Abstract
Les dosages immunologiques sont utilisés pour détecter des protéines sur la base de la présence d'anticorps associés. En raison de leur utilisation intensive dans la recherche et les paramètres cliniques, une grande infrastructure d'instruments et de matériaux immunoessais peut être trouvé. Par exemple, 96- et 384 puits de plaques de polystyrène sont disponibles dans le commerce et ont un design standard pour accueillir l'ultraviolet visible (UV-Vis) Machines de spectroscopie de différents fabricants. En outre, une grande variété d'immunoglobulines, des étiquettes de détection, et des agents de blocage pour la conception des dosages immunologiques personnalisés tels que des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) sont disponibles.
En dépit de l'infrastructure existante, des kits ELISA standards ne répondent pas à tous les besoins de la recherche, ce qui nécessite le développement d'immuno-essai individualisé, qui peut être coûteux et fastidieux. Par exemple, les kits ELISA ont une faible multiplexage (détection de plus d'un analyte à la fois) des capacités car elles dépendent généralement de la fluorescence ou de la colméthodes orimetric pour la détection. Des analyses colorimétriques et fluorescents à base ont des capacités limitées de multiplexage en raison de larges pics spectraux. En revanche, la spectroscopie Raman méthodes basées sur-ont une capacité beaucoup plus grande pour le multiplexage en raison des pics d'émission étroites. Un autre avantage de la spectroscopie Raman est que les journalistes Raman éprouvent beaucoup moins photoblanchiment que des marqueurs fluorescents 1. Malgré les avantages que les journalistes Raman ont plus de marqueurs fluorescents et colorimétriques, les protocoles pour fabriquer des immunoessais à base de Raman sont limitées. Le but de ce document est de fournir un protocole pour préparer des sondes fonctionnalisés à utiliser en conjonction avec des plaques de polystyrène pour la détection directe des analytes par analyse UV-Vis et spectroscopie Raman. Ce protocole permettra aux chercheurs d'adopter une approche do-it-yourself pour la détection future multi-analyte tout en capitalisant sur l'infrastructure pré-établie.
Introduction
dosages immunologiques en sandwich typique détecter indirectement la présence d'un antigène en utilisant deux anticorps. L'anticorps de capture est lié à une surface solide et forme un complexe anticorps-antigène lorsqu'il est à proximité d'un antigène approprié. Un anticorps de détection est ensuite introduit et se lie à l'antigène. Après lavage, les anticorps / antigène / anticorps et reste complexe est détecté par l'anticorps de détection marqué comme le montre la figure 1A. Détection typique est effectuée par un détecteur fluorescent ou colorimétrique, ce qui limite le multiplexage à 10 analytes en raison des larges pics spectraux 2,3. En revanche, les systèmes basés sur Raman ont des pics d'émission beaucoup plus étroite aboutissant à de meilleures capacités de multiplexage avec des sources revendiquant la détection simultanée de jusqu'à 100 analytes 2,3.
De nombreuses sources sont disponibles dans la littérature , qui couvrent des aspects importants liés à des dosages immunologiques 4 - 6 tel que l' étape par étape ,détails pour créer des kits ELISA personnalisés. Malheureusement, ces protocoles pour la détection fluorescente ou colorimétrique, ce qui limite la capacité de multiplexage des analyses immunologiques sur mesure. Pour répondre à ce besoin, nous présentons une procédure détaillée pour fabriquer les UV-Vis / Raman immunologique publié précédemment 7 pour une analyse immunologique directe comme illustré sur la figure 1B.
Ce protocole comprend la fabrication des sondes à base de nanoparticules d' or fonctionnalisée, représentée sur la figure 2. La procédure pour rendre les sondes / UV-Vis Raman commence par la presse Raman se lier à la surface des nanoparticules d'or (AuNPs). Les AuNPs sont ensuite fonctionnalisés avec des anticorps qui sont associés à du polyéthylène glycol (PEG). les sites de liaison restants sur les AuNPs sont bloquées par une liaison thiol, un groupe méthoxy polyéthylène glycol (mPEG-SH) afin d'empêcher AuNPs ultérieur liaison non spécifique au cours de l'analyse. Les sondes AUNP préparées sont testées en se liant à des antigènesfixé sur les puits d'une plaque de polystyrène comme illustré sur la figure 1B. Après lavage de la plaque, les sondes de AUNP sont détectés en utilisant la spectroscopie UV-visible, tandis que les reporters de Raman associés sont détectés par spectroscopie Raman. La combinaison des données Raman spectrale UV-Vis et fournit deux méthodes d'analyses, le renforcement des capacités de ce test immunologique.
