Abstract
Immunoassays werden verwendet, um Proteine zu detektieren basierend auf dem Vorhandensein von assoziierten Antikörpern. Aufgrund ihrer umfangreichen Einsatz in Forschung und klinischen Umgebungen kann eine große Infrastruktur von Immunoassay Instrumenten und Materialien zu finden. Beispielsweise 96- und 384-Well-Polystyrol-Platten sind kommerziell erhältlich und haben eine Standard-Design-ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektroskopie Maschinen verschiedener Hersteller aufzunehmen. Darüber hinaus ist eine Vielzahl von Immunglobulinen, Nachweis-Tags, und Blockierungsmittel für individuelle Immunoassay Designs wie enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) zur Verfügung.
Trotz der bestehenden Infrastruktur, Standard-ELISA-Kits erfüllen nicht alle Forschungsbedarf und erfordert individualisierte Immunoassay-Entwicklung, die teuer und zeitaufwendig sein kann. Zum Beispiel haben ELISA-Kits niedriger Multiplexen (Nachweis von mehr als einem Analyten in einer Zeit) -Funktionen, wie sie üblicherweise auf Fluoreszenz oder col hängenorimetric Methoden für die Erkennung. Kolorimetrische und fluoreszenzbasierte Analysen haben Multiplexierungsfähigkeiten aufgrund breiten spektralen Spitzen begrenzt. Im Gegensatz dazu ist die Raman-Spektroskopie-basierte Methoden haben eine viel größere Fähigkeit zum Multiplexen aufgrund enger Emissionsspitzen. Ein weiterer Vorteil der Raman - Spektroskopie ist , dass Raman - Reporter erfahren deutlich weniger Photobleichens als Fluoreszenzmarkierungen 1. Trotz der Vorteile, die Raman-Reporter haben über fluoreszierende und kolorimetrische Tags, um Protokolle herzustellen Raman-basierte Immunoassays begrenzt sind. Der Zweck dieser Arbeit ist es, ein Protokoll zu schaffen, funktionalisierte Sonden herzustellen in Verbindung mit Polystyrol-Platten für den direkten Nachweis von Analyten durch UV-Vis-Analyse und Raman-Spektroskopie verwendet werden. Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, für die zukünftige Multi-Analyt-Detektion ein Do-it-yourself-Ansatz zu nehmen, während auf bereits etablierte Infrastruktur Kapital.
Introduction
Typische Sandwich-Immunoassays Erkennung indirekt die Anwesenheit eines Antigens unter Verwendung zweier Antikörper. Der Capture-Antikörper an eine feste Oberfläche gebunden und bildet einen Antikörper-Antigen-Komplexes, wenn sie in der Nähe einer geeigneten Antigen. Ein Detektionsantikörper wird dann eingeführt und bindet an das Antigen. Die Antikörper / Antigen / Antikörper - Komplex bleibt nach dem Waschen, und wird von dem markierten Nachweisantikörper nachgewiesen , wie in 1A gezeigt. Typische Nachweis wird durch einen fluoreszierenden oder kolorimetrischen Detektor durchgeführt, Multiplexing zu 10 Analyten aufgrund breiten spektralen Peaks 2,3 zu begrenzen. Im Gegensatz dazu haben Raman-basierten Systemen viel schmalere Emissionspeaks was zu verbesserten Multiplexierungsfähigkeiten mit Quellen beanspruchen simultanen Nachweis von bis zu 100 Analyte 2,3.
Viele Literaturquellen zur Verfügung , die wichtige Aspekte im Zusammenhang decken Immunoassays 4 - 6 wie Schritt- für -SchrittDetails personalisierte ELISA-Kits zu erstellen. Leider sind diese Protokolle für fluoreszierende oder kolorimetrische Detektion, Multiplexing-Fähigkeit von kundenspezifischen Immunoassays begrenzen. Um diesem Bedarf zu begegnen, stellen wir ein detailliertes Verfahren der UV-Vis / Raman - Immunoassay vorher 7 für einen direkten Immunoassay veröffentlicht herzustellen , wie in 1B dargestellt.
