidlertid antistof- og peptid funktionalisering tilgange begrænset af dyre reagenser og komplekse syntetisk præparat, mens transfektionsmidler, kan inducere nanopartikel udfældning og påvirke cellefunktion. 13,14
Vi har for nylig rapporteret syntesen af kemisk kationiseret magnetoferritin, en hidtil ukendt Spion som var meget effektivt til magnetisering humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) under anvendelse af inkubationstider så korte som et minut. 15 Magnetoferritin syntetiseres ved rekonstituering af en Spion inde i demineraliseret hulrum i jern opbevaring protein ferritin. 16 Dette protein-baserede Spion kombinerer mange egenskaber, der gør det velegnet til celle magnetisering, såsom kontrol over de magnetiske egenskaber af den magnetiske kerne, 17-19 og biokompatibilitet og vandig opløselighed knyttet til protein shell. Længeremere, er overfladefunktionalisering let opnås på grund af adresserbare aminosyrer, der kan være kemisk 20-22 eller genetisk modificeret. 23-25 Vi har vist, at kemisk kationisering af de sure aminosyrerester i proteinet skallen genererer en stabil nanopartikel, som let interageret med anioniske domæner på celleoverfladen fører til en hurtig og vedvarende celle magnetisering. Denne procedure eliminerer behovet for besværlige funktionalisering og langvarige inkubation protokoller, og på grund af ikke-specifik mekanisme mærkning denne hurtige magnetisering strategi bør finde udbredt anvendelse i andre celletyper. Her præsenteres en grundig rapport af den ultra-hurtig metode mærkning celle, herunder detaljerede protokoller til syntese, oprensning og overfladefunktionalisering af kationiseret magnetoferritin.
Protocol
Humane mesenkymale stamceller (hMSC) blev høstet fra den proksimale femur knoglemarven af osteoarthritis patienter, der gennemgår total hoftealloplastik, i fuld overensstemmelse med Bristol Southmead Hospital videnskabsetisk komité retningslinjer (henvisning # 078/01), og efter patientens samtykke blev opnået.
1. Magnetoferritin Syntese og oprensning
- Generelle bemærkninger
- Udfør magnetoferritin syntese i en forseglelig, dobbelt-kappeklædt reaktionsbeholder ved 65 ° C under nitrogenatmosfære for at begrænse oxidation af metal forstadier. Injicere metal saltopløsninger og hydrogenperoxid gennem adgangsporte i låget i reaktionsbeholderen under anvendelse af en sprøjtepumpe.
- Efter magnetoferritin syntese, oprensning af proteinet ved anionbytterchromatografi (se afsnit 1.4) for at fjerne nanopartikler ikke er omgivet af proteinet hulrum, efterfulgt af gelpermeationschromatografi (se afsnit 1.5) for at isolere protein monomerer. determine proteinkoncentration ved hjælp af en Bradford assay (se afsnit 1.6).
- Forberedelser før syntese
- Deoxygenere 500 ml deioniseret vand ved at placere et rør forbundet til en nitrogengas-cylinder i vandet forsegling af fartøjets med plastfolie og gennembobling nitrogengas i ca. 60 min.
- Opvarm vandbad forbundet til den dobbelte kappe forsynede reaktionsbeholder til 65 ° C. Tilsættes 75 ml 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) puffer (pH 8,6) ind i reaktionsbeholderen, forsegle beholderen og deoxygenere ved at boble nitrogengas gennem pufferopløsningen i ca. 20 min. Samtidig, rør pufferopløsningen under anvendelse af en magnetisk omrører.
- Efter deoxygenering af HEPES-pufferopløsning, fjernes glasset tilførsel af nitrogengas fra bufferen og holde det anbragt i beholderen for at opretholde en nitrogenatmosfære. Tilføj apo-ferritin at opnå en endelig koncentration på 3 mg / ml. Fortsæt magnetisk omrøring, men reducere omrøringshastigheden, hvis skumning forekommer.
- Der fremstilles en 25 mM stamopløsning af kobolt-heptahydrat ved opløsning 0,19 g i 50 ml deoxygeneret deioniseret vand.