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Protocol
1. Préparation des buffers
- Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
- Diluer 50 ml de 10x PBS avec 450 ml d'eau de qualité HPLC pour obtenir une concentration 1x PBS. filtrer de manière stérile la solution avec un filtre de 0,22 um.
- Conserver la solution à la température ambiante.
- Préparation de Tris Buffered Saline + Tween 20 (TBST)
- Diluer 50 ml de solution saline tamponnée 10x Tris (TBS) avec 450 ml d'eau de qualité HPLC pour obtenir une concentration de 1x. Ajouter 250 pi de Tween-20 pour 0,05% (v / v) de Tween-20. filtrer de manière stérile la solution avec un filtre de 0,22 um.
- Ranger à température ambiante.
- Préparation de la sérum - albumine humaine (HSA) une solution de blocage
- Peser 0,45 g de SAH dans 15 ml de PBS stérile filtré 1x pour faire un 3% p / v de solution de HSA. Vortex solution jusqu'à HSA est complètement dissous.
- Magasin solution HSA à 4 ° C.
REMARQUE: sérum-albumine bovine(BSA) peut également être utilisée comme solution de blocage.
- Préparation d'anticorps pégylé (PEG-Ab) solution
NOTE: La solution d'anticorps doit être exempt de porteurs ou de stabilisation des protéines telles que BSA, qui pourraient interférer avec les réactions de conjugaison par compétition pour le n-hydroxysulfosuccinimide (NHS) sites de liaison. Si l'anticorps est dans une solution tampon Tris ou la glycine, il doit subir un échange de tampon pour empêcher des amines ou des sels d'ammonium d'interférer avec la réaction de conjugaison du NHS. Si l'anticorps est sous une forme lyophilisée, il peut être remis en suspension selon les recommandations du fabricant à une concentration de 1-10 mg / ml.- Pour les anticorps dans un tampon Tris ou la glycine, effectuer un échange de tampon au bicarbonate de sodium 100 mM en utilisant une colonne de dessalage. Utiliser le tampon à 100 mM pour élever le pH à environ 8,5 pour accélérer la réaction de conjugaison.
- Hydrater ortho-pyridyl-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) avec 100 mM sbicarbonate odium à un volume de 1 ml à une concentration de 1 mg / ml ou plus.
NOTE: OPSS-PEG-NHS devrait être fraîche et utilisée dans environ 20 min. Le groupe NHS sur la OPSS-PEG-NHS a une demi-vie d'environ 20 min dans une solution aqueuse à un pH de 8,5. - Ajouter OPSS-PEG-NHS à la solution d'anticorps à un rapport 2: 1 (PEG: Antibody) Taux de conjugaison à utiliser pour les échantillons d'essai. Dans un tube de microcentrifugeuse séparé, ajouter OPSS-PEG-NHS à la solution d'antigène à un rapport 2: 1 de conjugaison à être utilisé pour le contrôle.
NOTE: Le ratio de 2: 1 est en supposant un rendement de conjugaison de 50%. L'objectif est d'étiqueter chaque anticorps avec une chaîne de PEG. Dans cette étape, sur l'étiquetage est mieux que sous-étiquetage. Utilisez l'équation suivante pour déterminer les volumes appropriés de OPSS-PEG-NHS et solution d'anticorps:
où V est le volume, C est la concentration exprimée en molécules ou d' untibodies par ml. Subscripts PEG et Ab sont OPSS-PEG-NHS et de l' anticorps, respectivement. Le volume final doit être d'environ 250 pi. - Incuber solution PEG-Ab à 4 ° C pendant 8 heures ou toute la nuit. Conserver la solution en aliquotes d'environ 25 pi de travail à -20 ° C pour limiter les cycles de congélation-décongélation et assurez-vous d'utiliser des tubes de liaison faible.
