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Bioengineering

प्रकोष्ठों के अल्ट्रा फास्ट आकर्षण संस्कार के लिए Cationized Magnetoferritin के संश्लेषण

Published: December 13, 2016 doi: 10.3791/54785
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1, 5, 6
1Bristol Centre for Functional Nanomaterials, University of Bristol, 2Department of Materials, Imperial College London, 3Self Assembly Group, CIC nanoGUNE, 4Ikebasque, Basque Foundation for Science, 5School of Cellular and Molecular Medicine, University of Bristol, 6H.H. Wills Physics Laboratory, University of Bristol

Abstract

इस तरह के सेल इमेजिंग और दूरदराज के हेरफेर के रूप में कई महत्वपूर्ण जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों, superparamagnetic लोहे के आक्साइड नैनोकणों (SPIONs) के साथ कोशिकाओं लेबलिंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। SPIONs की पर्याप्त सेलुलर तेज हासिल करने के लिए एक चुनौती है कि परंपरागत रूप SPIONs की बुलंद सांद्रता के लिए कोशिकाओं को उजागर करके या (72 घंटा तक) जोखिम बार के समय को बढ़ाने से मुलाकात की गई है। हालांकि, इन रणनीतियों विषाक्तता मध्यस्थता की संभावना है। यहाँ, हम एक सतही सतह functionalization प्रोटोकॉल है कि तेजी से सेल संस्कार के लिए सक्षम बनाता कम जोखिम सांद्रता का उपयोग प्रोटीन आधारित SPION magnetoferritin के संश्लेषण के रूप में अच्छी तरह से प्रस्तुत करते हैं। magnetoferritin की SPION कोर 8.2 एनएम mineralized के एक औसत कण व्यास घोड़ा तिल्ली APO-ferritin की गुहा के अंदर के साथ कोबाल्ट डाल दिया गया लोहे के आक्साइड के होते हैं। magnetoferritin का रासायनिक cationization एक उपन्यास, अत्यधिक झिल्ली सक्रिय SPION कि चुम्बकीय मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (hMSCs) के रूप में ऊष्मायन बार का उपयोग कर उत्पादन0.2 मिमी के रूप में चढ़ाव के रूप में एक मिनट और लोहे की सांद्रता के रूप में कम।

Introduction

भूतल बंधन या superparamagnetic लोहे के आक्साइड नैनोकणों (SPIONs) के internalization ऐसे इमेजिंग और दूरदराज के हेरफेर के रूप में आवेदन के लिए सेल प्रकार की एक किस्म का आकर्षण संस्कार के लिए सक्षम है। 1 हालांकि, पर्याप्त सेलुलर संस्कार को प्राप्त करने के लिए एक चुनौती हो सकती है, खासकर जब SPION और कोशिका की सतह के बीच बातचीत कमजोर है। 2 अतीत, लंबे समय तक निवेश या उच्च सांद्रता SPION में रणनीति इस चुनौती पर काबू पाने के रूप में नियोजित किया गया है। 3,4 फिर भी, इन रणनीतियों क्योंकि वे विषाक्तता 5,6 बढ़ाने के लिए और इस तरह के लिम्फोसाइटों के रूप में कम internalization दरों, साथ प्रकार की कोशिकाओं में बहुत ही सीमित सफलता है समस्याग्रस्त हैं। 7 SPIONs के सेलुलर तेज बढ़ाने के लिए, कई सतह functionalization दृष्टिकोण का पता लगाया गया है। उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी रिसेप्टर की मध्यस्थता endocytosis, 8 बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि गैर विशिष्ट तेज अभिकर्मक एक का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकतामर्द 9,10 या ऐसे एचआईवी गूंथना पेप्टाइड के रूप में सेल मर्मज्ञ प्रजातियों। 11,12 हालांकि, एंटीबॉडी और पेप्टाइड functionalization दृष्टिकोण, महंगा अभिकर्मकों और जटिल सिंथेटिक तैयारी द्वारा सीमित अभिकर्मक एजेंटों nanoparticle वर्षा पैदा कर सकते हैं और प्रतिकूल सेल समारोह को प्रभावित है, जबकि रहे हैं। 13,14

हमने हाल ही में रासायनिक cationized magnetoferritin के संश्लेषण, एक उपन्यास SPION (hMSCs) ऊष्मायन बार एक मिनट के रूप में के रूप में कम है जिसके उपयोग से magnetizing मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं में अत्यधिक प्रभावी था की सूचना दी। 15 Magnetoferritin लोहे भंडारण प्रोटीन ferritin के डी-mineralized गुहा के अंदर एक SPION पुनर्गठन द्वारा संश्लेषित है। 16 यह प्रोटीन आधारित SPION कई गुण, जैसे चुंबकीय कोर, 17-19 और biocompatibility और जलीय घुलनशीलता के चुंबकीय गुण प्रोटीन खोल द्वारा प्रदत्त शक्तियों पर नियंत्रण के रूप में यह है कि यह अच्छी तरह से सेल संस्कार के लिए अनुकूल बनाने को जोड़ती है। आगे कीअधिक, सतह functionalization आसानी से पता अमीनो एसिड रासायनिक 20-22 या आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है की वजह से हासिल की है। 23-25 हमें पता चला है कि प्रोटीन के खोल के अम्लीय अमीनो एसिड के अवशेष की रासायनिक cationization एक स्थिर nanoparticle है कि आसानी से कोशिका की सतह तेजी से और लगातार सेल संस्कार के लिए अग्रणी पर ऋणात्मक डोमेन के साथ बातचीत उत्पन्न करता है। यह प्रक्रिया श्रमसाध्य functionalization और लंबी ऊष्मायन प्रोटोकॉल के लिए की आवश्यकता समाप्त, और गैर विशिष्ट लेबलिंग तंत्र की वजह से यह तेजी से आकर्षण संस्कार रणनीति अन्य प्रकार की कोशिकाओं में व्यापक प्रसार आवेदन मिल जाना चाहिए। यहाँ, हम अल्ट्रा फास्ट सेल लेबलिंग विधि की गहराई में रिपोर्ट, cationized magnetoferritin के संश्लेषण, शुद्धि और सतह functionalization की विस्तृत प्रोटोकॉल सहित उपस्थित थे।