- Der fremstilles en 25 mM opløsning af ammonium jernsulfat hexahydrat opløsning ved at opløse 0,98 g i 100 ml deoxygeneret deioniseret vand.
- Fjern 2,5 ml af ammonium jernsulfat hexahydrat opløsning og erstat med 2,5 ml af kobolt-heptahydrat.
- Forbered en 8,33 mM opløsning af hydrogenperoxid i deoxygenerede demineraliseret vand ved først at tilsætte 965 pi af en hydrogenperoxidopløsning (30% vægt / vægt) til 9 ml deoxygeneret deioniseret vand, og derefter tilsætte 1 ml af denne sub-lager til 99 ml deoxygeneret deioniseret vand.
- Magnetoferritin syntese
- Injicer 10.1 ml både jern--cobalt forstadium og hydrogenperoxidet samtidigt i apo-ferritin-opløsning (magnetisk stirred) ved en strømningshastighed på 0,15 ml / min under anvendelse af to sprøjtepumpe (totalvolumen injiceret: 20,2 ml).
- Under injektionen periode, deoxygenere yderligere 500 ml deioniseret vand.
BEMÆRK: Indholdet af reaktionsbeholderen gradvis vedtage en mørk brun farve, efterhånden som reaktionen skrider frem. - Kort før afslutningen af den første injektion, forberede yderligere 100 ml af jern-kobolt forløber og hydrogenperoxid løsning ved hjælp af frisk deoxygenerede deioniseret vand.
- Gentag injektionen trin beskrevet i 1.3.1 under anvendelse af frisk fremstillede opløsninger af jern-cobalt og hydrogenperoxid.
- Under injektionen periode, deoxygenere yderligere 500 ml deioniseret vand, og fortsætte som beskrevet i 1.3.3 og 1.3.4.
- Efter den tredje injektion, forlader løsning til at modnes i 15 min under omrøring.
- Tilsættes 1,5 ml af en 1 M natriumcitratopløsning til reaktionsbeholderen til at chelatere frie metalioner i opløsning.
- Fjern opløsningen fra reaktionenfartøj i 50 ml centrifugerør, centrifuger i 30 minutter ved 4.350 xg og passere supernatanten gennem et 0,22 um sprøjtefilter. På dette stadium kan den filtrerede supernatant opbevares ved 4 ° C indtil oprensning.
- Ionbytningschromatografi
- Indlæse prøven på en søjle (2,5 cm diameter, 20 cm lang) indeholdende en kationisk matrix ved anvendelse af en peristaltisk pumpe ved en strømningshastighed på 10 ml / min.
- Kolonnen udvaskes med ca. 100 ml løbebuffer (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris) puffer, pH 8,0) under anvendelse af en gradient pumpe med en strømningshastighed på 10 ml / min.
- Til eluering af proteinet vaskes søjlen med 10 ml / min med stigende koncentrationer af natriumchlorid (NaCl) i Tris-buffer: 150, 500 og 1.000 mM endelig NaCI-koncentration, 150 ml af hver koncentration.
- Som proteinet eluerer ved en NaCI-koncentration på 500 mM, indsamle det i 50 ml fraktioner anvendelse af en automatiseret fraktionsopsamler.
BEMÆRK: For endetaljeret protokol af ionbytningskromatografi konsultere tidligere offentliggjorte protokoller. 26
- Gelpermeationskromatografi
- Koncentrer de 150 ml magnetoferritin til et volumen på ca. 2 ml ved anvendelse af en 15 ml centrifugalfilterenhed efterfulgt af et 4 ml volumen enhed. Der henvises til producentens anvisninger for de centrifugale filterenheder (se materialeliste) for en detaljeret protokol af denne procedure.
- Indlæse koncentreret prøven på en gelfiltreringssøjle under anvendelse af en injektion loop.
- Kolonnen udvaskes med rindende puffer (50 mM Tris-buffer, pH 8,0, indeholdende 150 mM NaCl) ved en strømningshastighed på 1,3 ml / min.
- Saml 6 ml fraktioner anvendelse af en automatiseret fraktionsopsamler. Protein monomerer elueres sidst. På dette tidspunkt, kan oprenset magnetoferritin opbevares ved 4 ° C indtil kationisering.