Dieses Protokoll umfasst die Herstellung von funktionalisierten Goldnanopartikel-basierten Sonden, die in 2 dargestellt. Das Verfahren für die Raman / UV-Vis - Sonden zu machen beginnt durch Bindung Raman Reporter an der Oberfläche der Gold - Nanopartikel (AuNPs). Die AuNPs werden dann mit Antikörpern, die mit funktionalisierten Polyethylenglykol (PEG) verbunden sind. Verbleibende Bindungsstellen auf den AuNPs werden durch Bindung Methoxypolyethylenglykol thiol (mPEG-SH) zu AuNPs blockiert nachfolgende unspezifische Bindung während der Analyse zu verhindern. Die hergestellten AuNP Sonden werden durch die Bindung an Antigene getestetwie dargestellt in Figur 1B zu den Vertiefungen einer Polystyrolplatte fixiert. Nach dem Waschen der Platte werden die AuNP Sonden unter Verwendung von UV-Vis-Spektroskopie, während die zugehörigen Raman-Reporter mit Raman-Spektroskopie detektiert werden. Die Kombination von UV-Vis und Raman-Spektraldaten bietet zwei Methoden von Analysen, die Fähigkeiten dieses Immunoassays zu verbessern.
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Protocol
1. Herstellung von Puffern
- Phosphat - gepufferte Saline (PBS)
- Verdünnen Sie 50 ml 10x PBS mit 450 ml HPLC-Wasser, um eine 1x PBS Konzentration machen. Sterilfilter die Lösung mit einem 0,22 um-Filter.
- Shop-Lösung bei Raumtemperatur.
- Herstellung von Tris Buffered Saline + Tween 20 (TBST)
- Verdünnen Sie 50 ml 10x Tris-gepufferte Salzlösung (TBS) mit 450 ml HPLC-Wasser, um eine 1x Konzentration machen. Hinzufügen 250 ul Tween-20 für eine 0,05% (v / v) Tween-20. Sterilfilter die Lösung mit einem 0,22 um-Filter.
- Bei Raumtemperatur lagern.
- Herstellung von humanem Serumalbumin (HSA) Blocking Solution
- Man wiegt 0,45 g HSA in 15 ml steril filtriert 1x PBS mit 3% w / v HSA-Lösung zu machen. Vortex-Lösung bis HSA vollständig aufgelöst ist.
- Store HSA-Lösung bei 4 ° C.
HINWEIS: Rinderserumalbumin(BSA) kann auch als Blockierungslösung verwendet werden.
- Herstellung von PEGylierten Antikörpers (PEG-Ab) Lösung
HINWEIS: Die Antikörperlösung muss frei sein von Träger- oder Stabilisierungs Proteine wie BSA, das mit Konjugationsreaktionen durch Konkurrieren für die n-Hydroxysulfosuccinimid (NHS) Bindungsstellen stören würde. Wenn der Antikörper in einer Lösung, Tris- oder Glycin-Puffer kommt, muss es einen Pufferaustausch zu verhindern, Amine oder Ammoniumsalze von störenden mit dem NHS Konjugationsreaktion unterziehen. Wenn der Antikörper in lyophilisierter Form vorliegt, kann es entsprechend den Empfehlungen des Herstellers in einer Konzentration von 1-10 mg / ml resuspendiert werden.- Für Antikörper in einem Puffer Tris oder Glycin, führen Sie einen Pufferaustausch zu 100 mM Natriumbicarbonat eine Entsalzungs Spalte. Verwenden Sie die 100 mM Puffer, um den pH-Wert auf etwa 8,5 zu erhöhen, die Konjugationsreaktion zu beschleunigen.
- Hydrats ortho-Pyridyldisulfid-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) mit 100 mM sVerhasstheit Bicarbonat auf ein Volumen von 1 ml bei einer Konzentration von 1 mg / ml oder mehr.
HINWEIS: OPSS-PEG-NHS frisch hergestellt und innerhalb von etwa 20 Minuten verwendet werden soll. Die NHS-Gruppe auf dem OPSS-PEG-NHS hat eine Halbwertszeit von etwa 20 min in einer wässrigen Lösung bei pH 8,5. - Hinzufügen, OPSS-PEG-NHS zu der Antikörperlösung in einem 2: 1-Verhältnis (PEG: Antikörper) conjugation Verhältnis für die Testproben verwendet werden. 1 Konjugation Verhältnis verwendet werden für die Steuerung: In einem separaten Reaktionsgefäß, OPSS-PEG-NHS an das Antigen-Lösung bei einer 2 hinzuzufügen.