Protocol

मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (hMSC) कुल हिप रिप्लेसमेंट सर्जरी, ब्रिस्टल Southmead अस्पताल रिसर्च आचार समिति के दिशा निर्देशों के साथ पूर्ण अनुसार (संदर्भ # 078/01) और बाद मरीज की सहमति प्राप्त हुई थी में के दौर से गुजर अस्थिसंध्यार्ति रोगियों के समीपस्थ फीमर बोन मैरो से काटा गया।

1. Magnetoferritin संश्लेषण और शुद्धीकरण

  1. सामान्य टिप्पणियाँ
    1. magnetoferritin संश्लेषण धातु व्यापारियों के ऑक्सीकरण को प्रतिबंधित करने के लिए नाइट्रोजन वातावरण के तहत 65 डिग्री सेल्सियस पर एक sealable, डबल तख्ताबंदीवाला प्रतिक्रिया पोत में प्रदर्शन। एक सिरिंज पंप का उपयोग कर प्रतिक्रिया पोत में ढक्कन में उपयोग बंदरगाहों के माध्यम से धातु नमक समाधान और हाइड्रोजन पेरोक्साइड इंजेक्षन।
    2. magnetoferritin संश्लेषण के बाद, आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन को शुद्ध आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा किया प्रोटीन गुहा में संलग्न नहीं नैनोकणों, दूर करने के लिए (धारा 1.4 देखें) प्रोटीन monomers को अलग करने (धारा 1.5 देखें)। डेtermine एक ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता (1.6 खंड देखें)।
  2. तैयारी से पहले संश्लेषण के लिए
    1. एक ट्यूब के पानी में नाइट्रोजन गैस सिलेंडर से जुड़ा रखने चिपटना फिल्म के साथ पोत सील और लगभग 60 मिनट के लिए नाइट्रोजन गैस के माध्यम से बुदबुदाती विआयनीकृत पानी की 500 मिलीलीटर Deoxygenate।
    2. 65 डिग्री सेल्सियस के लिए डबल तख्ताबंदीवाला प्रतिक्रिया पोत से जुड़े एक नहाने के पानी गरम करें। प्रतिक्रिया पोत में 50 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) बफर (8.6 पीएच) के 75 मिलीलीटर जोड़ें, लगभग 20 मिनट के लिए बफर समाधान के माध्यम से नाइट्रोजन गैस बुदबुदाती द्वारा पोत, और deoxygenate सील। इसी समय, बफर समाधान के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर हलचल।
    3. HEPES बफर समाधान deoxygenating के बाद, बफर से नाइट्रोजन गैस की आपूर्ति ट्यूब को हटाने और यह पोत एक नाइट्रोजन वातावरण बनाए रखने के लिए निलंबित रखने के लिए। 3 मिलीग्राम / मी के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए APO-ferritin जोड़ेएल। चुंबकीय सरगर्मी जारी है, लेकिन अगर झाग होता है सरगर्मी गति को कम।
    4. ऑक्सीजन रहित विआयनीकृत पानी की 50 मिलीलीटर में 0.19 ग्राम भंग करके कोबाल्ट सल्फेट heptahydrate की एक 25 मिमी शेयर समाधान तैयार है।
    5. ऑक्सीजन रहित विआयनीकृत पानी की 100 मिलीलीटर में 0.98 ग्राम भंग करके अमोनियम सल्फेट लोहे hexahydrate समाधान की एक 25 मिमी समाधान तैयार है।
    6. अमोनियम सल्फेट लोहे hexahydrate समाधान के 2.5 मिलीलीटर निकालें और कोबाल्ट सल्फेट heptahydrate के 2.5 मिलीलीटर के साथ बदलें।
    7. पहले ऑक्सीजन रहित विआयनीकृत पानी के 9 मिलीलीटर (डब्ल्यू / डब्ल्यू 30%) एक हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के 965 μl जोड़ने, और फिर 99 मिलीलीटर के लिए इस उप-शेयर के 1 मिलीलीटर जोड़कर ऑक्सीजन रहित विआयनीकृत पानी में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के एक 8.33 मिमी समाधान तैयार ऑक्सीजन रहित विआयनीकृत पानी की।
  3. Magnetoferritin संश्लेषण
    1. (एक साथ APO-ferritin समाधान में दोनों लौह कोबाल्ट अग्रदूत और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 10.1 मिलीलीटर इंजेक्षन चुंबकीय रोंtirred) 0.15 मिलीग्राम / मिनट दो सिरिंज पंप का उपयोग करने का एक प्रवाह दर पर (कुल मात्रा इंजेक्शन: 20.2 मिलीलीटर)।
    2. इंजेक्शन अवधि के दौरान, विआयनीकृत पानी की एक और 500 मिलीलीटर deoxygenate।
      नोट: प्रतिक्रिया पोत की सामग्री को धीरे-धीरे प्रतिक्रिया आय के रूप में एक गहरे भूरे रंग अपनाने।
    3. पहले इंजेक्शन के पूरा होने के कुछ ही समय पहले, लोहा-कोबाल्ट अग्रदूत और हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान हौसले ऑक्सीजन रहित विआयनीकृत पानी का उपयोग करने का एक और 100 मिलीलीटर की तैयारी।
    4. 1.3.1 में वर्णित लौह कोबाल्ट और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के हौसले से तैयार समाधान का उपयोग इंजेक्शन चरण को दोहराएँ।
    5. इंजेक्शन अवधि के दौरान, विआयनीकृत पानी की एक और 500 मिलीलीटर deoxygenate, और 1.3.3 और 1.3.4 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