BEMÆRK: For en detaljeret protokol af gelpermeationskromatografi ved anvendelse af en gelfiltreringssøjle konsultere previously offentliggjorte protokoller. 27
- Bestemmelse proteinkoncentration
- Forbered ferritin standarder på 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 og 1 mg / ml i 50 mM Tris-buffer under anvendelse af kommercielt tilgængelige hest milt ferritin.
BEMÆRK: protein koncentration af kommercielt tilgængelig ferritin er angivet på flasken. Hvis ikke, skal du kontakte leverandøren for denne information. - Fortynd magnetoferritin prøver af ukendt koncentration i 50 mM Tris-buffer, indtil farven af opløsningen tilnærmelsesvis svarer til farven af 0,5 mg / ml standard. Notér fortyndingsfaktoren.
- Tilsæt 10 pi af hver standard og magnetoferritin prøve i tre eksemplarer i brønde i en plade med 96 brønde.
- Tilsæt 200 pi færdige Bradford reagens til hver brønd (se materialer liste efter Bradford assayreagens detaljer).
- Der inkuberes ved stuetemperatur i 8 minutter.
- Mål absorbansen ved λ = 595 nm ved anvendelse afen mikropladelæser.
- Plotte gennemsnitlige absorbans af de ferritin standarder som en funktion af proteinkoncentration og bruge hældningen og skæringspunktet for lineær tilpasning for at beregne koncentrationen af magnetoferritin prøven.
BEMÆRK: Tag højde fortyndingsfaktoren, der blev brugt til at justere magnetoferritin prøven til standardkurven.
- Forbered ferritin standarder på 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 og 1 mg / ml i 50 mM Tris-buffer under anvendelse af kommercielt tilgængelige hest milt ferritin.
2. Magnetoferritin kationisering
- Generelle bemærkninger
BEMÆRK: magnetoferritin kationisering, N, N-dimethyl-1,3-propandiamin (DMPA) koblet til asparagin- og glutaminsyrerester på MF overflade under anvendelse af N - (3-dimethylaminopropyl) - N '-ethylcarbodiimide hydrochlorid (EDC).- Gennemføre reaktionen ved stuetemperatur under omrøring. Protokollen nedenfor er for kationisering af 10 mg magnetoferritin i et samlet volumen på 5 ml (proteinkoncentration 2 mg / ml). Men skalere op eller nedved at holde det protein: DMPA: EDC forhold konsekvent, samt mængderne af bufferen og magnetoferritin opløsning.
- Forud for kationiseringen reaktionen dialysere magnetoferritin prøver til 50 mM phosphatbuffer (pH 7) indeholdende 50 mM NaCl. Dette er vigtigt at fjerne Tris elueringspuffer og undgå uønskede reaktioner mellem Tris amin og EDC-aktiverede carboxylsyrerester. Bestem protein koncentrationen efter dialyse og tilpasse den til 4 mg / ml før kationisering.
- kationisering protokol
- Der afvejes 374 mg af DMPA og opløses i 2,5 ml 200 mM 2- (N -morpholino) ethansulfonsyre (MES) puffer.
- Indstil opløsningens pH til ca. 7 under anvendelse af koncentreret (6 M) saltsyre (HCI).
ADVARSEL: Udfør dette trin i et stinkskab, som tilsætning af syre til DMPA frigiver giftige dampe! - Tilsættes 2,5 ml magnetoferritin opløsning ved 4 mg / ml (endelig koncenring af MES er 100 mM, slutkoncentration på magnetoferritin er 2 mg / ml, total mængde protein er 10 mg).
- Tilføj en magnetisk omrører og omrør i 2 timer for at ækvilibrere.
- justere omhyggeligt opløsningen til pH 5,0 ved anvendelse af 1 M HCI.
- Tilføj 141 mg EDC pulver til DMPA / magnetoferritin opløsning.
- Fortsæt omrøring i 3,5 timer.
- Opløsningen filtreres gennem et 0,22 um sprøjtefilter til fjernelse af eventuelle præcipitater.