HINWEIS: Das Verhältnis 2: 1 wird eine 50% ige Konjugation Effizienz annimmt. Das Ziel ist es, jeden Antikörper mit einer PEG-Kette zu beschriften. In diesem Schritt über Kennzeichnung besser ist als unter Kennzeichnung. Verwenden Sie die folgende Gleichung die entsprechenden Volumina OPSS-PEG-NHS und Antikörper-Lösung zu bestimmen:
wobei V Volumen ist, C - Konzentration in Molekülen oder ein exprimiertestibodies pro ml. Subscripts PEG und Ab sind OPSS-PEG-NHS und Antikörper, respectively. Das Endvolumen sollte ungefähr 250 & mgr; l sein. - Inkubieren PEG-Ab-Lösung bei 4 ° C für 8 Stunden oder über Nacht. Shop-Lösung in Teilmengen von etwa 25 & mgr; l bei -20 ° C arbeiten, um die Gefrier-Auftau-Zyklen zu begrenzen und sicherstellen, dass niedrige Bindungs Rohre zu verwenden.
2. Bereiten Sie UV-Vis / Raman-Sonden
- Bereiten nackten AuNP Lösung
- Bereiten Sie eine 2 ml Lösung von AuNPs mit einer Konzentration von etwa 1 x 10 11 Partikel pro ml.
- Wenn die AuNPs konzentriert werden müssen, füllen geringe Bindungszentrifugenröhrchen mit 2000 ul Lager AuNP und Zentrifuge bei 5000 × g für 20 Minuten oder bis der Überstand klar ist. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, wobei darauf geachtet, nicht die AuNP Pellet zu stören.
- Kombinieren Sie die restlichen AuNP Lösungen in ein Rohr und schätzen die Konzentration durch ein UV-Vis-Messung erhalten und Werte zu bekannten Konzentrationen verglichen, da dies eine lineare Beziehung ist.
- Bereiten Sie eine 2 ml Lösung von AuNPs mit einer Konzentration von etwa 1 x 10 11 Partikel pro ml.
- Bestimmen Sie die entsprechenden Raman - Reporter Markierungsverhältnis
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung des Reporters Raman in Methanol gelöst. Diese Konzentration wird auf dem Reporter verwendet abhängig sein. In dieser Arbeit vorbereiten 3,3'-diethylthiatricarbocyanine Iodid (DTTC) bei einer Arbeitslösung von 200 & mgr; M.
- Unter der Annahme, auch um ein Endvolumen von 100 & mgr; l für jede fügen genug von der Arbeits reporter Lösung in jede Vertiefung der ersten Reihe einer 96-Well-Platte, so daß der Reporter Raman wird in Konzentrationen von 0,2 uM bis 10 uM reichen. Fügen Sie genug HPLC-Wasser zu jeder Vertiefung, so dass das Volumen 80 ul ist. In 20 ul AuNP in jede Vertiefung ein endgültiges Volumen von 100 & mgr; l für jede Vertiefung zu machen. Ein Beispiel ist in Tabelle 1 bereitgestellt.
- Messen der UV-Vis-Spektren von 400 bis700 nm eine Platte-Lese UV-Vis-Spektralphotometer mit. Die geeignete Konzentration ist die höchste Konzentration mit definierten Peaks für die UV-Vis-Spektren. Wiederholen Sie Schritt 2.2.2 bei Konzentrationen bis zur höchsten Konzentration Verhältnis der Raman-Reportern zu AuNPs gefunden zunimmt.
HINWEIS: Der Farbstoff und die AuNP Form, Grße und Hersteller beeinflussen die geeignete Konzentration. Daher aufgeführten Schritte müssen in Abhängigkeit von den verwendeten Komponenten ausgewertet und verändert werden. Dieses Protokoll beinhaltete die Verwendung eines positiv geladenen Farbstoff. Als solches wurde zwischen dem AuNP und Reporterbindungs verbessert durch negativ geladene AuNPs verwenden. Dies wurde unter Verwendung von Citrat capped AuNPs getan. Siehe die Diskussion Abschnitt für weitere Details.
