Abstract
Os imunoensaios são usados para detectar as proteínas com base na presença de anticorpos associados. Devido à sua ampla utilização na pesquisa e na clínica, uma grande infra-estrutura de instrumentos e materiais de imunoensaio pode ser encontrado. Por exemplo, 96 e 384 poços placas de poliestireno estão disponíveis comercialmente e têm um desenho padrão para acomodar máquinas de espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-VIS) de vários fabricantes. Além disso, uma grande variedade de imunoglobulinas, etiquetas de detecção, e os agentes de bloqueio para os desenhos de imunoensaio personalizadas, tais como ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) estão disponíveis.
Apesar da infra-estrutura existente, kits de ELISA convencionais não satisfazem todas as necessidades de pesquisa, o que requer o desenvolvimento de imunoensaio individualizado, o que pode ser caro e demorado. Por exemplo, kits de ELISA têm baixa multiplexação (detecção de mais do que um analito ao mesmo tempo) como capacidades que geralmente dependem de fluorescência ou colorimetric métodos para a detecção. Colorimétrico e análises fluorescentes baseados em ter capacidades de multiplexação devido a grandes picos espectrais limitados. Em contraste, os métodos baseados em espectroscopia Raman tem uma capacidade muito maior para a multiplexação devido a picos de emissão estreitas. Outra vantagem da espectroscopia Raman é que os repórteres Raman experimentar significativamente menos fotodegradação do que marcadores fluorescentes 1. Apesar das vantagens que os repórteres Raman têm mais de marcadores fluorescentes e colorimétricos, protocolos para fabricar imunoensaios baseados em Raman são limitadas. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para preparar sondas funcionalizadas para usar em conjunto com placas de poliestireno para detecção direta de analitos por análise de UV-Vis e espectroscopia Raman. Este protocolo permitirá aos investigadores ter uma abordagem do-it-yourself para a detecção futuro multi-analito enquanto capitalizando sobre a infra-estrutura pré-estabelecida.
Introduction
imunoensaios de sanduíche típicos indirectamente detectar a presença de um antigénio utilizando dois anticorpos. O anticorpo de captura está ligada a uma superfície sólida e forma um complexo anticorpo-antigénio quando em proximidade com um antigénio apropriado. Um anticorpo de detecção é então introduzida e liga-se ao antigénio. Após a lavagem, o anticorpo / antigénio / anticorpo e continua a ser complexo é detectada pelo anticorpo de detecção marcado, como demonstrado na Figura 1A. Detecção típica é feita por um detector fluorescente ou colorimétrico, o que limita a multiplexagem 10 substância a analisar devido aos picos largos espectrais 2,3. Em contraste, os sistemas baseados em Raman têm picos de emissão muito estreitos, resultando em capacidades de multiplexação reforçadas com fontes que reivindicam a detecção simultânea de até 100 analitos 2,3.
Muitas fontes bibliográficas estão disponíveis, que abrangem aspectos importantes relacionados com imunoensaios 4-6, como passo-a-passodetalhes para criar kits personalizados ELISA. Infelizmente, estes protocolos são para a detecção fluorescente ou colorimétrico, limitando a capacidade de multiplexação de imunoensaios personalizadas. Para atender a essa necessidade, apresentamos um procedimento detalhado para fabricar o UV-Vis / Raman imunoensaio publicado anteriormente 7 para um imunoensaio directo conforme ilustrado na figura 1B.