2. Préparer UV-Vis / Raman Sondes
- Préparer la solution de AUNP nue
- Préparer une solution de 2 ml de AuNPs avec une concentration d'environ 1 x 10 11 particules par ml.
- Si les AuNPs doivent être concentrées, remplir des tubes de centrifugeuse de liaison faible avec 2000 ul d'actions AUNP et centrifuger à 5000 xg pendant 20 minutes ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. Retirer le surnageant par pipetage, en faisant attention de ne pas perturber le culot AUNP.
- Combinez les solutions AUNP restants dans un tube et estimer la concentrationtion en obtenant une mesure du rayonnement UV-Vis et on compare les valeurs à des concentrations connues comme cela est une relation linéaire.
- Préparer une solution de 2 ml de AuNPs avec une concentration d'environ 1 x 10 11 particules par ml.
- Déterminer le rapport d'étiquetage rapporteur Raman approprié
- Préparer une solution de travail du journaliste Raman dissous dans le méthanol. Cette concentration sera dépendante du rapporteur utilisé. Dans ce travail, préparer l'iodure de 3,3'-diéthylthiatricarbocyanine (DCTC) à une solution de travail de 200 uM.
- En supposant un volume final de 100 pi pour chaque puits, ajouter suffisamment de la solution de reporter de travail à chaque puits de la première rangée d'une plaque de 96 puits de telle sorte que le journaliste Raman se situera à des concentrations allant de 0,2 um à 10 um. Ajouter suffisamment d'eau de qualité HPLC à chaque puits de telle sorte que le volume est de 80 ul. Ajouter 20 pi de AUNP à chaque puits faisant un volume final de 100 ul de chaque puits. Un exemple est fourni dans le tableau 1.
- Mesurer les spectres UV-Vis de 400 à700 nm en utilisant une plaque de lecture spectrophotomètre UV-Vis. La concentration appropriée est la concentration la plus élevée avec des pics définis pour les spectres UV-Vis. Répétez l'étape 2.2.2 à l'augmentation des concentrations jusqu'à ce que le ratio le plus élevé de concentration de journalistes Raman à AuNPs se trouve.
NOTE: Le colorant et la forme de AUNP, la taille, et le fabricant influencent la concentration appropriée. Par conséquent, les étapes ci doivent être évalués et modifiés en fonction des composants utilisés. Ce protocole implique l'utilisation d'un colorant chargé positivement. En tant que tel, la liaison entre le AUNP et journaliste a été améliorée en utilisant AuNPs chargés négativement. Ceci a été réalisé en utilisant du citrate coiffé AuNPs. Voir la section Discussion pour plus de détails.
- Reliure Raman reporter et PEG-Ab à AUNP
- Préparer deux lots de 1,5 ml AUNP et Raman reporter à la concentration déterminée au préalable, ce qui permet le reporter Raman de se lier aux AuNPs pendant 30 min à température ambiante.
- Ajouter l'anticorps pégylé (PEG-Ac) pour un lot de la solution rapporteur AUNP et Raman pour créer un 200: 1 ratio d'anticorps à des particules. Cette solution sera pour les échantillons d'essai. Dans un tube de microcentrifugeuse séparé, ajouter l'antigène pégylé à l'autre lot de la solution AUNP et Raman reporter à 200: 1 ratio d'anticorps à des particules à être utilisé comme témoin. Incuber les solutions pendant 30 min à température ambiante.
NOTE: Le rapport des anticorps à des particules sera spécifique aux AuNPs et le colorant utilisé et doit être optimisé pour chaque cas individuel. L'objectif ici est d'avoir le plus haut taux d'anticorps pour les sondes de AUNP de se lier à tout en empêchant l'agrégation des particules. Utilisez l'équation suivante pour déterminer les volumes appropriés d'additionner:
où V est le volume, C est la concentration exprimée sous forme de particules ou d' anticorps par ml. La nageoirele volume al devrait être d'environ 1,5 ml.
- Bloquer les sites restants sur la surface AUNP avec mPEG-SH.
- Préparer mPEG-SH par dissolution solide méthoxy polyéthylène glycol thiol à une concentration de 200 uM avec de l'eau. Vortex jusqu'à ce que la solution de mPEG-SH soit complètement dissous.