- Raman - Bindung Reporter und PEG-Ab zu AUNP
- Bereiten zwei 1,5 ml Chargen AuNP und Raman Reporter an der zuvor bestimmten Konzentration, so dass die Raman-Reporter für 30 min bei Raumtemperatur an die AuNPs zu binden.
- Fügen Sie den PEGylierten Antikörper (PEG-Ab) zu einer Charge des AuNP und Raman-Reporter-Lösung mit einer 200 zu erstellen: 1-Verhältnis von Antikörpern gegen Partikel. Diese Lösung wird für die Testproben sein. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen, fügen das pegylierte Antigen zur anderen Charge des AuNP und Raman-Reporterlösung bei einem 200: 1-Verhältnis von Antikörper an Partikel als Kontrolle verwendet werden. Inkubieren der Lösung für 30 min bei Raumtemperatur.
ANMERKUNG: Das Verhältnis von Antikörper zu Partikeln werden den AuNPs spezifisch sein und verwendete Farbstoff und sollte für jeden Einzelfall optimiert werden. Das Ziel hier ist das höchste Verhältnis von Antikörpern zu haben, für die AuNP Sonden zu binden, während eine Aggregation der Partikel zu verhindern. Verwenden Sie die folgende Gleichung die entsprechenden Volumina zu bestimmen hinzuzufügen zusammen:
wobei V Volumen ist, C - Konzentration in Teilchen oder Antikörper pro ml ausgedrückt. Die Flosseal Volumen sollte etwa 1,5 ml betragen.
- Block verbleibenden Stellen auf der Oberfläche AuNP mit mPEG-SH.
- Bereiten Sie mPEG-SH durch Auflösen von festem Methoxypolyethylenglykol Thiol zu einem 200 & mgr; M Konzentration mit Wasser. Vortexen der Lösung, bis mPEG-SH vollständig gelöst ist.
- In mPEG-SH bei 40.000: 1-Verhältnis zu dem AuNP-PEG-Ab-Lösung in Schritt 2.3 hergestellt. Inkubieren der Lösung bei Raumtemperatur für 10 min die restlichen Stellen auf der Gold-Nanopartikel, um sicherzustellen, blockiert sind. Verwenden Sie die folgende Gleichung die entsprechenden Volumina zu bestimmen hinzuzufügen zusammen:
wobei V Volumen ist, C - Konzentration in Teilchen oder Antikörper pro ml ausgedrückt. Das Endvolumen sollte etwa 1,5 ml betragen.
- Recover funktionalisierte Raman - Sonden.
- Centrifuge Partikel bei 5000 × g für 20 min in niedrigen binden centrifuge Rohre oder bis der Überstand klar ist. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren vorsichtig nicht die AuNPs zu stören.
- Resuspendieren der Partikel mit 1 ml 1x PBS-Lösung, die zuvor hergestellt wurde. Schätzen Sie die AuNP Konzentration durch ein UV-Vis-Messung eines kleinen Volumens von Lösung (3 & mgr; l) unter und vergleichen die Ergebnisse auf Messungen von einer bekannten AuNP Konzentration. Die Lautstärke anpassen , so daß die endgültige Lösung , die mindestens 1 x 10 11 Partikel pro ml ist.
- Store Lösungen bei 4 ° C bis es zur Funktionalisierung des Immunoassays Platte verwendet. Verwenden Sie die Lösungen innerhalb einer Woche.
| Volumes jeder Komponente hinzuzufügen (ml) | |||
| DTTC Endkonzentration (mM) | DTTC Arbeitslösung (200 mM) | AuNP | Wasser |
| 0,2 0,1 | 20 | 79.9 | |
| 0,6 | 0,3 | 20 | 79,7 |
| 1 | 0,5 | 20 | 79.5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77.5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76.5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
Tabelle 1. DTTC Verdünnung Beispiel. Verschiedene Verdünnungen von DTTC und die damit verbundenen Volumina Lager DTTC, Gold - Nanopartikel - Lösung und Wasser.
3. Immunoassay Plattenvorbereitung
- Binden Sie gewünschtes Antigen zu dem Immunoassay - Platte.
- Bereiten Sie genügend verdünnt Antigen (50 ug / ml), um die Polystyrol-Brunnen zu füllen. Vortex die Lösung,und sofort die Lösung für die Plattenvertiefungen hinzufügen. Ermöglichen das Antigen an die Platten für 1 Stunde bei Raumtemperatur zu binden.
