Abstract
Immunoanalyser benyttes for å påvise proteiner basert på tilstedeværelsen av tilknyttede antistoffer. På grunn av deres omfattende anvendelse i forskning og kliniske miljøer, kan en stor infrastruktur av immunoassay-instrumenter og materialer funnet. For eksempel, 96- og 384-brønnen polystyren plater er tilgjengelig kommersielt og har en standard design for å imøtekomme ultrafiolette synlig (UV-VIS) spektroskopi maskiner fra forskjellige produsenter. I tillegg er et bredt utvalg av immunoglobuliner, deteksjon koder, og blokkeringsmidler for tilpassede immunoassay-motiver som enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) er tilgjengelige.
Til tross for den eksisterende infrastrukturen, trenger standard ELISA-sett ikke tilfredsstiller alle forskningsbehov, noe som krever individualisert immunoanalyse utvikling, noe som kan være kostbart og tidkrevende. For eksempel, ELISA-sett har lav multipleksing (deteksjon av mer enn en analytt av gangen) evner som de vanligvis avhenge av fluorescens eller colorimetric metoder for påvisning. Kolo og fluorescerende baserte analyser har begrenset multiplexing evner på grunn av brede spektrale topper. I motsetning til dette, Raman-spektroskopi-baserte metoder har en meget større evne for multipleksing på grunn av trange emisjonstoppene. En annen fordel med Raman spektroskopi er at Raman journalister opplever betydelig mindre fotobleking enn fluorescerende tagger 1. Til tross for de fordeler som Raman journalister har over lysrør og kolorimetriske koder, protokoller dikte Raman-baserte immunologiske analyser er begrenset. Formålet med denne artikkelen er å tilveiebringe en protokoll for å fremstille funksjonaliserte prober å bruke i forbindelse med polystyren plater for direkte påvisning av analytter ved UV-Vis-analyse og Raman-spektroskopi. Denne protokollen vil tillate forskere å ta en gjør-det-selv-tilnærming for fremtiden multi-analytt deteksjon mens utnytte pre-etablert infrastruktur.
Introduction
Typiske sandwich-immunoanalyser indirekte detektere nærværet av et antigen ved anvendelse av to antistoffer. Fangst-antistoffet er bundet til en fast overflate og danner et antistoff-antigen kompleks når den er i nærheten av en passende antigen. En deteksjonsantistoff blir så innført og binder seg til antigenet. Etter vasking blir de antistoff / antigen / antistoff-komplekset levninger og detekteres av den merkede påvisningsantistoff som vist i figur 1A. Typisk deteksjon gjøres av et fluoriserende eller kolorimetrisk detektor, noe som begrenser multipleksing til 10 analyttene på grunn av brede spektraltopper 2,3. I motsetning til dette, Raman-baserte systemer har mye smalere emisjonstoppene som resulterer i forbedrede multipleksing muligheter med kilder som hevder simultan deteksjon av opptil 100 analytter 2,3.
Mange litteraturkilder er tilgjengelige som dekker viktige aspekter knyttet til immunoanalyser 4. - 6. såsom steg-for-stegdetaljer for å lage personlige ELISA kits. Dessverre er disse protokollene er for fluorescerende eller kolo deteksjon, noe som begrenser multipleksing evnen til tilpassede immunanalyser. For å møte dette behovet, presenterer vi en detaljert fremgangsmåte for å fremstille UV-Vis / Raman-immunoassay publisert tidligere 7 for en direkte immunoanalyse som illustrert i figur 1B.
Denne protokollen innbefatter fremstilling av funksjonaliserte gull nanopartikkel-baserte prober, er vist på figur 2. Fremgangsmåten for å lage den Raman / UV-Vis-prober begynner ved binding Raman reportere til overflaten av gull nanopartikler (AuNPs). De AuNPs blir deretter funksjonalisert med antistoffer som er forbundet med polyetylenglykol (PEG). Gjenværende bindingsseter på de AuNPs blokkeres ved binding metoksypolyetylenglykol tiol (mPEG-SH) til AuNPs for å forhindre etterfølgende ikke-spesifikk binding under analysen. De forberedt AuNP sonder er testet ved binding til antigenerfestet til brønnene i en polystyren plate som illustrert i figur 1B. Ved vasking av platen, blir AuNP sondene oppdaget ved hjelp av UV-Vis-spektroskopi mens de tilknyttede Raman journalister blir oppdaget med Raman-spektroskopi. Kombinere UV-Vis og Raman spektrale data gir to metoder for analyser, forbedre egenskapene denne immunoassay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av buffere
- Fosfatbufret saltløsning (PBS)
- Fortynn 50 ml 10 x PBS med 450 ml HPLC-kvalitet vann for å lage en 1 x PBS konsentrasjon. Sterilt filter oppløsningen med et 0,22 um filter.
- Lagres oppløsning ved romtemperatur.
- Utarbeidelse av Tris bufret saltvann + Tween 20 (TBST)
- Fortynn 50 ml 10 x Tris-buffret saltvann (TBS) med 450 ml HPLC-kvalitet vann for å lage en 1x konsentrasjon. Tilsett 250 ul av Tween-20 for en 0,05% (volum / volum) Tween-20. Sterilt filter oppløsningen med et 0,22 um filter.