- Ajouter mPEG-SH à 40,000: 1 rapport à la solution AUNP-PEG-Ab faite à l'étape 2.3. Incuber la solution à la température ambiante pendant 10 minutes pour assurer que les sites restants sur la nanoparticule d'or sont bloqués. Utilisez l'équation suivante pour déterminer les volumes appropriés d'additionner:
où V est le volume, C est la concentration exprimée sous forme de particules ou d' anticorps par ml. Le volume final devrait être d'environ 1,5 ml.
- Récupérer des sondes Raman fonctionnalisés.
- particules centrifuger à 5000 xg pendant 20 min en basse bind ctubes entrifuge ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. Retirer le surnageant par pipetage en faisant attention à ne pas perturber les AuNPs.
- Resuspendre les particules avec 1 ml de solution PBS 1x qui a été faite précédemment. Estimer la concentration AUNP en prenant une mesure d'un faible volume de solution (3 pi) UV-Vis et comparer les résultats à la mesure d'une concentration AUNP connue. Ajuster le volume de telle sorte que la solution finale est d' au moins 1 x 10 11 particules par ml.
- solutions de magasins à 4 ° C jusqu'à ce qu'il est utilisé pour la fonctionnalisation de la plaque de dosage immunologique. Utilisez les solutions en une semaine.
| Les volumes d'ajouter de chaque composant (ml) | |||
| DCTC concentration finale (mM) | Solution de travail DCTC (200 mM) | AUNP | Eau |
| 0,2 0,1 | 20 | 79,9 | |
| 0,6 | 0,3 | 20 | 79,7 |
| 1 | 0,5 | 20 | 79,5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77,5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76,5 |
| dix | 5.0 | 20 | 75 |
Tableau 1. DCTC exemple de dilution. Diverses dilutions de DCTC et les volumes associés d'actions DCTC, solution de nanoparticules d' or, et de l' eau.
3. Immunoassay Plate Préparation
- Lier l' antigène désiré à la plaque de dosage immunologique.
- Préparer suffisamment antigène dilué (50 pg / ml) pour remplir les puits de polystyrène. Vortex la solution,et ajouter immédiatement la solution dans les puits de la plaque. Permettre à l'antigène de se lier aux plaques pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver les antigènes non liés.
- Retirer la solution d'excès d'antigène par le dumping solution dans un récipient d'élimination et de frapper la plaque contre une table d'essuie-tout recouvert.
- Ajouter TBST aux puits pour laver la surface puis retirez le lavage de la même manière comme indiqué précédemment. Répétez cette étape deux fois plus.
- Bloquer les sites de liaison restant sur la plaque pour empêcher la liaison non spécifique.
- Ajouter 70 ul de solution de blocage HSA à chaque puits de la plaque et incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Retirer et rincer la plaque en utilisant la même procédure que spécifié à l'étape 3.2. Couvrir la plaque et de stockage à sec à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Fonctionnaliser plaque de dosage immunologique.
- Ajouter 70 ul de til sonde nanoparticules préparées à la section 2 de la première colonne d'une plaque de 96 puits et diluer les colonnes suivantes en utilisant une dilution 1: série 2. Laisser la plaque incuber pendant au moins 1 h. Un exemple de la façon de préparer la plaque de dosage immunologique est donnée à la figure 3.
- Laver la plaque avec du TBST cinq fois plus détaillées dans les étapes 3.2, en veillant à disposer des AuNPs appropriée. Après le lavage final, ajouter 70 ul de PBS 1x à chaque puits et couvrir avec un joint de plaque.
REMARQUE: Les échantillons de contrôle doivent être claires. Si la liaison non spécifique a eu lieu, les échantillons de contrôle ont une couleur similaire à celle des échantillons d'essai.
- Test de sensibilité du dosage par UV-Vis et spectroscopie Raman.
- Pour chaque puits, mesurer l'UV-Vis spectres allant de 400 à 700 nm en utilisant une plaque de lecture spectrophotomètre UV-Vis.
- En utilisant un microscope inversé Raman, focaliser l'objectif sur la surface du puits qui a les sondes AUNP. Obnir un spectre Raman du puits. Collecter un spectre allant de 1800 cm -1 à 400 cm -1. Répétez cette étape pour tous les puits.