Este protocolo inclui a fabricação de sondas de nanopartulas de ouro baseia-funcionalizado, ilustrada na Figura 2. O procedimento para fazer as sondas / UV-Vis Raman começa pela ligação repórteres Raman para a superfície de nanopartículas de ouro (AuNPs). Os AuNPs são depois funcionalizadas com anticorpos que estão associadas com polietileno glicol (PEG). Os restantes locais de ligação no AuNPs são bloqueadas por ligação tiol metoxi polietileno glicol (mPEG-SH) para AuNPs para evitar a ligação não-específica subsequente durante a análise. As sondas AUNP preparadas são testada por ligação a antigéniosfixa-se aos poços de uma placa de poliestireno, tal como ilustrado na Figura 1B. Após lavagem da placa, as sondas AUNP são detectados utilizando espectroscopia de UV-Vis, enquanto os repórteres Raman associados são detectados com espectroscopia de Raman. Combinando os dados UV-Vis e Raman espectral fornece dois métodos de análise, reforçando as capacidades deste imunoensaio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de buffers
- Tampão fosfato salino (PBS)
- Dilui-se 50 ml de 10x PBS com 450 mL de água de grau HPLC para fazer uma concentração de 1 x PBS. Filtrar em condições estéreis a solução com um filtro de 0,22 um.
- Guardar a solução à temperatura ambiente.
- Preparação de solução salina tamponada TRIS + Tween 20 (TBST)
- Dilui-se 50 ml de 10x tampão salino Tris (TBS) com 450 ml de água de grau HPLC para fazer uma concentração 1x. Adicionar 250 ul de Tween-20 para uma 0,05% (v / v) de Tween-20. Filtrar em condições estéreis a solução com um filtro de 0,22 um.
- Armazenar em temperatura ambiente.
- Preparação de Albumina de Soro Humano (HSA) solução de bloqueio
- Pesar 0,45 g de HSA em 15 ml de PBS estéril filtrada 1x para fazer um 3% w / v de solução de HSA. solução de HSA Vortex até estar completamente dissolvido.
- Loja solução de HSA a 4 ° C.
NOTA: Albumina de Soro Bovino(BSA) também pode ser usado como uma solução de bloqueio.
- Preparação de anticorpo PEGuilado (PEG-Ab)
NOTA: A solução de anticorpo deve ser isento de transportador ou de estabilização de proteínas, tais como BSA, que possam interferir com reacções de conjugação competindo para o n-hidroxissulf (NHS) sítios de ligação. Se o anticorpo entra em uma solução de Tris ou tampão de glicina, ela deve ser submetida a uma permuta de tampão para evitar que as aminas ou sais de amónio de interferir com a reacção de conjugação NHS. Se o anticorpo está numa forma liofilizada, que pode ser novamente suspenso de acordo com a recomendação do fabricante, a uma concentração de 1-10 mg / ml.- Para os anticorpos em um tampão Tris ou glicina, realizar uma permuta de tampão de bicarbonato de sódio a 100 mM usando uma coluna de dessalinização. Utilizar o tampão 100 mM para aumentar o pH para aproximadamente 8,5 a acelerar a reacção de conjugação.
- Hidrato de orto-piridildissulfureto-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) com 100 mM soídio bicarbonato para um volume de 1 ml a uma concentração de 1 mg / ml ou maior.
NOTA: OPSS-PEG-NHS deve ser feita e usada dentro de aproximadamente 20 min. O grupo NHS do OPSS-PEG-NHS tem uma meia-vida de aproximadamente 20 min, numa solução aquosa a pH 8,5. - Adicionar OPSS-PEG-NHS para a solução de anticorpo a uma proporção 2: 1 (PEG: Anticorpo) proporção de conjugação para ser utilizado para as amostras de teste. Num tubo de microcentrífuga separados, adicionar OPSS-PEG-NHS para a solução de antigénio numa proporção de 2: 1 a conjugação a ser utilizado para o controlo.
NOTA: A proporção de 2: 1 está assumindo uma eficiência de 50% a conjugação. O objectivo é o de identificar cada anticorpo com uma cadeia de PEG. Nesta etapa, o excesso de rotulagem é melhor do que sob a rotulagem. Utilize a seguinte equação para determinar os volumes apropriados de OPSS-PEG-NHS e solução de anticorpo:
em que V é o volume, C é a concentração expressa em moléculas ou umtibodies por ml. Subscritos PEG e Ab são OPSS-PEG-NHS e anticorpo, respectivamente. O volume final deve ser de aproximadamente 250 ul. - Incubar solução de PEG-Ab a 4 ° C durante 8 horas ou durante a noite. solução de loja em alíquotas de aproximadamente 25 ul trabalhando a -20 ° C para limitar os ciclos de descongelamento congelamento e certifique-se de usar tubos de ligação baixas.