    6. तीसरे इंजेक्शन के बाद, समाधान छोड़ सरगर्मी के तहत 15 मिनट के लिए परिपक्व करने के लिए।
    7. समाधान में मुक्त करने के लिए धातु आयनों chelate प्रतिक्रिया पोत के लिए एक 1 एम सोडियम साइट्रेट समाधान के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. प्रतिक्रिया से समाधान निकालें50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब, 4,350 XG पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला पारित में पोत। इस स्तर पर, छान सतह पर तैरनेवाला शुद्धि जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  4. आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी
    1. एक कॉलम (2.5 सेमी व्यास 20 सेमी लंबे) एक cationic मैट्रिक्स 10 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग युक्त पर नमूना लोड।
    2. बफर (50 मिमी Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) बफर, 8.0 पीएच) चल रहा 10 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर एक ढाल पंप का उपयोग कर के लगभग 100 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें।
    3. 150, 500 और 1,000 मिमी अंतिम NaCl एकाग्रता, प्रत्येक एकाग्रता की 150 मिलीलीटर: प्रोटीन elute करने के लिए, Tris बफर में सोडियम क्लोराइड (NaCl) की सांद्रता में वृद्धि के साथ 10 मिलीग्राम / मिनट पर स्तंभ धो लें।
    4. प्रोटीन 500 मिमी की एक NaCl एकाग्रता में elutes के रूप में, एक स्वचालित अंश कलेक्टर का उपयोग कर 50 मिलीलीटर भागों में इसे इकट्ठा।
      नोट: के लिए एकआयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी की विस्तृत प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल से परामर्श करें। 26
  5. आकार अपवर्जन वर्णलेखन
    1. एक 15 मिलीलीटर केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट एक 4 मिलीलीटर मात्रा इकाई द्वारा बाद का उपयोग लगभग 2 मिलीलीटर की एक मात्रा के magnetoferritin की 150 मिलीलीटर ध्यान लगाओ। इस प्रक्रिया का एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों के निर्माता के निर्देशों (सामग्री की सूची देखें) का संदर्भ लें।
    2. एक इंजेक्शन पाश का उपयोग कर एक जेल निस्पंदन स्तंभ पर केंद्रित नमूना लोड।
    3. चल बफर (50 मिमी Tris बफर, पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl युक्त) 1.3 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर साथ स्तंभ धो लें।
    4. एक स्वचालित अंश कलेक्टर का उपयोग कर 6 मिलीलीटर अंशों लीजिए। प्रोटीन monomers पिछले elute। इस बिंदु पर, शुद्ध magnetoferritin 4 डिग्री सेल्सियस तक cationization पर संग्रहित किया जा सकता है।
      नोट: एक जेल निस्पंदन स्तंभ का उपयोग आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी की एक विस्तृत प्रोटोकॉल से परामर्श के लिए previously प्रकाशित प्रोटोकॉल। 27
  6. प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घोड़ा तिल्ली ferritin का उपयोग कर 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 और 1 मिलीग्राम / 50 मिमी Tris बफर में मिलीलीटर की ferritin मानकों तैयार करें।
      नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ferritin के प्रोटीन एकाग्रता बोतल पर कहा गया है। यदि नहीं, तो इस जानकारी के लिए आपूर्तिकर्ता से संपर्क करें।
    2. जब तक समाधान का रंग लगभग 0.5 मिलीग्राम / एमएल मानक के रंग से मेल खाता 50 मिमी Tris बफर में अज्ञात एकाग्रता की magnetoferritin नमूने पतला। कमजोर पड़ने कारक के एक नोट करें।
    3. एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में तीन प्रतियों में प्रत्येक मानक और magnetoferritin नमूना के 10 μl जोड़ें।
    4. (ब्रैडफोर्ड परख अभिकर्मक जानकारी के लिए सामग्री सूची को देखें) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए तैयार कर दिया है ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 200 μl जोड़ें।
    5. 8 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    6. Λ = 595 एनएम पर absorbance के उपाय का उपयोग करएक microplate रीडर।
    7. प्रोटीन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में ferritin मानकों के absorbance मतलब प्लॉट और magnetoferritin नमूना की एकाग्रता की गणना करने के लिए ढाल और रेखीय फिट की अवरोधन का उपयोग करें।
      नोट: खाते में कमजोर पड़ने कारक है कि मानक वक्र करने के लिए magnetoferritin नमूना समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ले लो।