- Tilsæt opløsningen til dialyserør med en 12-14 kDa molekylvægt cut-off og dialyseres mod 4 liter 50 mM phosphatpuffer (pH 7) indeholdende 50 mM NaCl i 2 dage ved 4 ° C, der erstatter dialysebufferen mindst tre gange i denne periode.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan kationiseret magnetoferritin opbevares ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.
3. Menneskelig Mesenchymale Stem Cell Mærkning med kationiseret Magnetoferritin
- Generelle bemærkninger
- Dyrke celler som monolag under anvendelse 175 cm2 kolber og 20 ml næringssubstrat, som var genopfyldes hver 3 - 4 dage. Dyrkningsmedium bestod af Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 1,000 mg / l glucose, 10% (v / v) føtalt bovint serum, 1% (v / v) penicillin / streptomycin-opløsning, 1% (vol / vol) L alanyl-L-glutamin-opløsning og 5 ng / ml frisk suppleret human fibroblastvækstfaktor.
- Magnetisk mærkning af hMSC med kationiseret magnetoferritin
- Seed 150.000 hMSC'er i 25 cm 2 kolber og lad at klæbe natten over ved 37 ° C.
- Filtersteriliser kationiseret magnetoferritin gennem et 0,22 um sprøjtefilter og bestemme proteinkoncentrationen.
- Holde sterile forhold, udarbejde en 0,5 uM løsning af kationiseret magnetoferritin i phosphatbufret saltvand (PBS). Hold udjævnet i en steril kultur hætte indtil brug.
- Vask de udpladede celler med 2 ml stuetemperatur PBS.
- Der tilsættes 1 ml af den steriliserede kationiseret magnetoferritin løsning på de udpladede celler og inkuberes i den ønskede periode (1 min til 1 time).
- Vask cellerne med PBS og derefter høst celler ved tilsætning af 0,5 ml trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og inkubering ved 37 ° C i 5 min.
- Tilsæt 1 ml dyrkningsmedium at inaktivere trypsin / EDTA, opløsningen overføres til en 15 ml centrifugerør og centrifugeres i 5 minutter ved 524 x g.
- Supernatanten fjernes, og resuspender cellepelleten i 0,5 ml magnetisk separation puffer, bestående af 0,5% (vægt / volumen) føtalt bovint serum og 2 mM EDTA i PBS.
- Magnetisk celleseparation
- Fastgør magneten til multi stativ, og tilføje en magnetisk separation kolonne til magneten. Placer en pre-separation filter på the kolonne.
- Anbring 0,5 ml magnetiske separation puffer i før-separation filter og lade det køre gennem både filtret og søjlen til at vaske og våd dem.
- Anbring en 15 ml centrifugerør i kolonnen.
- Tilsæt 0,5 ml af cellesuspensionen i filteret reservoir af den magnetiske separationskolonnen.
- Når reservoiret er tom, tilsættes 0,5 ml af magnetisk adskillelse buffer.
- Når reservoiret er tom, tilsættes yderligere 0,5 ml magnetiske separation puffer.
- Gentag en gang (det samlede volumen af magnetisk separation puffer anvendes til vask bør være 1,5 ml). Dette vasketrin eluerer alle ikke-magnetiseret celler fra søjlen (cellefraktion ikke-magnetiseret).
- Fjern kolonnen fra magneten og læg den i en frisk 15 ml centrifugerør. Fjern filter fra kolonnen reservoir.
- Der tilsættes 1 ml magnetiske separation buffer til reservoiret og skubbe straks gennem søjlen ved hjælp af stemplet leveret af fremstillingenr. Dette eluerer magnetiseret celler fra søjlen i centrifugeglasset (magnetiseret cellefraktion).
- Centrifuge begge rør i 5 minutter ved 524 x g.
- Supernatanten fjernes, og re-suspendere cellepellets i 0,3 ml PBS.
- Tæl antallet af celler numre i hver fraktion ved hjælp af et hæmocytometer.
- Bestemme den del af magnetiserede celler, M (%) ved anvendelse af følgende ligning:
hvor n (M) er antallet af celler i den magnetiserede fraktion og n (M + NM) er summen af antallet af celler i de magnetiserede og ikke-magnetiserede fraktioner.