2. Prepare UV-Vis / Raman Sondas
- Preparar a solução AUNP nua
- Prepara-se uma solução de AuNPs 2 ml com uma concentração de aproximadamente 1 x 10 11 partículas por ml.
- Se os AuNPs precisa de ser concentrada, encher tubos de centrifugação de baixa ligação com 2.000 ul de estoque AUNP e centrifugar a 5000 xg durante 20 minutos ou até que o sobrenadante é clara. Retire o sobrenadante por pipetagem, tomando cuidado para não perturbar o pellet AUNP.
- Juntar as soluções AUNP restantes em um tubo e estimar a Concentração mediante a obtenção de uma medição de UV-Vis e comparando os valores de concentrações conhecidas como esta é uma relação linear.
- Prepara-se uma solução de AuNPs 2 ml com uma concentração de aproximadamente 1 x 10 11 partículas por ml.
- Determinar a proporção rotulagem repórter adequado Raman
- Preparar uma solução de trabalho do repórter de Raman dissolvido em metanol. Esta concentração irá ser dependente do repórter utilizada. Neste trabalho, preparar iodeto de 3,3'-diethylthiatricarbocyanine (DTTC) a uma solução de trabalho de 200? M.
- Assumindo um volume final de 100 uL de cada poço, adicione uma quantidade de solução de trabalho repórter a cada cavidade da primeira fileira de uma placa de 96 poços de modo a que o repórter Raman irá variar em concentrações de 0,2 uM a 10 uM. Adicionar água suficiente qualidade para HPLC a cada cavidade tal que o volume é de 80 ul. Adicionar 20 ul de cada poço AUNP para fazer um volume final de 100? L para cada cavidade. Um exemplo é apresentado na Tabela 1.
- Medir a espectros UV-Vis a partir de 400 a700 nm utilizando uma placa de leitura de UV-Vis. A concentração adequada é a concentração mais elevada com picos definidos para os espectros de UV-Vis. Repita o passo 2.2.2 em concentrações crescentes até o mais alto índice de concentração de repórteres Raman para AuNPs é encontrado.
NOTA: O corante e o AUNP forma, tamanho, e fabricante influenciar a concentração apropriada. Por conseguinte, os passos indicados devem ser avaliados e alterada, dependendo dos componentes usados. Este protocolo envolve a utilização de um corante com carga positiva. Como tal, a ligação entre o AUNP e repórter foi melhorada através da utilização AuNPs carregados negativamente. Isso foi feito através da utilização de citrato tampado AuNPs. Consulte a seção de discussão para mais detalhes.
- Encadernação repórter Raman e PEG-Ab para AUNP
- Preparar dois lotes de 1,5 ml AUNP repórter e Raman, na concentração previamente determinada, permitindo que o repórter Raman para se ligar aos AuNPs durante 30 min à temperatura ambiente.
- Adicionar o anticorpo PEGuilado (PEG-Ab) para um lote de solução repórter AUNP e Raman para criar um 200: 1 razão de anticorpos às partículas. Esta solução será para as amostras de teste. Num tubo de microcentrífuga separados, adicionar o antigénio PEGuilado para o outro lote da solução repórter AUNP e Raman de cada 200: 1 razão de anticorpo de partículas para ser utilizado como o controlo. Incubam-se as soluções durante 30 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: O rácio de anticorpos às partículas serão específicos para os AuNPs e corante utilizado e deve ser optimizada para cada caso individual. O objectivo aqui é o de ter a maior proporção de anticorpos para as sondas AUNP para se ligar a, evitando a agregação das partículas. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados para adicionar juntos:
em que V é o volume, C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. a barbatanavolume de al deve ser de aproximadamente 1,5 ml.
- Bloco restantes locais na superfície da AUNP com mPEG-SH.
- Prepare mPEG-SH por dissolução de sólido metoxi polietileno glicol tiol a uma concentração de 200 pM utilizando água. Vortex a solução até mPEG-SH está completamente dissolvido.