2. Magnetoferritin Cationization

  1. सामान्य टिप्पणियाँ
    नोट: magnetoferritin cationization के लिए, एन, एन -dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) n का उपयोग एमएफ सतह पर aspartic और glutamic एसिड के अवशेष के लिए मिलकर किया गया था - (3-dimethylaminopropyl) - एन '-ethylcarbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी)।
    1. क्रियाशीलता के तहत कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया बाहर ले। प्रोटोकॉल नीचे दिए गए 5 मिलीलीटर (प्रोटीन एकाग्रता 2 मिलीग्राम / एमएल) की कुल मात्रा में magnetoferritin के 10 मिलीग्राम की cationization के लिए है। हालांकि, ऊपर या नीचे पैमाने परDMPA: ईडीसी अनुपात के अनुरूप है, साथ ही बफर और magnetoferritin समाधान की मात्रा प्रोटीन रखकर।
    2. cationization प्रतिक्रिया करने से पहले, 50 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 7) 50 मिमी NaCl युक्त में magnetoferritin नमूने dialyze। इस Tris क्षालन बफर हटाने और Tris अमाइन और ईडीसी सक्रिय कार्बोक्जिलिक एसिड के अवशेष के बीच अवांछित प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। डायलिसिस के बाद प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण और cationization करने के लिए / मिलीलीटर से पहले 4 मिलीग्राम के लिए इसे समायोजित।
  2. Cationization प्रोटोकॉल
    1. DMPA की 374 मिलीग्राम वजन और 200 मिमी 2- (एन -morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) बफर के 2.5 मिलीलीटर में भंग।
    2. समाधान पीएच को लगभग 7 केंद्रित (6 एम) हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग कर समायोजित करें।
      चेतावनी: एक धूआं हुड में इस कदम प्रदर्शन, DMPA करने के लिए एसिड के अलावा के रूप में जहरीले धुएं रिलीज!
    3. magnetoferritin समाधान के 2.5 मिलीलीटर 4 मिलीग्राम / मिलीलीटर में जोड़ें (अंतिम ध्यान केंद्रितएमईएस के tration 100 मिमी, magnetoferritin के अंतिम एकाग्रता 2 मिलीग्राम / एमएल, प्रोटीन की कुल राशि 10 मिलीग्राम है) है।
    4. एक चुंबकीय उत्तेजक जोड़ें और हलचल 2 घंटा संतुलित करने के लिए।
    5. ध्यान से 1 एम एचसीएल का उपयोग कर पीएच 5.0 का हल समायोजित करें।
    6. ईडीसी पाउडर के 141 मिलीग्राम DMPA / magnetoferritin समाधान करने के लिए जोड़ें।
    7. 3.5 घंटे के लिए सरगर्मी जारी है।
    8. 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर किसी भी अवक्षेप हटा दें।
    9. डायलिसिस बफर की जगह एक 12-14 केडीए आणविक वजन कट ऑफ के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग का हल जोड़ें और 50 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 7) 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए 50 मिमी NaCl युक्त 4 एल के खिलाफ dialyze, कम से कम तीन उस अवधि के दौरान बार।
      नोट: इस बिंदु पर, cationized magnetoferritin आगे उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

Cationized Magnetoferritin साथ 3. मानव mesenchymal स्टेम सेल लेबलिंग

  1. सामान्य टिप्पणियाँ
    1. 4 दिन - 175 सेमी 2 बोतल और संस्कृति के माध्यम से है, जो हर 3 मंगाया गया था की 20 मिलीलीटर का उपयोग कर monolayers के रूप में संस्कृति कोशिकाओं। संस्कृति के माध्यम Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के शामिल, 1000 मिलीग्राम / एल ग्लूकोज, 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, 1% से युक्त (वी / वी) एल -alanyl-एल glutamine समाधान और 5 एनजी / हौसले पूरक मिलीलीटर मानव fibroblast वृद्धि कारक।
  2. Cationized magnetoferritin साथ hMSC के चुंबकीय लेबलिंग
    1. बीज 25 सेमी 2 बोतल में 150,000 hMSCs और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पालन करने के लिए छोड़ दें।
    2. फ़िल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से cationized magnetoferritin बाँझ और प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
    3. बाँझ परिस्थितियों को देखते हुए cationized magnetoferri के एक 0.5 माइक्रोन के समाधान तैयारफॉस्फेट में टिन खारा (पीबीएस) बफर। उपयोग करें जब तक एक बाँझ संस्कृति हुड में छाया हुआ है रखें।
    4. कमरे के तापमान पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ चढ़ाया कोशिकाओं को धो लें।
    5. चढ़ाया कोशिकाओं को निष्फल cationized magnetoferritin समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और इच्छित समय अवधि (1 मिनट के लिए 1 घंटा) के लिए सेते हैं।
    6. trypsin / ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा तो फसल कोशिकाओं पीबीएस के साथ कोशिकाओं, और धो लें।
    7. संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर trypsin / EDTA निष्क्रिय करने के लिए, पर 524 x जी 5 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज का हल हस्तांतरण जोड़ें।
    8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 0.5 मिलीलीटर में सेल गोली चुंबकीय जुदाई बफर फिर से निलंबित, 0.5% से मिलकर (डब्ल्यू / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम और पीबीएस में 2 मिमी EDTA।
  3. चुंबकीय सेल जुदाई
    1. बहु खड़ा करने के लिए चुंबक देते हैं, और चुंबक के लिए एक चुंबकीय जुदाई स्तंभ जोड़ें। वें पर एक पूर्व जुदाई फिल्टर जगहई स्तंभ।
    2. पूर्व जुदाई फिल्टर में चुंबकीय जुदाई बफर के 0.5 मिलीलीटर की जगह है और यह दोनों फिल्टर और स्तंभ धो लें और उन्हें गीला करने के लिए के माध्यम से चलाते हैं।
    3. स्तंभ के अंतर्गत एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें।
    4. चुंबकीय जुदाई स्तंभ के फिल्टर जलाशय में सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. जब जलाशय खाली है, चुंबकीय जुदाई बफर के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    6. जब जलाशय खाली है, चुंबकीय जुदाई बफर के आगे 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. एक और बार (चुंबकीय जुदाई धोने के लिए प्रयोग किया जाता है 1.5 मिलीग्राम होना चाहिए बफर की कुल मात्रा) को दोहराएँ। इस धोने कदम स्तंभ (गैर-चुम्बकीय सेल अंश) से सभी गैर-चुम्बकीय कोशिकाओं elutes।
    8. चुंबक से स्तंभ निकालें और एक ताजा 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह है। स्तंभ जलाशय से फिल्टर निकालें।
    9. जलाशय में चुंबकीय जुदाई बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और तुरंत सवार निर्माण द्वारा आपूर्ति का उपयोग कर स्तंभ के माध्यम से धक्काआर। इस अपकेंद्रित्र ट्यूब (चुम्बकीय सेल अंश) में स्तंभ से चुम्बकीय कोशिकाओं elutes।
    10. अपकेंद्रित्र पर 524 x जी 5 मिनट के लिए दोनों ट्यूबों।
    11. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 0.3 मिलीलीटर पीबीएस में सेल छर्रों फिर से निलंबित।
    12. एक hemocytometer का उपयोग प्रत्येक अंश में कोशिकाओं की संख्या की संख्या की गणना।
    13. चुम्बकीय कोशिकाओं के अंश का निर्धारण करते हैं, एम (%), निम्न समीकरण का उपयोग:
      समीकरण
      जहाँ n (एम) चुम्बकीय अंश और एन में कोशिकाओं की संख्या (एम + NM) चुम्बकीय और गैर-चुम्बकीय भागों में कोशिकाओं की संख्या का योग है।
  4. उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर लोहे की मात्रा का ठहराव के लिए cationized magnetoferritin के साथ लेबल hMSCs तैयारी (आईसीपी OES)
    ध्यान दें: प्रोटोकॉल अन्य आईसीपी OES उपकरणों के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। यह फिर से साथ परामर्श करने की सलाह दी जाती हैजिम्मेदार तकनीशियन।
    1. 524 x जी पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं का एक ज्ञात नंबर अपकेंद्रित्र।
    2. पीबीएस तैरनेवाला निकालें और 50% (वी / वी) नाइट्रिक एसिड के 0.25 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. भंवर अम्लीय सेल निलंबन मिश्रण।
    4. रात भर कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    5. प्रत्येक नमूना और भंवर मिश्रण करने के लिए आसुत जल का 4.75 मिलीलीटर जोड़ें।
    6. आईसीपी OES के साथ विश्लेषण। 28
    7. सेलुलर लौह सामग्री के लिए एक मूल्य निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की संख्या को मापा लौह सामग्री मानक के अनुसार।