- L' utilisation d' un logiciel approprié du spectre, effectuer une commande de correction de ligne de base 11 ème polynôme pour les spectres Raman et un 3 ème ordre polynomial pour la spectres UV-Vis.
- L'utilisation d'un logiciel spectrale appropriée, normaliser la Raman et spectres UV-Vis. Réglez la valeur maximale à 1 et l'échelle toutes les autres valeurs en conséquence. Pour normaliser les spectres Raman, sélectionnez un pic de polystyrène unique et le mettre égal à 1 et l'échelle toutes les autres valeurs en conséquence.
- L'utilisation d'un logiciel spectrale appropriée, effectuer une intégration de pointe pour chaque spectre. Pour les spectres Raman, le pic représentant le journaliste Raman doit être dans une région absente des pics de polystyrène. Pour effectuer une intégration maximale, spécifier les limites intégrales pour le pic souhaité et enregistrer la zone de pic désirée pour tous les échantillons y compris les témoins.
- PLot la surface du pic d'intérêt moyen en fonction du log de la concentration AUNP avec des barres d'erreur pour chaque point indiquant son écart-type associé. Adapter à ces points d'étalonnage à une courbe logistique à 4 paramètres.
- Déterminer la valeur moyenne de l'ébauche en calculant la moyenne de la zone du pic d'intérêt pour un échantillon à blanc. Déterminer l'écart-type de ces zones; ceci est l'écart type de l'ébauche.
- Pour le même pic analysé à l'étape précédente, pour l'écart-type de ladite zone de pic pour la concentration la plus faible.
- Calculer la limite de la limite vide et inférieure de détection tel que spécifié dans la section des résultats représentant. Utilisez ces valeurs avec les courbes d'étalonnage 4PL pour déterminer la LLOD en termes de concentration AUNP.
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Representative Results
Dans cette étude, les 60 nm particules d'or ont été utilisés pour la spectroscopie UV-Vis. UV-Vis spectres d'absorption de 400 à 700 nm ont été recueillies et les surfaces des pics pour chaque concentration AUNP ont été déterminées en utilisant un logiciel open source d'analyse spectrale 8. Avant pic d'intégration, les spectres collectés a subi une correction de base en utilisant un ajustement polynomial trois points. Les surfaces des pics ont été utilisées pour générer une courbe d'étalonnage logarithmique comme le montre la figure 4. Il convient de noter que les figures 4 et 5 incorpore des courbes d'étalonnage logarithmique. L'utilisation des courbes d'étalonnage non linéaires peut augmenter de manière significative la gamme dynamique d'un essai et est devenu une pratique acceptée pour divers immunoessais qui nécessitent des capacités de détection de faible portée 9,10.
Pour évaluer quantitativement la sensibilité de l'essai, la limite de l'ébauche (LOB) etla limite inférieure de détection (LLOD) a été calculé comme suit 
où l' écart - type de l'ébauche et de la concentration de l' échantillon est plus faible σ BLANK et σ bas, respectivement, tandis que 
est la valeur moyenne du flan 11,12. À partir de ces définitions, ainsi que les 4 paramètres courbe d'étalonnage générée logistique, le LLOD pour UV-Vis était 15:05 de nanoparticules d'or.
En utilisant une configuration de spectroscopie Raman , détaillé précédemment figure 7, un 785 nm Raman microscope inversé a été utilisé pour recueillir des spectres de Raman reporter DCTC associée à la plaque de dosage immunologique fonctionnalisé. Les paramètres de fonctionnement inclus 7 mW de puissance laser et un courant alternatif de 10 sectemps quisition. Les spectres a subi une correction de ligne de base (11 ième ordre polynomial) et d' intégration de crête. La figure 5 montre la courbe d'étalonnage logistique à 4 paramètres générés pour les aires des pics pour DCTC 493 cm -1 et 508 cm -1 , des pics DCTC. Que la concentration exacte de Raman reporteur liée à la surface AUNP était inconnue, la courbe d'étalonnage a été basée sur une concentration AUNP. En utilisant les équations décrites ci-dessus, la LLOD a été déterminée comme étant de 13:07 AUNP.
Figure 1. Illustration d'immuno - analyse. Illustration directe et indirecte de indirecte (A) et les systèmes (B) de détection directe pour immunoessais. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Nanoparticules sonde fabrication illustration. Procédé de fonctionnalisation Raman / sondes UV-Vis pour immunoessais. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version beaucoup plus importante de ce chiffre.