- Adicionar mPEG-SH num 40.000: 1 razão para a solução AUNP-PEG-Ab feita no passo 2.3. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 minutos para assegurar que os locais remanescentes no nanopartículas de ouro são bloqueados. Use a seguinte equação para determinar os volumes apropriados para adicionar juntos:
em que V é o volume, C é a concentração expressa em partículas ou anticorpos por ml. O volume final deve ser de aproximadamente 1,5 ml.
- Recuperar sondas Raman funcionalizados.
- partículas de centrifugar a 5000 xg durante 20 minutos em baixa de ligação centrifuge tubos ou até que o sobrenadante é clara. Retire o sobrenadante por pipetagem tomando cuidado para não perturbar os AuNPs.
- Ressuspender as partículas com 1 ml de solução de PBS 1x que foi feita previamente. Estimar a concentração AUNP por uma medição de UV-Vis de um pequeno volume de solução (3 mL) e comparar os resultados com as medições de concentração AUNP conhecido. Ajustar o volume de tal modo que a solução final é de pelo menos 1 x 10 11 partículas por ml.
- soluções armazenar a 4 ° C até que seja utilizado para a funcionalização da placa de imunoensaio. Use as soluções dentro de uma semana.
| Volumes a adicionar de cada componente (ml) | |||
| DCTC concentração final (mM) | Solução de trabalho de DTTC (200 mM) | AUNP | água |
| 0,2 0,1 | 20 | 79,9 | |
| 0,6 | 0,3 | 20 | 79,7 |
| 1 | 0,5 | 20 | 79,5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77,5 |
| 7 | 3,5 | 20 | 76,5 |
| 10 | 5 | 20 | 75 |
Tabela 1. DCTC exemplo diluição. Várias diluições de DCTC e os volumes associados de estoque DCTC, solução de nanopartículas de ouro e água.
3. Imunoensaio placa preparação
- Ligar o antigénio desejado para a placa de imunoensaio.
- Prepare antigénio diluído suficiente (50 ug / ml) para encher os poços de poliestireno. Vortex a solução,e adicione imediatamente a solução para os poços da placa. Permitir que o antigénio para se ligar às placas durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Lavar antígenos não ligados.
- Remover a solução com excesso de antigénio pelo dumping solução em um recipiente adequado e batendo a placa contra uma mesa de papel-coberto de toalha.
- Adicionar TBST aos poços para lavar a superfície, em seguida, remover a lavagem da mesma maneira como indicado previamente. Repita este passo mais duas vezes.
- Bloco restantes locais de ligação na placa para evitar a ligação não específica.
- Adicionar 70 ul de solução de bloqueio de HSA a cada poço da placa e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
- Remover e lavar a placa usando o mesmo procedimento, tal como especificado no passo 3.2. Cobrir a placa e seco para guardar a 4 ° C até que esteja pronto para uso posterior.
- Funcionalizar placa de imunoensaio.
- Adicionar 70 ul de tele sondar nanopartículas preparada na secção 2 para a primeira coluna de uma placa de 96 poços e diluir colunas subsequentes usando uma diluição de 1: 2 em série. Permitir que a placa a incubar durante pelo menos 1 h. Um exemplo de como preparar a placa de imunoensaio é dada na Figura 3.
- Lavar a placa com TBST cinco vezes, conforme detalhado nas etapas 3.2, certificando-se de dispor dos AuNPs adequadamente. Após a lavagem final, adicionar 70 ul de 1x PBS a cada poço e cobrir com um selo de placa.
NOTA: As amostras de controlo deve ser clara. Se tiver ocorrido a ligação não específica, as amostras de controlo terá uma cor semelhante à das amostras de ensaio.
- Teste de sensibilidade do ensaio por UV-Vis e espectroscopia Raman.
- Para cada poço, medir o espectro de UV-Vis que varia de 400 a 700 nm utilizando uma placa de leitura de UV-Vis.