Representative Results

मंदिर apoferritin गुहा के अंदर nanoparticle खनिज की पुष्टि करें और औसत मूल आकार (आंकड़े 1 ए और 1 बी) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। बेदाग magnetoferritin नमूनों की छवि विश्लेषण के 8.2 ± 0.7 एनएम औसत कोर व्यास दिया था, और aurothioglucose दाग प्रोटीन पिंजरे के भीतर नैनोकणों की उपस्थिति की पुष्टि की। ध्यान दें कि छवियों को एक magnetoferritin नमूना है कि आगे चुंबकीय जुदाई का उपयोग वर्दी nanoparticle कोर को अलग-थलग करने के लिए शुद्ध किया गया था दिखा। Magnetoferritin नमूने है कि चुंबकीय शुद्ध नहीं थे एक थोड़ा व्यापक कोर आकार वितरण किया है। चुने हुए क्षेत्र इलेक्ट्रॉन विवर्तन का उपयोग कर magnetoferritin कोर की संरचना का विश्लेषण 29 उलटा खनिज पदार्थ मैग्नेटाइट पर आधारित संरचना के संभावित उपस्थिति (फे 3 हे 4) और / या maghemite (γ-फे 2 ओ 3), और साथ ही संकेत दिया खनिज पदार्थ संरचना सह 3 के कारण 4। इसके अलावा, रमन स्पेक्ट्रा फे 3 हे 4, γ-फे 2 ओ 3 की छोटी मात्रा में है, और एक कोबाल्ट फेराइट (चित्रा 1 सी) के लिए जिम्मेदार ठहराया चोटियों का पता चला। magnetoferritin की आईसीपी OES विश्लेषण लोहे के 102 माइक्रोग्राम और 0.9 माइक्रोग्राम magnetoferritin के मिलीग्राम प्रति कोबाल्ट के एक औसत दिखाया।

एक योजनाबद्ध शामिल किया गया है, बाद में cationization कदम (चित्रा 2 ए) की व्याख्या की गयी। के रूप में गतिशील प्रकाश बिखरने द्वारा निर्धारित magnetoferritin और cationized magnetoferritin की hydrodynamic व्यास, 11.8 ± 1.1 एनएम और 12.5 ± 1.4 एनएम, क्रमशः था। magnetoferritin को सहसंयोजक DMPA युग्मन के cationization दक्षता जीटा potentiometry और मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption आयनीकरण समय की उड़ान (MALDI-TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग मूल्यांकन किया गया था। जीटा संभावित cationized magnetoferritin के लिए + 8.3 एम वी म्यूचुअल फंड के लिए -10.5 एम वी से बदल गया है, एक की पुष्टिसकारात्मक (तालिका 1) नकारात्मक से सतह क्षमता में बदल जाते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों मूल निवासी APO-ferritin और cationized APO-ferritin (चित्रा 2 बी) के लिए 21.1 केडीए के लिए 20.1 केडीए के एक सबयूनिट आणविक वजन पाया। यह बड़े पैमाने पर वृद्धि प्रोटीन सबयूनिट के अनुसार लगभग 12 युग्मित DMPA अणुओं, और पूरे 24-सबयूनिट प्रोटीन पर 288 अवशेषों की cationization से मेल खाती है।