- Waschen Sie die ungebundenen Antigene.
- Entfernen Sie die überschüssige Antigen-Lösung durch Lösung in einen Entsorgungsbehälter Dumping und die Platte gegen ein Papiertuch bedeckten Tisch zu schlagen.
- Hinzufügen TBST zu den Vertiefungen um die Oberfläche zu waschen dann die Wäsche in der gleichen Art und Weise zu entfernen, wie zuvor angegeben. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.
- Block verbleibenden Bindungsstellen auf der Platte nicht-spezifische Bindung zu verhindern.
- Hinzufügen 70 ul HSA Blockierungslösung in jede Vertiefung der Platte und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen und spülen Sie die Platte nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.2 festgelegt. Decken Sie die Platte und trocken lagern bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Funktionalisieren Immunoassay - Platte.
- In 70 ul tSonde er Nanopartikel hergestellt in Abschnitt 2 auf die erste Säule einer 96-Well-Platte und verdünnen nachfolgenden Spalten unter Verwendung eines 1: 2 Verdünnungsreihe. Das Feinblech für mindestens 1 h inkubiert. Ein Beispiel, wie die Immunoassay - Platte herzustellen ist in Abbildung 3 angegeben.
- Waschen Sie die Platte mit TBST fünfmal wie in den Schritten 3.2 detailliert, um sicherzustellen, entsprechend der AuNPs zu entsorgen. Nach dem letzten Waschen, fügen Sie in jede Vertiefung 70 ul 1x PBS und Deckel mit einem Plattendichtung.
HINWEIS: Die Kontrollproben sollte klar sein. Wenn die nichtspezifische Bindung aufgetreten ist, besitzen die Kontrollproben eine ähnliche Farbe wie die Testproben.
- Test Testempfindlichkeit durch UV-Vis - Spektroskopie und Raman.
- Für jeden gut, messen Sie die UV-Vis-Spektren von 400 bis 700 nm im Bereich unter Verwendung eines Plattenlese UV-Vis-Spektralphotometer.
- Unter Verwendung eines invertierten Mikroskops Raman, fokussieren das Objektiv auf die Oberfläche der Vertiefung, die die AuNP Sonden aufweist. ObTain ein Raman-Spektren des Brunnens. Sammeln Sie ein Spektrum von 1.800 cm im Bereich von -1 bis 400 cm -1. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Vertiefungen.
- Unter Verwendung eines geeigneten spektralen Software, führen Sie eine 11 - ter Ordnung Polynom Basislinienkorrektur für die Raman - Spektren und 3. Ordnung Polynom für die UV-Vis - Spektren.
- Unter Verwendung eines geeigneten spektralen Software, normalisieren die Raman- und UV-Vis-Spektren. Stellen Sie den Maximalwert auf 1 und skaliert entsprechend alle anderen Werte. Um die Raman-Spektren normalisieren, wählen Sie eine eindeutige Polystyrol Spitze und setzte es gleich 1 und skaliert entsprechend alle anderen Werte.
- Unter Verwendung eines geeigneten spektralen Software, führen Peak-Integration für jedes Spektrum. Für Raman-Spektren, müssen in einem Bereich fehlt Polystyrol Peaks werden der Peak der Raman reporter darstellt. Um Peak-Integration durchzuführen, geben Sie die Integralgrenzen für die gewünschte Spitze und notieren Sie die gewünschte Spitzenbereich für alle Proben einschließlich der Kontrollen.
- Plot die durchschnittliche Peakfläche von Interesse als eine Funktion des Logarithmus der Konzentration AuNP mit Fehlerbalken für jeden Punkt seiner zugehörigen Standardabweichung angibt. Setzen Sie diese Kalibrierungspunkte auf eine 4-Parameter logistischen Kurve.
- Bestimmen Sie den Mittelwert des Rohlings durch die Fläche des Peaks von Interesse für eine Blindprobe gemittelt werden. Bestimmen Sie die Standardabweichung dieser Gebiete; Dies ist die Standardabweichung des Rohlings.
- Für den gleichen Peak in dem vorherigen Schritt analysiert, finden die Standardabweichung dieser Peakfläche für die niedrigste Konzentration.