- Utilizando um microscópio invertido de Raman, concentrar o objectivo para a superfície do poço que tem as sondas AUNP. obtain um espectro de Raman do bem. Recolhe um espectro variando de 1.800 cm-1 e 400 cm-1. Repita este passo para todos os poços.
- Usando um software de espectro adequado, executar uma ordem de correção de linha de base polinomial 11 th para os espectros Raman e uma polinomial de 3ª ordem para o UV-Vis.
- Usando um software de espectro adequado, normalizar o Raman e UV-Vis. Defina o valor máximo a 1 e escalar todos os outros valores em conformidade. Para normalizar os espectros Raman, selecione um pico de poliestireno única e defini-lo igual a 1 e escalar todos os outros valores em conformidade.
- Usando um software de espectro adequado, realizar a integração de pico para cada espectro. Para espectros de Raman, o pico representando o repórter Raman deve estar ausente numa região de picos de poliestireno. Para realizar a integração de pico, especifique os limites integrais para o pico desejado e gravar a área do pico desejado para todas as amostras, incluindo os controles.
- Plot a área média de pico de interesse como uma função do log da concentração AUNP com barras de erro para cada ponto indicando o seu desvio padrão associado. Encaixe estes pontos de calibração para uma curva logística de 4 parâmetros.
- Determinar o valor médio da peça em bruto através da média da área do pico de interesse para uma amostra em branco. Determinar o desvio padrão destas áreas; este é o desvio padrão da peça em bruto.
- Para o mesmo pico analisados na etapa anterior, encontrar o desvio padrão do que a área de pico para a concentração mais baixa.
- Calcular o limite do limite branco e inferior de detecção, conforme especificado na seção de resultados Representante. Use esses valores com as curvas de calibragem 4PL para determinar a LLOD em termos de concentração AUNP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neste estudo, 60 nm de partículas de ouro foram utilizados para a espectroscopia UV-Vis. UV-Vis espectros de absorção de 400 a 700 nm foram recolhidos e as áreas dos picos correspondentes a cada concentração AUNP foram determinados utilizando um software de análise espectral de fonte aberta 8. Antes de se atingir o pico de integração, os espectros recolhidos foram submetidos a correcção da linha de base utilizando um ajuste polinomial de três pontos. As áreas de pico foram usadas para gerar uma curva de calibração logarítmica, como demonstrado na Figura 4. Deve ser notado que as Figuras 4 e 5 incorporadas curvas de calibração logarítmica. O uso de curvas de calibração não-lineares podem expandir significativamente o alcance dinâmico de um ensaio e se tornou uma prática aceita para vários imunoensaios que requerem capacidades de detecção de gama baixa 9,10.
Para avaliar quantitativamente a sensibilidade do ensaio, o limite da peça em bruto (LPP) eo limite inferior de detecção (LLOD) foi calculada como se segue 
em que o desvio padrão da peça em bruto e da concentração da amostra menor é σ EM BRANCO e σ baixo, respectivamente, enquanto 
é o valor médio da peça em bruto 11,12. Utilizando estas definições, bem como a curva de calibração logística de 4 parâmetros gerado, o LLOD para UV-Vis era 3:05 de nanopartículas de ouro.
Usando uma configuração de espectroscopia Raman detalhado anteriormente 7, a 785 nm microscópio Raman invertido foi utilizado para coletar espectros do repórter DCTC Raman associada com a placa de imunoensaio funcionalizado. parâmetros operacionais incluídos 7 mW de potência do laser e uma ac 10 segtempo aqui-. Os espectros foram submetidos a correcção da linha de base (11 th polinomial de ordem) e integração de picos. Figura 5 mostra a curva de calibração logística de 4 parâmetros gerados para as áreas de pico para os DCTC 493 cm -1 e 508 cm -1 picos DCTC. À medida que a concentração exacta de Raman repórter ligado à superfície do AUNP era desconhecido, a curva de calibração foi baseada na concentração AUNP. Utilizando as equações acima descritas, o LLOD foi determinada como sendo 13:07 de AUNP.