- Forberedelse hMSC'er mærket med kationiseret magnetoferritin for jern kvantificering hjælp induktivt koblet plasma optisk emission spektroskopi (ICP-OES)
BEMÆRK: Protokollen skal muligvis tilpasses til andre ICP-OES instrumenter. Det er tilrådeligt at rådføre sig med reansvarlig tekniker.- Centrifugeres et kendt antal celler i 5 minutter ved 524 x g.
- Fjern PBS supernatanten, og der tilsættes 0,25 ml 50% (v / v) salpetersyre.
- Vortex blander den forsurede cellesuspension.
- Der inkuberes ved stuetemperatur natten over.
- Tilsættes 4,75 ml destilleret vand til hver prøve og vortex-mix.
- Analyser med ICP-OES. 28
- Normalisere målte jernindhold til antallet af celler for at bestemme en værdi for cellulær jernindhold.
Representative Results
TEM blev anvendt til at bekræfte nanopartikel mineralisering inde i apoferritin hulrum og bestemme den gennemsnitlige størrelse kerne (figur 1A og 1B). Billedanalyse af ufarvede magnetoferritin prøver gav en gennemsnitlig tråddiameter på 8,2 ± 0,7 nm, og aurothioglucose plet bekræftede tilstedeværelsen af nanopartikler i proteinet bur. Bemærk, at billederne viser en magnetoferritin prøve, som blev yderligere oprenset ved anvendelse af magnetisk adskillelse for at isolere ensartede nanopartikel kerner. Magnetoferritin prøver, som blev ikke magnetisk oprenset har en lidt bredere kerne størrelsesfordeling. 29 Analyse af strukturen af magnetoferritin kerne ved brug af udvalgte-område elektron diffraktion indikerede mulige tilstedeværelse af den inverse spinel struktur baseret på magnetit (Fe 3 O 4) og / eller maghemit (γ-Fe 2 O 3), samt spinel struktur grundet Co 3 4. Endvidere Raman spektre afslørede toppe tilskrives Fe 3 O 4, små mængder af γ-Fe 2 O 3, og en cobalt-ferrit (Figur 1 C). ICP-OES analyse af magnetoferritin viste et gennemsnit på 102 ug jern og 0,9 ug kobolt pr milligram magnetoferritin.
En skematisk er inkluderet, hvilket illustrerer den efterfølgende kationisering trin (figur 2 A). Den hydrodynamiske diameter magnetoferritin og kationiseret magnetoferritin var 11,8 ± 1,1 nm og 12,5 ± 1,4 nm, som bestemt ved dynamisk lysspredning. Den kationiseringen effektivitet kovalent DMPA-kobling til magnetoferritin blev vurderet ved anvendelse zeta potentiometri og matrix-assisteret laser desorption ionisering time-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri. Zetapotentialet ændret fra -10,5 mV for MF til + 8,3 mV for kationiseret magnetoferritin, bekræfter enændring i overfladen potentiale fra negativ til positiv (tabel 1). Massespektrometriske eksperimenter fandt en subunit molekylvægt på 20,1 kDa for nativt Apo-ferritin og 21,1 kDa for kationiseret apo-ferritin (Figur 2 B). Denne masseforøgelse svarer til ca. 12 koblede DMPA molekyler pr proteinunderenheden samt kationiseringen af 288 rester på hele 24-subunit-protein.
Magnetisk mætning og modtagelighed blev målt under anvendelse af SQUID magnetometri, og tværgående og langsgående relaksivitet blev målt under anvendelse af magnetisk resonans-billeddannelse. Magnetiske egenskaber var ens for magnetoferritin og kationiseret magnetoferritin, hvilket indikerer, at kationisering havde ubetydelig indvirkning på de magnetiske egenskaber af vedlagte Spion (tabel 1). Desuden er disse egenskaber, der ligner andre jernoxid baserede nanopartikler, 19,30 demonstrerer, at kationiseret Magnetoferritin ville være så egnet som konventionelle Spion-baserede MRI-kontrastmidler i styrke imaging kontrast.