- Berechnen Sie die Grenze des Rohlings und untere Nachweisgrenze, wie in der repräsentativen Ergebnisse Abschnitt angegeben. Verwenden Sie diese Werte mit den 4PL Kalibrierungskurven, die untere Nachweisgrenze in Bezug auf AuNP Konzentration zu bestimmen.
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Representative Results
In dieser Studie wurden 60 nm Goldpartikel wurden für UV-Vis-Spektroskopie verwendet. UV-Vis - Absorptionsspektren von 400 bis 700 nm gesammelt wurden und die Peakflächen für jede AuNP Konzentration Spektralanalyse - Software 8 eine Open - Source wurden ermittelt. Vor Integration zu Peak wurde das gesammelte Spektren Basislinienkorrektur ein Drei-Punkt-Polynomfit verwenden. Peakflächen wurden verwendet , um eine logarithmische Kalibrierungskurve zu erzeugen , wie in Figur 4 gezeigt. Es ist zu beachten , dass die 4 und 5 logarithmische Kalibrierungskurven aufgenommen. Die Verwendung von nicht-linearen Kalibrierungskurven deutlich den Dynamikbereich eines Assays zu erweitern und hat eine akzeptierte Praxis für verschiedene Immunoassays werden , die Erkennung niedrigen Bereich Fähigkeiten erfordern 9,10.
Quantitativ die Empfindlichkeit des Assays zu bewerten, die Grenze des Rohlings (LOB) unddie untere Nachweisgrenze (untere Nachweisgrenze) wurde wie folgt berechnet 
wo Standardabweichung des Zuschnitts und der niedrigsten Probenkonzentration ist σ BLANK und σ Low, beziehungsweise, während 
ist der Mittelwert des Rohlings 11,12. Unter Verwendung dieser Definitionen sowie die erzeugte 4-Parameter-logistische Kalibrierungskurve, die untere Nachweisgrenze für die UV-Vis war 3.05 von Goldnanopartikeln.
Mit Hilfe wurde ein Raman - Spektroskopie - Setup detailliert zuvor 7, eine 785 nm invertiert Raman - Mikroskop mit dem funktionalisierten Immunoassay Platte verbunden zu sammeln Spektren aus dem DTTC Raman - Reporter verwendet. Die Betriebsparameter inklusive 7 mW Laserleistung und eine 10 sec acwerb Zeit. Spektren unterzog Basislinienkorrektur (11 - ter Ordnung Polynom) und Peakintegration. 5 zeigt die 4-Parameter - logistische Kurve Kalibrierung für die DTTC erzeugten Peakflächen für die 493 cm -1 und 508 cm -1 DTTC Spitzen. Da die genaue Konzentration der Reporter Raman zur AuNP gebundenen Oberfläche unbekannt war, wurde die Kalibrierungskurve basierend auf AuNP Konzentration. Unter Verwendung der oben beschriebenen Gleichungen wurde die untere Nachweisgrenze bestimmt 1.07 von AuNP zu sein.
Abbildung 1. Abbildung der direkten und indirekten Immunoassay - Analyse. Abbildung der indirekten (A) und direkte (B) Nachweisschemata für Immunoassays. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Nanoparticle Sonde Herstellung Illustration. Verfahren zur Funktionalisierung von Raman / UV-Vis - Sonden für Immunoassays. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bitte klicken Sie hier eine viel größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Vorbereitete Immunoassay Platte. Das Bild einer vorbereiteten Immunoassay Platte. Die Reihen A bis E sind Tests Proben während Reihen F bis H Kontrollproben sind. Spalte 1 enthält die unverdünnt Nanopartikel und jede nachfolgende Spalte hat die Hälfte der Konzentrationvon AuNP Sonden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. UV-Vis Kalibrierungskurve für einen Immunoassay unter Verwendung von Nanopartikel - Sonden. Logarithmische Kalibrierungskurve für die UV-Vis - Peakflächen auf Nanopartikelkonzentration. Die angepassten Linie ist ein 4-Parameter Logistik (4PL) Kurve. Fehlerbalken zeigen den Spitzenbereich Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bitte klicken Sie hier eine viel größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Raman - Kalibrierungskurve für einen Immunoassay unter Verwendung von Nanopartikelsonden. Kalibrierungskurve korreliert Raman - Reporter Peakfläche zu Gold - Nanopartikel - Konzentration. Die angepassten Linie ist ein 4-Parameter Logistik (4PL) Kurve. Fehlerbalken zeigen den Spitzenbereich Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bitte klicken Sie hier eine viel größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In dem detaillierten Protokoll gibt es mehrere kritische Punkte abdecken. Ein Problem ist die Wahl der Raman-Reporter und Gold-Nanopartikel. Obwohl das Protokoll für den individuellen Gebrauch angepasst werden geschrieben wurde, wurde das Raman-Reporter DTTC als Beispiel verwendet. DTTC eine positiv geladene Reporter und bindet an negativ geladenen Oberflächen, wie Citrat capped AuNPs. Dieses Protokoll kann mit einer positiven Oberflächenladung durch Verwendung von Gold-Nanopartikeln für negativ geladene Reporter angepasst werden. Zum Beispiel Polyethylenimin (PEI) mit einer Kappe bedeckt AuNPs bieten eine positive Oberflächenladung und eine bessere Bindung mit negativ geladenen Reportern.