Figura 1. Ilustração do direta e indireta imunoensaio análise. Ilustração de indireta (A) e intervenções directas (B) de detecção para os imunoensaios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. nanopartículas sonda fabricação ilustração. Processo de funcionalização / sondas UV-Vis Raman para imunoensaios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. placa de imunoensaio preparado. Imagem de uma placa de imunoensaio preparado. Filas A a E são amostras de testes, enquanto filas F a H são amostras de controlo. Coluna 1 contém as nanopartículas não diluídas e cada coluna subsequente tem metade da concentraçãode sondas AUNP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. curva de calibração UV-Vis para imunoensaio utilizando sondas de nanopartículas. Curva de calibração logarítmica para as áreas de pico UV-Vis a concentração de nanopartículas. A linha ajustada é uma curva logística de 4 parâmetros (4PL). As barras de erro indicam a área do pico desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura curva de calibração 5. Raman para sondas de nanopartículas de imunoensaio usando. Curva de calibração correlacionando Raman área do pico repórter a concentração de nanopartículas de ouro. A linha ajustada é uma curva logística de 4 parâmetros (4PL). As barras de erro indicam a área do pico desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
No protocolo detalhado, existem vários pontos críticos para tratar. Uma questão é a escolha do repórter Raman e nanopartículas de ouro. Embora o protocolo foi escrito para ser adaptado para o uso individual, a Raman DCTC repórter foi utilizada como um exemplo. DTTC é um repórter carregado positivamente e se liga a superfícies tais como citrato tampado AuNPs carregado negativamente. Este protocolo pode ser adaptado para repórteres negativamente carregados usando nanopartículas de ouro com uma carga de superfície positiva. Por exemplo, polietilenoimina (PEI) tampado AuNPs fornecer uma carga de superfície positiva e melhor ligação com os repórteres de carga negativa.
Manter o equilíbrio entre proteínas e nanopartículas é uma etapa crítica do presente protocolo. Este equilíbrio é conseguido através da adição de anticorpos PEGilados em um anticorpo optimizado a proporção de nanopartículas de ouro de 200: 1. Se os anticorpos PEGilados são adicionados à solução de nanopartículas de ouro numa proporção significativamente mais elevada do que this, pode ocorrer a agregação das partículas induzida por ião. Alternativamente, pelo muito pequeno de uma relação, iria ocorrer a agregação de proteínas e insolubilidade. Esta relação deve ser determinada em cada caso individual.
Um outro passo crucial é o protocolo de conjugação de OPSS-PEG-NHS para o anticorpo. Este passo é precedida por suspensão OPSS-PEG-NHS em bicarbonato de sódio em que o grupo NHS se liga ao anticorpo. Este passo de conjugação compete com a reacção de hidrólise desfavorável como detalhado anteriormente 7. A reacção de hidrólise é mais provável de acontecer ao longo do tempo, e, como tal, o OPSS-PEG-NHS para a ligação do anticorpo deve ser realizada imediatamente.
O produto final do protocolo é um imunoensaio que pode ser testada para a sensibilidade por construção de uma curva de calibração de UV-Vis e espectroscopia Raman. Os resultados indicam que o imunoensaio é comparável com outros bioensaios 13-17, que possuem limites de detecção Of 13:00. Não só é a sensibilidade do imunoensaio competitivo de Raman com outros bioensaios, que tem o potencial para melhorar a sensibilidade por meio da superfície melhorada, espectroscopia Raman (SERS). SERS incorpora o uso de nanopartículas de ouro ou uma superfície de ouro áspera para melhorar a emissão de Raman. Como este protocolo já inclui o uso de sondas de ouro nanopartículas, é bem adequado para o desenvolvimento em um imunoensaio SERS. No futuro, esta técnica poderia ser utilizada para o desenvolvimento de um imunoensaio de espalhamento de luz que pode ser utilizado para detectar analitos muitas proteínas simultaneamente. Tal como biomarcador de perfil torna-se cada vez mais importante para o diagnóstico e tratamento de uma ampla variedade de doenças, esta técnica pode ter aplicações clínicas profundas.