Figure 3. Préparé plaque de dosage immunologique. Image d'une plaque de dosage immunologique préparé. Les lignes A à E sont des exemples de tests alors que les lignes F à H sont des échantillons témoins. Colonne 1 contient les nanoparticules non dilués et chaque colonne suivante a la moitié de la concentrationde sondes AUNP. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 4. UV-Vis courbe d'étalonnage pour le dosage immunologique en utilisant des sondes de nanoparticules. Courbe d'étalonnage logarithmique pour les surfaces des pics UV-Vis à la concentration des nanoparticules. La ligne ajustée est une courbe à 4 paramètres logistiques (4PL). Les barres d'erreur indiquent la zone de pic de déviation standard. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version beaucoup plus importante de ce chiffre.
La Figure 5. Raman courbe d'étalonnage pour le dosage immunologique en utilisant des sondes de nanoparticules. Courbe d'étalonnage corrélant Raman reporteur surface du pic de concentration de nanoparticules d'or. La ligne ajustée est une courbe à 4 paramètres logistiques (4PL). Les barres d'erreur indiquent la zone de pic de déviation standard. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version beaucoup plus importante de ce chiffre.
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Discussion
Dans le protocole détaillé, il existe plusieurs points critiques pour faire face. Une question est le choix de Raman reporter et nanoparticules d'or. Bien que le protocole a été écrit pour être adapté à un usage individuel, Raman journaliste DCTC a été utilisé comme un exemple. DCTC est un journaliste chargé positivement et se lie à des surfaces telles que le citrate plafonné AuNPs chargé négativement. Ce protocole peut être adapté pour les journalistes chargés négativement en utilisant des nanoparticules d'or avec une charge de surface positive. Par exemple, polyéthylèneimine (PEI) plafonné AuNPs fournissent une charge de surface positive et une meilleure liaison avec les journalistes chargés négativement.
Le maintien de l'équilibre entre les protéines et nanoparticules est une étape critique de ce protocole. Cet équilibre est obtenu par l'addition d'anticorps pégylés à un anticorps optimisé à l'or ratio de nanoparticules de 200: 1. Si les anticorps pégylés sont ajoutés à la solution de nanoparticules d'or dans une proportion significativement plus élevée que this, l'agrégation des particules induite d'ions peut se produire. En variante, au trop petit d'un rapport, l'agrégation des protéines et de l'insolubilité se produirait. Ce ratio doit être déterminé dans chaque cas individuel.
Une autre étape du protocole critique est la conjugaison OPSS-PEG-NHS à l'anticorps. Cette étape est précédée par mise en suspension OPSS-PEG-NHS dans du bicarbonate de sodium dans lequel le groupe NHS se lie à l'anticorps. Cette étape de conjugaison entre en compétition avec la réaction d'hydrolyse comme décrit précédemment défavorable 7. La réaction d'hydrolyse est plus susceptible de se produire au fil du temps, et en tant que tel, le OPSS-PEG-NHS de liaison de l'anticorps doit être effectuée immédiatement.
Le produit du protocole final est un immuno-essai, qui peut être testée pour la sensibilité par construction d'une courbe d'étalonnage en utilisant les UV-Vis et spectroscopie Raman. Les résultats montrent que le dosage immunologique est comparable à d' autres essais biologiques 13-17 qui ont des limites de détection of 13 heures. Non seulement le dosage immunologique de sensibilité Raman compétitive avec d'autres dosages biologiques, il a le potentiel d'améliorer la sensibilité au moyen de la surface-enhanced Raman spectroscopie (SERS). SERS incorpore l'utilisation de nanoparticules d'or ou d'une surface d'or rendue rugueuse pour améliorer l'émission Raman. Comme ce protocole comprend déjà l'utilisation de sondes d'or nanoparticules, il est bien adapté pour le développement dans un dosage immunologique de la SERS. Dans l'avenir, cette technique pourrait être utilisée pour le développement d'un dosage immunologique par diffusion de la lumière qui peut être utilisé pour détecter plusieurs analytes de protéines simultanément. En tant que biomarqueur profilage devient plus important pour le diagnostic et le traitement d'une grande variété de maladies, cette technique peut avoir des applications cliniques profondes.