चुंबकीय संतृप्ति और संवेदनशीलता विद्रूप magnetometry का उपयोग करके मापा गया था, और अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य relaxivity चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग का उपयोग मापा गया। चुंबकीय गुण magnetoferritin और cationized magnetoferritin के लिए इसी तरह के थे, यह दर्शाता है कि cationization संलग्न SPION (तालिका 1) के चुंबकीय गुण पर नगण्य प्रभाव पड़ा। इसके अलावा, इन गुणों, अन्य लोहे के आक्साइड आधारित नैनोकणों के समान हैं 19,30 प्रदर्शन है कि Magne cationizedtoferritin इमेजिंग विपरीत बढ़ाने में पारंपरिक SPION आधारित एमआरआई इसके विपरीत एजेंट के रूप में के रूप में उपयुक्त होगा।

30 मिनट जोखिम के बाद, कोशिका की सतह घनी cationized magnetoferritin (चित्रा 3 ए) के साथ कवर किया गया था। हालांकि, एक सप्ताह के बाद, कोई नैनोकणों कोशिका की सतह (चित्रा 3 बी) पर पाए गए। Cationized magnetoferritin चुंबकीय लेबलिंग hMSCs में उल्लेखनीय रूप से प्रभावी था। विशेष रूप से, एक मिनट के लिए cationized magnetoferritin के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में लाने सेल की आबादी का 92% के आकर्षण संस्कार और सेल प्रति लोहे का 3.6 पीजी के वितरण में हुई। 15 मिनट के पूरे सेल की आबादी (चित्रा 3 सी) के आकर्षण संस्कार के परिणामस्वरूप ऊष्मायन समय बढ़ रही है।

आकृति 1
चित्रा 1: magnetof की विशेषता erritin कोर 5% कोबाल्ट के साथ डाल दिया गया। Magnetoferritin के मंदिर छवियों aurothioglucose (ए) और बेदाग (बी) के साथ दाग। इनसेट मैग्नेटाइट सूचकांक के साथ इसी इलेक्ट्रॉन विवर्तन पता चलता है। स्केल पट्टी: 20 एनएम। (सी) रमन magnetoferritin के लिए स्पेक्ट्रम। तीर कोबाल्ट फेराइट (टी 2 जी), मैग्नेटाइट और maghemite (दोनों एक 1G) के लिए मुख्य रमन कंपन मोड संकेत मिलता है। 31,32 लेजर तरंग दैर्ध्य 532 एनएम का इस्तेमाल किया था। (छवि ओकुडा एट अल। 18 से अनुकूलित)। ध्यान दें कि यह magnetoferritin नमूना आगे चुंबकीय जुदाई, जो समान रूप से भरी हुई magnetoferritin कणों पृथक का उपयोग कर शुद्ध किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2: magnetoferritin की Cationization। ए) विलायक सुलभ सतह क्षेत्र प्रोटीन सतह पर अम्लीय (लाल रंग का वितरण) और बुनियादी (पीला) अमीनो एसिड के अवशेष दिखा अभ्यावेदन। Magnetoferritin (1) प्रोटीन (3) सतह पर अम्लीय अमीनो एसिड के अवशेष को DMPA की carbodiimide की मध्यस्थता crosslinking द्वारा cationized magnetoferritin (2) को संशोधित किया गया है। बी) APO-ferritin और cationized APO-ferritin सब यूनिटों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। मास करने के लिए प्रभारी (मी / z) apoferritin के स्पेक्ट्रम (ApoF) और cationized apoferritin (कैट-ApoF) MALDI-TOF द्वारा उत्पन्न। 21.1 केडीए के लिए 20.1 केडीए से एक बड़े पैमाने पर बढ़ाने cationization के बाद मनाया जाता है। (छवि Correia Carreira एट अल से अनुकूलित। 15) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3: चुंबकीय लेबलिंग और cationized magnetoferritin साथ incubated hMSCs की सेल जुदाई। ए) cationized magnetoferritin के साथ एक 30 मिनट ऊष्मायन के बाद hMSCs के मंदिर छवि। तीर magnetoferritin कोर घनी कोशिका की सतह पर पैक की उपस्थिति इंगित करता है। स्केल सलाखों: 200 एनएम। लेबलिंग के बाद hMSC एक सप्ताह के बी) मंदिर छवि। कोशिका की सतह cationized magnetoferritin की स्पष्ट है। सी) चुंबकीय लेबलिंग की तेज़ी जांच: सेल की आबादी का 92% 0.5 माइक्रोन के cationized magnetoferritin के साथ एक एक मिनट के प्रदर्शन के बाद चुम्बकीय रहे थे, और पूरे सेल की आबादी 15 मिनट के भीतर चुम्बकीय था। सेल प्रति लौह सामग्री आईसीपी OES का उपयोग निर्धारित किया गया था। तीन जैविक प्रतिकृति से औसत और मानक विचलन दिखाए जाते हैं। (छवि Correia Carreira एट अल से अनुकूलित। 15) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

म्यूचुअल फंड बिल्ली-MF
Hydrodynamic व्यास [एनएम] 11.8 ± 1.1 12.5 ± 1.4
जीटा संभावित [एमवी] (-) 10.4 ± 0.2 8.3 ± 0.7
चुंबकीय संतृप्ति पल [AM 2 किलो -1] 54.9 ± 1.6 55.3 ± 1.4
मास संवेदनशीलता [10 x 4 मीटर 3 किलो -1] 1.75 ± 0.08 1.75 ± 0.07
अनुदैर्ध्य relaxivity [मिमी -1 सेकंड -1] 2.6 ± 0.1 2.3 ± 0.1
ट्रांसवर्स relaxivity [मिमी -1 सेकंड -1] 44.6 ± 1.0 52.8 ± 0.8