Die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen Proteinen und Nanopartikel ist ein kritischer Schritt dieses Protokolls. Dieses Gleichgewicht wird durch Zugabe von PEGylierten Antikörper mit einer optimierten Antikörper an Gold-Nanopartikel-Verhältnis von 200: 1 erreicht. Wenn die PEGylierten Antikörper bei einer deutlich höheren Verhältnis als thi an die Gold-Nanopartikel-Lösung versetzts, ioneninduzierten Teilchenaggregation auftreten. Alternativ kann bei einer zu geringen eines Verhältnisses, Protein-Aggregation und Unlöslichkeit auftreten würde. Dieses Verhältnis muss in jedem Einzelfall festgelegt werden.
Ein weiterer kritischer Protokollschritt ist die Konjugation von OPSS-PEG-NHS an den Antikörper. Dieser Schritt wird mit vorangestelltem OPSS-PEG-NHS in Natriumbicarbonat suspendiert, wo die NHS-Gruppe an den Antikörper bindet. Diese Konjugation Schritt konkurriert mit der Reaktion ungünstigen Hydrolyse wie zuvor 7 beschrieben. Die Hydrolysereaktion wird eher über die Zeit zu passieren, und als solche, die OPSS-PEG-NHS an Antikörperbindung sollte sofort durchgeführt werden.
Das Endprodukt des Protokolls ist ein Immunoassay, der für die Empfindlichkeit durch Konstruktion einer Kalibrierungskurve unter Verwendung von UV-Vis-Spektroskopie und Raman getestet werden können. Die Ergebnisse zeigen , daß der Immuntest auf andere Bioassays vergleichbar ist 13 bis 17 , die Erfassungsgrenzen haben of 01.00. Nicht nur die Empfindlichkeit Immunoassay Raman wettbewerbsfähig mit anderen Bioassays, hat es das Potential für eine verbesserte Empfindlichkeit mittels oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS). SERS beinhaltet die Verwendung von Gold-Nanopartikeln oder einer aufgerauten Goldoberfläche der Raman-Emission zu verbessern. Da dieses Protokoll bereits die Verwendung von Gold-Nanopartikel-Sonden enthält, ist es gut für die Entwicklung zu einem SERS-Immunoassay. In Zukunft könnte diese Technik für die Entwicklung eines Lichtstreuungs-Immunoassay verwendet werden, die gleichzeitig viele Protein-Analyte verwendet werden könnten, zu detektieren. Als Biomarker Profilierung für die Diagnose und Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten immer wichtiger wird, kann diese Technik profunden klinischen Anwendungen haben.