Efter 30 minutters eksponering, blev celleoverfladen tæt dækket med kationiseret magnetoferritin (Figur 3 A). Men efter en uge, blev der ikke nanopartikler fundet på celleoverfladen (figur 3 B). Kationiseret magnetoferritin var bemærkelsesværdigt effektiv til magnetisk mærkning hMSC'er. Navnlig udsættelse af cellerne for kationiseret magnetoferritin i et minut resulterede i magnetiseringen af 92% af cellepopulationen og leveringen af 3,6 pg jern pr celle. Forøgelse af inkubationstiden til 15 minutter resulterede i magnetiseringen af hele cellepopulationen (Figur 3 C).
Figur 1: Karakterisering af magnetof erritin kerner doteret med 5% kobolt. TEM billeder af magnetoferritin farvet med aurothioglucose (A) og ufarvede (B). Indsat viser tilsvarende elektron diffraktion med magnetit indekser. Scale bar: 20 nm. (C) Raman spektrum for magnetoferritin. Pilene angiver de vigtigste Raman vibrationsindstillinger for kobolt ferrit (T 2g), magnetit og maghemit (både A 1g). 31,32 laserbølgelængden anvendte 532 nm. (Billede tilpasset fra Okuda et al. 18). Bemærk, at denne magnetoferritin prøve var blevet yderligere oprenset ved hjælp af magnetisk separation, hvilket isoleret ensartet belastede magnetoferritin partikler. Klik her for at se en større version af dette tal.
785fig2.jpg "/>
Figur 2: kationisering af magnetoferritin. A) opløsningsmiddeltilgængelig overfladeareal repræsentationer, der viser fordelingen af sur (rød) og basiske (gul) aminosyrerester på proteinet overfladen. Magnetoferritin (1) modificeres til kationiseret magnetoferritin (2) ved carbodiimid-medieret tværbinding af DMPA til sure aminosyrerester på proteinet overflade (3). B) massespektrometrianalyse af Apo-ferritin og kationiseret apo-ferritin underenheder. Masse-til-ladning (m / z) spektrum af apoferritin (ApoF) og kationiseret apoferritin (cat-ApoF) genereret af MALDI-TOF. observeres en masse stigning fra 20,1 kDa til 21,1 kDa efter kationisering. (Billede tilpasset fra Correia Carreira et al. 15) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Magnetisk mærkning og celle adskillelse af hMSC'er inkuberet med kationiseret magnetoferritin. A) TEM billede af hMSC'er efter 30 minutters inkubation med kationiseret magnetoferritin. Pilen viser tilstedeværelsen af magnetoferritin kerner tætpakkede på celleoverfladen. Scale bars: 200 nm. B) TEM billede af hMSC en uge efter mærkning. Den celleoverfladen er fri af kationiseret magnetoferritin. C) Undersøgelse hurtigheden af magnetisk mærkning: 92% af cellepopulationen blev magnetiseret efter et minuts eksponering med 0,5 uM kationiserede magnetoferritin, og hele cellepopulationen blev magnetiseret inden for 15 minutter. Jernindhold per celle blev bestemt ved anvendelse ICP-OES. Gennemsnit og standardafvigelse fra tre biologiske gentagelser vises. (Billede tilpasset fra Correia Carreira et al. 15) Klik her for at se en større version af dette tal.