Os problemas mais comuns associados com este protocolo incluem agregação de nanopartículas de ouro, ligação insuficiente de bloqueio de proteínas, ligação de proteínas não-específicas, e um sinal de Raman fraco. Estes problemas sãolistadas na Tabela 2, juntamente com a possível causa das etapas de problema e medidas para resolver cada problema. Outros problemas podem surgir devido a limitações do protocolo. Em primeiro lugar, este protocolo é limitado a concentrações AUNP até 5 x 10 12 partículas / ml, em concentrações mais elevadas tendem a provocar a agregação. A técnica baseia-se, nanopartículas não agregadas estáveis para a estimativa das concentrações de nanopartículas. Se houver a agregação, a estimativa da concentração de nanopartículas serão polarizados. O protocolo é também limitada a repórteres Raman com picos fortes o suficiente para superar o fundo de poliestireno e são únicos a partir de poliestireno. Por último, a utilização de placas de 96 poços tradicional limitar o protocolo a ser usado de um microscópio invertido de Raman devido à altura das placas. Caso contrário, uma baixa ampliação deve ser utilizado para o objectivo microscópio Raman para acomodar a altura da placa de 96 poços.
| Sintoma | Causa provável | Ação corretiva |
| As nanopartículas de ouro agregar após centrifugação e ressuspensão. | A concentração de repórter de Raman é demasiado elevada. | Testar uma gama de concentrações repórter Raman conforme especificado no ponto 2.2 ou esse protocolo. |
| O anticorpo a proporção AUNP é demasiado elevada. | Reduzir o número de anticorpos PEGilados ligado à superfície da nanopartícula para aumentar a estabilidade da partícula. | |
| O agente de bloqueio de mPEG-SH não é obrigatória para a superfície da AUNP. | Preparar a solução mPEG-SH logo antes do bloqueio de nanopartículas. | |
| A ligação não específica à superfície da placa de imunoensaio | A placa de imunoensaio não está suficientemente bloqueado. | Prepare solução fresca antes bloqueando a placa divertidoctionalization. |
| O peso molecular de mPEG-SH não é grande o suficiente. | Assegure-se que a molécula de mPEG-SH utilizado para bloqueio tem um peso molecular de 5,000 kDa ou superior. | |
| sinal Raman fraco ou ausente | O repórter de Raman não é obrigatório que a superfície da partícula. | Assegurar o repórter de Raman é deixada ligar-se durante pelo menos 30 minutos antes da adição do anticorpo PEGuilado. |
| O peso molecular de mPEG-SH não é grande o suficiente. | Certifique-se que a nanopartícula agente de cobertura tem a taxa adequada para a ligação repórter iônica Raman. |
Tabela 2. Solução de problemas para problemas comuns. Lista de problemas comuns encontrados durante o protocolo com as causas associadas e itens de ação corretiva.
Neste artigo, nós apresentamos aprotocolo para fabricação personalizada de um imunoensaio baseado nanopartícula-sonda para análise usando UV-Vis / espectroscopia Raman. O protocolo inclui funcionalização de nanopartículas de ouro com repórteres e imunoglobulinas para detecção direta de antígenos ligados a uma placa de poliestireno Raman. O protocolo pode ser adaptado para se adequar a um repórter de Raman particular e comprimento de onda de excitação associados. forma de nanopartículas de ouro e o tamanho também podem ser alteradas. No entanto, as proporções da solução para a ligação irá variar de acordo com o repórter de Raman utilizado, bem como o tamanho das nanopartículas, forma, e adequado do fabricante. O protocolo foi escrito para cue pesquisadores de quando os rácios de solução deve ser determinado para cada arranjo original e, assim, permitir a fabricação personalizada de acordo com necessidades de investigação. Ao contrário dos protocolos típicos de imunoensaios fluorescentes / colorimétrico, este protocolo tem o potencial para uma maior capacidade de multiplexação, enquanto capitalizando sobre uma infra-estrutura pré-existente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 ml | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 | |
| In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/ (2004).
- ELISA development guide. , [Accessed: 28-Mar-2016] https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.effemm2.de/spekwin/ (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