Häufige Probleme in Verbindung mit diesem Protokoll umfassen Aggregation von Goldnanopartikeln, unzureichende Bindungsproteine der Blockierung, die Bindung von nicht-spezifischen Proteinen, und eine schwache Raman-Signal. Diese Probleme sindin Tabelle 2 aufgeführten zusammen mit der möglichen Ursache des Problems und Handlungsschritte jedes Problem zu lösen. Andere Probleme können aufgrund der Einschränkungen des Protokolls auftreten. Zunächst wird dieses Protokoll zu AuNP Konzentrationen bis zu 5 x 10 12 Partikel / ml begrenzt , da höhere Konzentrationen die Aggregation verursachen können. Die Technik beruht auf einer stabilen, nicht-aggregierten Nanopartikel zur Abschätzung der Nanopartikelkonzentrationen. Wenn es Aggregation ist, wird die Schätzung der Nanopartikelkonzentration vorgespannt sein. Das Protokoll wird auch mit Spitzen stark genug, um Raman-Reporter beschränkt das Polystyrol Hintergrund zu überwinden und sind einzigartig aus Polystyrol. Schließlich begrenzen die Verwendung von traditionellen 96-Well-Platten, das Protokoll eines invertierten Raman-Mikroskop zu verwenden, aufgrund der Höhe der Platten. Andernfalls muss ein geringer Vergrößerung für die Objektiv Raman Mikroskop verwendet werden, um die 96-Well-Platte Höhe aufzunehmen.
| Symptom | Wahrscheinliche Ursache | Korrekturmaßnahme |
| Gold-Nanopartikeln aggregieren nach Zentrifugation und Resuspension. | Die Raman-Reporter Konzentration ist zu hoch. | Testen Sie eine Reihe von Raman-Reporter-Konzentrationen, wie in Abschnitt 2.2 oder diesem Protokoll angegeben. |
| Der Antikörper gegen AuNP Verhältnis zu hoch ist. | Reduzieren Sie die Anzahl der PEGylierten Antikörper an der Oberfläche der Nanopartikel gebunden Partikelstabilität zu erhöhen. | |
| Die mPEG-SH Blockierungsmittel ist nicht bindend an die AuNP Oberfläche. | Bereiten Sie mPEG-SH-Lösung frisch vor der Nanopartikel Blockierung. | |
| Unspezifisch Immunoassay Plattenoberfläche Bindungs | Der Immunoassay Platte unzureichend blockiert. | Bereiten Lösung blockiert frisch vor Spaß an der Plattectionalization. |
| Das Molekulargewicht von mPEG-SH ist nicht groß genug. | Sicherzustellen, dass das mPEG-SH-Molekül verwendet zum Blockieren mit einem Molekulargewicht von 5000 kDa oder mehr aufweist. | |
| Schwache oder fehlende Raman-Signal | Die Raman-Reporter ist nicht bindend an die Partikeloberfläche. | Sicherstellen, dass die Raman-Reporter erlaubt wird mindestens 30 Minuten vor der Zugabe des PEGylierten Antikörpers zu binden. |
| Das Molekulargewicht von mPEG-SH ist nicht groß genug. | Stellen Sie sicher, dass das Nanopartikel Verkappungsmittel die geeignete Ladung für ionische Raman-Reporter zu binden. |
Tabelle 2. Fehlerbehebung für allgemeine Probleme. Liste der Störungen , welche während des Protokolls mit den dazugehörigen Ursachen und Abhilfemaßnahmen Artikel gestoßen.
In diesem Manuskript haben wir ap vorgestelltrotokoll für kundenspezifische Herstellung eines Nanopartikels-Sonde Immunoassay für die Analyse unter Verwendung von UV-Vis / Raman-Spektroskopie. Das Protokoll umfasst die Funktionalisierung von Gold-Nanopartikeln mit Raman-Reporter und Immunglobuline zur direkten Erfassung von auf eine Polystyrolplatte gebundene Antigene. Das Protokoll kann angepasst werden, um einen bestimmten Raman-Reporter und zugehörige Anregungswellenlänge zu entsprechen. Gold-Nanopartikel-Form und Größe können auch geändert werden. Allerdings Lösungs-Verhältnisse für eine angemessene Bindung wird entsprechend der Raman-Reporter variieren sowie die Nanopartikelgröße, Form und Hersteller verwendet. Das Protokoll wurde geschrieben Forscher, wann Lösungs-Verhältnisse zu spulen müssen für jedes einzelne Anordnung bestimmt werden und dadurch zu ermöglichen, für die individuelle Fertigung nach Forschungsbedarf. Im Gegensatz zu den typischen fluoreszierenden / kolorimetrischer Immunoassay-Protokolle, hält dieses Protokoll das Potenzial für größere Multiplexierungsfähigkeiten, während auf einer bereits bestehenden Infrastruktur Kapital.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 ml | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 | |
| In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/ (2004).
- ELISA development guide. , [Accessed: 28-Mar-2016] https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.effemm2.de/spekwin/ (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