तालिका 1: magnetoferritin की भौतिक लक्षण वर्णन (एमएफ) और cationized magnetoferritin (कैट-एमएफ)। (तालिका Correia Carreira एट अल से अनुकूलित। 15)

Discussion

aurothioglucose के साथ दाग magnetoferritin नमूने के मंदिर प्रोटीन पिंजरे के अंदर नैनोकणों के सफल खनिज का पता चला। इलेक्ट्रॉन विवर्तन और nanoparticle कोर के रमन विश्लेषण एक कोबाल्ट फेराइट की उपस्थिति का संकेत, कोबाल्ट के साथ nanoparticle कोर के सफल डोपिंग का संकेत है। यह दर्शाता है कि मिश्रित आक्साइड नैनोकणों सफलतापूर्वक APO-ferritin गुहा के भीतर mineralized हो सकता है। इसके अलावा, हम पता चला है कि पहले कि कोबाल्ट डोपिंग प्रतिक्रिया मिश्रण है, जो चुंबकीय गुण की ट्यूनिंग के लिए सक्षम बनाता करने के लिए जोड़ा कोबाल्ट अग्रदूत की राशि बदलकर अलग किया जा सकता है। 18

Magnetoferritin संश्लेषण, के रूप में लंबे समय के रूप में वे कसकर sealable कर रहे हैं और उपयोग बंदरगाहों के माध्यम से जो अभिकारकों की शुरुआत की जा सकती है (जैसे, एक तीन गर्दन दौर नीचे कुप्पी) है वाहिकाओं की एक किस्म में प्रदर्शन किया जा सकता है। प्रतिक्रिया तापमान में पोत रखकर या तो 65 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिएएक पानी / तेल स्नान या एक डबल तख्ताबंदीवाला पोत का उपयोग कर। यहाँ, हम संश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक डबल तख्ताबंदीवाला विद्युत सेल सेटअप इस्तेमाल किया। सफल संश्लेषण की गारंटी करने के लिए, सही पीएच को बनाए रखने और जलीय समाधान की ऑक्सीजन संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। धातु नमक समाधान हमेशा हौसले से अग्रिम में के बजाय का उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, वाणिज्यिक apoferritin समाधान गुणवत्ता में भिन्न है और संश्लेषण परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं (उदाहरण के लिए।, Nanoparticle कोर mineralized का आकार)। यह निर्माता द्वारा इस्तेमाल के लिए किसी भी अवशिष्ट एजेंट को कम करने को हटाने के लिए 50 मिमी HEPES बफर (पीएच 8.6) संश्लेषण के लिए पूर्व में apoferritin समाधान dialyze करने में मदद कर सकते हैं। यह संश्लेषण के लिए इस्तेमाल APO-ferritin समाधान के बैच नंबर का एक नोट बनाने के लिए उपयोगी है, तो यह विशेष रूप से निर्माता खरीदा जा करने के लिए करना चाहिए अतिरिक्त सामग्री की जरूरत से अनुरोध किया जा सकता है। इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध APO-ferritin के प्रोटीन एकाग्रता, बोतल पर कहा जाना चाहिए जो कर सकते हैंAPO-ferritin समाधान संश्लेषण के लिए आवश्यक की मात्रा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यदि यह मामला नहीं है, इस जानकारी के लिए आपूर्तिकर्ता से संपर्क करें।

धातु लवण और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के क्रमिक अलावा के लाभ - के रूप में यहाँ और पिछली रिपोर्टों में प्रस्तुत है - कि nanoparticle कोर के खनिज कि इस तरह के विभिन्न लोडिंग कारकों (यानी, nanoparticle आकार) प्राप्त किया जा सकता नियंत्रित किया जा सकता है। 33 इसके अलावा, यह आगे एक चुंबकीय जुदाई स्तंभ, जैसे, एक स्तंभ स्टेनलेस स्टील पाउडर एक विद्युत अंदर सुरक्षित के साथ पैक का उपयोग कर magnetoferritin शुद्ध करने के लिए संभव है। 34 इस प्रकार, अत्यधिक monodisperse nanoparticle कोर थोक magnetoferritin नमूना से अलग किया जा सकता है। हालांकि, चुंबकीय सेल लेबलिंग के लिए के रूप में यहाँ प्रस्तुत यह आवश्यक नहीं है। magnetoferritin संश्लेषण की एक सीमा के बारे में 10% की अपेक्षाकृत कम संश्लेषण उपज, और वाणिज्यिक APO-फ़े के अपेक्षाकृत उच्च लागत हैrritin समाधान। हालांकि, ए पी ओ-ferritin भी सस्ते में उपलब्ध घोड़ा तिल्ली स्थापित de-खनिज प्रोटोकॉल का पालन करके ferritin से तैयार किया जा सकता है। 16

(घोड़ा तिल्ली ferritin के अमीनो एसिड अनुक्रम के आधार पर गणना) magnetoferritin की Cationization DMPA के 250 अणुओं और प्रति नकारात्मक आरोप लगाया अवशेषों ईडीसी के 50 अणुओं की एक दाढ़ अनुपात जोड़कर हासिल की थी। प्रोटीन से अधिक अभिकर्मक के इस अतिरिक्त उच्च cationization क्षमता, तुलनीय भी पहले ferritin के cationization के लिए परिणाम की सूचना दी करने में हुई। 35 MALDI-TOF विश्लेषण, apoferritin और cationized apoferritin लिए magnetoferritin कोर के अत्यधिक आणविक जन की वजह से किया गया था। उच्च क्षमता cationization उपज करने के लिए, इष्टतम पीएच भी महत्वपूर्ण है। ईडीसी की मध्यस्थता crosslinking हल्का अम्लीय परिस्थितियों में सबसे अधिक प्रभावी है, और हमने पाया कि पीएच 5 झुकेंगे magnetoferritin के लिए इष्टतम cationization का परिणाम है। हालांकि, अन्य प्रोटीन सी के लिएationization पीएच अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। पर Cationization या प्रोटीन की समविद्युतविभव बिंदु के करीब है, बचा जाना चाहिए क्योंकि यह गंभीर वर्षा हो सकती है।