Les problèmes courants associés à ce protocole comprend l'agrégation des nanoparticules d'or, la liaison de blocage insuffisante des protéines, la liaison de protéines non spécifiques, et un signal Raman faible. Ces problèmes sonténumérées dans le tableau 2 ainsi que la cause possible du problème et d' action des mesures pour résoudre chaque problème. D'autres problèmes peuvent survenir en raison de limitations du protocole. Tout d' abord, ce protocole est limitée à des concentrations AUNP jusqu'à 5 x 10 12 particules / ml que des concentrations plus élevées ont tendance à provoquer une agrégation. La technique repose sur des nanoparticules stables, non agrégées pour l'estimation de la concentration en nanoparticules. S'il est l'agrégation, l'estimation de la concentration de nanoparticules sera biaisée. Le protocole est également limité à des journalistes Raman avec des pics assez forts pour surmonter l'arrière-plan de polystyrène et sont uniques à partir de polystyrène. Enfin, l'utilisation de plaques à 96 puits traditionnels limiter le protocole à utiliser un microscope inversé Raman due à la hauteur des plaques. Dans le cas contraire, un faible grossissement doit être utilisé pour l'objectif de microscope Raman pour tenir compte de la hauteur de la plaque à 96 puits.
| Symptôme | Cause probable | Action corrective |
| Les nanoparticules d'or agrègent après centrifugation et remise en suspension. | La concentration rapporteur Raman est trop élevé. | Testez une gamme de concentrations rapporteurs Raman comme indiqué à la section 2.2 ou ce protocole. |
| L'anticorps ratio AUNP est trop élevé. | Réduire le nombre d'anticorps pégylés liés à la surface des nanoparticules pour augmenter la stabilité des particules. | |
| L'agent de blocage mPEG-SH ne lie pas à la surface AUNP. | Préparer la solution mPEG-SH frais avant blocage des nanoparticules. | |
| La liaison non spécifique à la surface de la plaque de dosage immunologique | La plaque de dosage immunologique est insuffisamment bloquée. | Préparer une solution de blocage fraîche avant plaque functionalization. |
| Le poids moléculaire de mPEG-SH est pas assez grande. | Faire en sorte que la molécule de mPEG-SH utilisée pour le blocage a un poids moléculaire de 5 000 kDa ou plus. | |
| signal Raman faible ou absent | Le journaliste Raman ne lie pas à la surface des particules. | Vérifiez que le journaliste Raman est autorisé à se lier pendant au moins 30 minutes avant l'addition de l'anticorps pégylé. |
| Le poids moléculaire de mPEG-SH est pas assez grande. | Veiller à ce que la nanoparticule agent de coiffage a la charge appropriée pour la liaison ionique Raman reporter. |
Tableau 2. Dépannage des problèmes communs. Liste des problèmes fréquemment rencontrés au cours du protocole avec les causes associées et les éléments d'actions correctives.
Dans ce manuscrit, nous avons présenté aprotocol pour la fabrication sur mesure d'un dosage immunologique à base de nanoparticules sonde pour analyse en utilisant la spectroscopie UV-Vis / Raman. Le protocole comprend la fonctionnalisation de nanoparticules d'or avec des journalistes et des immunoglobulines pour la détection directe des antigènes liés à une plaque de polystyrène Raman. Le protocole peut être adapté à un journaliste particulier Raman et la longueur d'onde d'excitation associée. forme de nanoparticules d'or et la taille peuvent également être modifiés. Cependant, les rapports de la solution pour la liaison variera selon le journaliste Raman utilisé, ainsi que la taille des nanoparticules, la forme, et le fabricant approprié. Le protocole a été écrit pour cue chercheurs du moment où les rapports de solution doivent être déterminées pour chaque arrangement unique et permettre ainsi à la fabrication sur mesure en fonction des besoins de recherche. Contrairement aux protocoles de dosage immunologique fluorescents / colorimétriques typiques, ce protocole a le potentiel pour une plus grande capacité de multiplexage en capitalisant sur une infrastructure préexistante.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 ml | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 | |
| In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/ (2004).
- ELISA development guide. , [Accessed: 28-Mar-2016] https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.effemm2.de/spekwin/ (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