| MF | cat-MF | |
| Hydrodynamisk diameter [nm] | 11,8 ± 1,1 | 12,5 ± 1,4 |
| Zetapotentialet [MV] | (-) 10,4 ± 0,2 | 8,3 ± 0,7 |
| Magnetisk mætning øjeblik [Am 2 kg -1] | 54,9 ± 1,6 | 55,3 ± 1,4 |
| Masse modtagelighed [x 10 4 m 3 kg -1] | 1,75 ± 0,08 | 1,75 ± 0,07 |
| Langsgående relaksation [mM -1 sek-1] | 2,6 ± 0,1 | 2.3 ± 0.1 |
| Tværgående relaksivitet [mM -1 sek-1] | 44,6 ± 1,0 | 52,8 ± 0,8 |
Tabel 1: Fysisk karakterisering af magnetoferritin (MF) og kationiseret magnetoferritin (cat-MF). (Tabel tilpasset fra Correia Carreira et al. 15)
Discussion
TEM af magnetoferritin prøver farvet med aurothioglucose afslørede den vellykkede mineralisering af nanopartikler inde i proteinet bur. Elektron diffraktion og Raman analyse af nanopartikel kerne indikerede tilstedeværelsen af en cobalt-ferrit, hvilket indikerer vellykket doping af nanopartikel kerne med cobalt. Dette viser, at blandede oxid nanopartikler succes kan være mineraliseret i apo-ferritin hulrum. Endvidere har vi vist tidligere, at kobolt doping kan varieres ved at ændre mængden af cobalt precursor tilsættes til reaktionsblandingen, som muliggør indstilling af de magnetiske egenskaber. 18
Magnetoferritin syntese kan udføres i en række af skibe, så længe de er stramt forseglelig og har adgang porte hvorigennem reaktanter kan indføres (f.eks, en tre-halset rundbundet kolbe). Reaktionstemperaturen bør holdes på 65 ° C, enten ved at anbringe beholderen ien vand / olie bad eller ved anvendelse af en dobbelt-beholder med kappe. Her brugte vi en dobbelt-dobbeltvægget elektrokemisk celle setup til at udføre syntesen. For at garantere vellykket syntese og fastholde den korrekte pH og undgå forurening oxygen af de vandige opløsninger er afgørende. Metalsaltopløsninger bør altid fremstilles umiddelbart før brug snarere end på forhånd. Endvidere kan kommercielle apoferritin løsninger varierer i kvalitet og påvirke syntese udfald (f.eks., Størrelse nanopartikel kerne mineraliseret). Det kan hjælpe til at dialysere apoferritin opløsningen i 50 mM HEPES puffer (pH 8,6) før syntese at fjerne eventuel overskydende reduktionsmiddel anvendes af fabrikanten. Det er nyttigt at gøre et notat af batchnummer apo-ferritin opløsning, der anvendes til syntese, så det kan være specifikt anmodet producenten skal yderligere materiale skal købes. Desuden bør det protein koncentrationen af kommercielt tilgængelige apo-ferritin angives på flasken, hvilket kananvendes til at beregne mængden af apo-ferritin opløsning nødvendig til syntese. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du kontakte leverandøren for denne information.
Fordelen ved gradvis tilsætning af metalsalte og hydrogenperoxid - som vist her og i tidligere rapporter - er, at der kan styres således, at forskellige belastningstilstande faktorer (dvs. nanopartikler størrelser) kan opnås mineralisering af nanopartikel kerne. 33 Endvidere er det muligt at oprense magnetoferritin yderligere anvendelse af en magnetisk separation kolonne, fx en søjle pakket med rustfrit stål pulver fastgjort inde i en elektromagnet. 34 Således kan stærkt monodisperse nanopartikler kerner isoleres fra størstedelen magnetoferritin prøven. Men for magnetisk cellemærkning som præsenteres her dette er ikke påkrævet. En begrænsning ved magnetoferritin syntese er den relativt lave syntese udbytte på ca. 10%, og den relativt høje pris på kommerciel apo-ferritin løsninger. Imidlertid kan apo-ferritin også fremstilles ud fra billigt tilgængelig hest milt ferritin ved at følge etablerede de-mineralisering protokoller. 16
Kationisering af magnetoferritin blev opnået ved at tilsætte et molforhold på 250 molekyler af DMPA og 50 molekyler af EDC pr negativt ladet rest (beregningerne baseret på aminosyresekvensen af hestemilt-ferritin). Dette overskud af reagens forhold protein resulterede i høje kationisering effektivitet, sammenlignes også tidligere rapporterede resultater for kationiseringen af ferritin. 35 For MALDI-TOF analyse, apoferritin og kationiseret apoferritin blev brugt på grund af den overdrevne molekylmasse af magnetoferritin kerne. For at give høje kationisering effektivitet, optimal pH er også afgørende. EDC-medieret tværbinding er mest effektiv under mildt sure betingelser, og vi fandt, at pH 5 gav optimale kationisering resultater for magnetoferritin. Men for andre proteiner cationization pH kan skal optimeres. Kationisering i eller tæt på det isoelektriske punkt for proteinet, bør undgås, da dette kan føre til alvorlig udfældning.