cationized magnetoferritin के साथ स्टेम सेल संस्कार अत्यधिक कुशल था और ऊष्मायन बार अच्छी तरह से नीचे 30 मिनट का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। यहां तक ​​कि एक एक मिनट ऊष्मायन 3.6 पीजी, जो प्रभावित करने के लिए एमआरआई के लिए टी 2 और टी 2 * इसके विपरीत आवश्यक सूचना दी सीमा के भीतर है की एक सेलुलर लौह सामग्री में हुई। 36,37 यह भी है कि इस कुशल लेबलिंग कम बाह्य लोहे की सांद्रता के साथ हासिल की है उल्लेखनीय है। उदाहरण के लिए, ऋणात्मक नैनोकणों का उपयोग कर पिछले अध्ययनों 5 मिमी लोहे के साथ एक 30 मिनट ऊष्मायन अवधि के बाद सेल प्रति 10 पीजी के लोहे के स्तर की रिपोर्ट। 38 तुलना में, एक cationized magnetoferritin 0.5 माइक्रोन के प्रोटीन युक्त समाधान के साथ ऊष्मायन लगभग 0.2 मिमी लोहे के साथ ऊष्मायन से मेल खाती है और यह भी सेल प्रति लोहे के लगभग 10 पीजी पैदावार30 मिनट के बाद एल। हम स्पष्ट रूप से मंदिर का उपयोग किसी भी endocytotic पुटिकाओं पहचान करने में सक्षम नहीं थे। हालांकि, cationized ferritin का उपयोग कर पिछले अध्ययनों में पाया गया कि internalization जोखिम के पहले दस मिनट के भीतर हुई। 39,40 Cationized ferritin लेपित पुटिकाओं, clathrin- या caveolin निर्भर endocytosis का संकेत में अनुवादित किया जा सकता है। एक ही अध्ययनों से यह भी खबर दी है कि ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद, cationized ferritin अभी भी कोशिका की सतह पर मौजूद है, साथ ही Multivesicular निकायों में लाइसोसोम जैसी थी।

आगे अनुप्रयोगों APO-ferritin पिंजरों में इस तरह के कैंसर रोधी दवाओं 41 या 42 क्वांटम डॉट्स के रूप में अन्य नैनोकणों और / या कार्यात्मक अणुओं के साथ लोड की cationization शामिल हो सकते हैं। इन ferritin निर्माणों की Cationization कोशिकाओं को उनके माल की तेजी से और अधिक कुशल वितरण में हो सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific BPE310-1 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleen Sigma Aldrich A3641 we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate  Sigma Aldrich C6768 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate  Sigma Aldrich F1543 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%) Sigma Aldrich 216763 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrate Sigma Aldrich S1804 powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micron Merck Millipore SLGP033RS syringe filter
Trizma base Sigma Aldrich T1503 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chloride Sigma Aldrich 31434 poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter units Merck Millipore 4310 Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis Merck Millipore UFC801024 Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml
ANX Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare 17-1287-04 we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column  GE Healthcare 17-1196-01 this column was bought ready packed
ÄKTA purifier system GE Healthcare 28406264
sample pump P-960 GE Healthcare 18-6727-00 load sample at a flow rate of 10 ml/min
automated fraction collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00
Bradford assay reagent Sigma Aldrich B6916 solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleen Sigma Aldrich F4503 prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) Sigma Aldrich 308110 CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E6383 keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) AppliChem A0689,0500 powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membrane Sigma Aldrich D9652 soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose Sigma Aldrich D5546 warm in 37 °C water bath before use
fetal bovine serum Sigma Aldrich F7524 add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solution Sigma Aldrich P0781 add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
glutamax solution Gibco 35050-087 add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
human fibroblast growth factor PeproTech 100-18B add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml
phosphate buffered saline Sigma Aldrich D8537 sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solution Sigma Aldrich E5134 keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E5134 powder; make a 2 mM solution in PBS 
bovine serum albumin Sigma Aldrich A7030 add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand  Miltenyi Biotec 130-042-303 for attachment of MACS magnet
MACS MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-102 can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filter Miltenyi Biotec 130-041-407 30 mm filter
Nitric acid solution, 64-66% Sigma Aldrich 7006
Titrando 907, syringe pump Metrohm 2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5 Molecular Devices Used to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EX JEOL Used for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometer Renishaw Used for Raman spectroscopy
Torus DPSS laser Laser Quantum Used for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtreme Applied Biosystems Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZS Malvern Instruments Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement System Quantum Design Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom Skyra Siemens Used to determine longitudinal and transverse relaxivity 
Tecnai 12 BioTwin Spirit FEI Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OES Agilent Used to determine iron content in cells

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 118 magnetoferritin चुंबकीय नैनोकणों प्रोटीन पिंजरे cationization सतह functionalization चुंबकीय लेबलिंग चुंबकीय सेल जुदाई स्टेम सेल
प्रकोष्ठों के अल्ट्रा फास्ट आकर्षण संस्कार के लिए Cationized Magnetoferritin के संश्लेषण
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Correia Carreira, S., Armstrong, J.… More

Correia Carreira, S., Armstrong, J. P. K., Okuda, M., Seddon, A. M., Perriman, A. W., Schwarzacher, W. Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells. J. Vis. Exp. (118), e54785, doi:10.3791/54785 (2016).

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