Stamceller magnetisering med kationiseret magnetoferritin var meget effektiv og kunne opnås ved hjælp af inkubationstider godt under 30 minutter. Selv et minuts inkubation resulterede i et cellulært jernindhold på 3,6 pg, hvilket ligger inden for rapporterede område, der kræves for at påvirke T2 og T2 * kontrast til MRI. 36,37 Det er også bemærkelsesværdigt, at denne effektive mærkning opnås med lave ekstracellulære jern koncentrationer. For eksempel tidligere undersøgelser under anvendelse af anioniske nanopartikler rapporterer jern niveauer på 10 pg per celle efter en 30 minutters inkubationsperiode med 5 mM jern. 38 Til sammenligning inkubation med et kationiseret magnetoferritin opløsning indeholdende 0,5 pM protein svarer til inkubation med ca. 0,2 mM jern- og også giver ca. 10 pg jern pr cell efter 30 minutter. Vi var ikke i stand til klart at identificere eventuelle endocytotiske vesikler hjælp TEM. Men tidligere undersøgelser ved hjælp af kationiseret ferritin fandt, at internalisering forekom inden for de første ti minutter af eksponering. 39,40 Kationiseret ferritin kunne være lokaliseret i coatede vesikler, hvilket indikerer clathrin- eller caveolin-afhængig endocytose. De samme undersøgelser rapporterede endvidere, at efter 30 minutters inkubation, stadig kationiseret ferritin var til stede på celleoverfladen, samt i multivesikulære organer, der ligner lysosomer.
Yderligere anvendelser kunne omfatte kationisering af Apo-ferritin bure lastet med andre nanopartikler og / eller funktionelle molekyler, såsom anticancerlægemidler 41 eller quantum dots 42. Kationisering af disse ferritin konstruktioner kan resultere i hurtigere og mere effektiv levering af deres last til celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
| apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
| cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
| sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
| Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
| Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml |
| ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
| HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
| ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
| sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 ml/min |
| automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
| Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
| Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
| N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
| dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration |
| penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration |
| human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
| trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
| MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
| MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
| Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
| Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
| Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
| JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
| InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
| Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
| Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
| ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
| Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
| Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
| Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
| 710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells | |
References
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles. Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).
- Cunningham, C. H., et al. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).
- Song, H. T., et al. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling. J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).
- Daldrup-Link, H. E., et al. Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).
- Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev. 1, (2010).
- Dodd, S. J., et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging. Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).
- Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging. Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).
- Bulte, J. W. M., et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).
- Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).
- Lewin, M., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents. Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).
- Correia Carreira,, S,, et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).
- Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein. Science. 257 (5069), 522-523 (1992).
- Klem, M. T., et al. Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage. J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).
- Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles. J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).
- Uchida, M., et al. A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).
- Danon, D., Skutelsk E, M. arikovsY., Goldstei, L. Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces. J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).
- Valero, E., et al. Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes. J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).
- Zborowski, M., et al. Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph. Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).
- Ikezoe, Y., et al. Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line. Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).
- Uchida, M., et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).
- Yamashita, K., et al. Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides. Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).
- Williams, A., Frasca, V., et al. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hagel, L., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed. , John Wiley & Sons, Ltd. 1 (2000).
- Correia Carreira, S., et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. , (2016).
- Simon, G. H., et al. T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning. Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).
- Jubb, A. M., Allen, H. C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).
- Wang, Z. W., et al. High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4. Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).
- Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin). Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).
- Okuda, M., et al. Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures. Nanotechnology. 23 (41), 415601 (2012).
- Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).
- Billotey, C., et al. T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging. Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).
- Smirnov, P., et al. In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy. Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).
- Wilhelm, C., et al. Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells. Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).
- MacLean, I., Sanders, E. Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo. Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).
- Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).
- Xing, R. M., et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).
- Wong, K. K., Mann, S. Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites. Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).