- Oppbevares i romtemperatur.
- Fremstilling av humant serumalbumin (HSA) Blocking Solution
- Veie 0,45 g av HSA i 15 ml sterilfiltrert 1 x PBS for å lage en 3% vekt / volum HSA-løsning. Vortex-løsning inntil HSA er fullstendig oppløst.
- Oppbevares HSA løsning ved 4 ° C.
MERK: Bovine Serum Albumin(BSA), kan også brukes som en blokkerende oppløsning.
- Utarbeidelse med pegylert antistoff (PEG-Ab) løsning
MERK: antistoff-løsningen må være fri for bærer eller stabiliserende proteiner, slik som BSA, noe som ville forstyrre konjugeringsreaksjoner ved å konkurrere om n-hydroxysulfosuccinimide (NHS) bindingsseter. Dersom antistoffet kommer i en Tris eller glycin-buffer-oppløsning, må det gjennomgå en bufferbytte for å forhindre aminer eller ammoniumsalter interfererer med NHS konjugeringsreaksjonen. Dersom antistoff er i en lyofilisert form, kan den bli resuspendert i henhold til produsentens anbefaling ved en konsentrasjon på 1-10 mg / ml.- For antistoffer i en Tris eller glysin buffer, utføre en buffer utveksling til 100 mm natriumbikarbonat ved hjelp av en avsaltingskolonne. Bruk 100 mM buffer for å heve pH til omtrent 8,5 for å øke hastigheten på konjugeringsreaksjonen.
- Hydrate orto-pyridyldisulfid-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) med 100 mM sodium bikarbonat til et volum på 1 ml ved en konsentrasjon på 1 mg / ml eller høyere.
MERK: OPSS-PEG-NHS bør gjøres frisk og brukes innen ca 20 min. NHS gruppen på OPSS-PEG-NHS har en halveringstid på ca. 20 minutter i en vandig oppløsning ved pH 8,5. - Legg OPSS-PEG-NHS til antistoffet løsning ved en 2: 1-forhold (PEG: antistoff) konjugering forhold som skal brukes for testprøvene. I en separat mikrosentrifugerør, tilsett OPSS-PEG-NHS til antigenet oppløsning ved et 2: 1-forhold konjugering som skal brukes for kontroll.
MERK: 2: 1 ratio er forutsatt en 50% konjugering effektivitet. Målet er å merke hver antistoff med en PEG-kjeden. I dette trinn over-merking er bedre enn under-merking. Bruke følgende ligning for å bestemme de riktige mengder OPSS-PEG-NHS og antistoffoppløsning:
hvor V er volumet, C er konsentrasjonen uttrykt i molekyler eller entibodies per ml. Indeksene PEG og Ab er OPSS-PEG-NHS og antistoff, henholdsvis. Den endelige volum bør være ca 250 mL. - Inkuber PEG-Ab-løsning ved 4 ° C i 8 timer eller over natten. Oppbevares løsning i arbeids prøver av ca 25 mikroliter ved -20 ° C for å begrense fryse tine sykluser og sørg for å bruke lave bindende rør.
2. Forbered UV-Vis / Raman prober
- Forbered bart AuNP løsning
- Forbered en 2 ml løsning av AuNPs med en konsentrasjon på ca. 1 x 10 11 partikler per ml.
- Dersom AuNPs trenger å bli konsentrert, fyll lave bindings sentrifugerør med 2000 ul lager AuNP og sentrifuger ved 5000 xg i 20 min eller inntil den overliggende væske er klar. Fjern supernatanten ved pipettering, være forsiktig med å forstyrre AuNP pellet.
- Kombiner de rester AuNP løsninger i en tube og anslå konsensjon ved å skaffe en UV-Vis måling og sammenligning av verdiene til kjente konsentrasjoner som det er en lineær sammenheng.
- Forbered en 2 ml løsning av AuNPs med en konsentrasjon på ca. 1 x 10 11 partikler per ml.
- Bestem den aktuelle Raman reporter merking ratio
- Forbered en fungerende løsning av Raman reporter oppløst i metanol. Denne konsentrasjon vil være avhengig av reporteren benyttes. I dette arbeidet, forberede 3,3'-diethylthiatricarbocyanine jodid (DTTC) på en fungerende løsning på 200 mikrometer.
- Forutsatt et endelig volum på 100 ul til hver brønn, tilsett nok av arbeids reporter løsning til hver brønn i den første raden i en 96-brønns plate, slik at den Raman reporteren vil variere i konsentrasjoner fra 0,2 uM til 10 uM. Legg nok HPLC-kvalitet vann til hver brønn, slik at volumet er 80 pl. Tilsett 20 ul til hver brønn AuNP lage et sluttvolum på 100 ul til hver brønn. Et eksempel er gitt i tabell 1.
- Mål UV-Vis spektra fra 400 til700 nm ved hjelp av en plate-leser UV-Vis spektrofotometer. Den passende konsentrasjon er den høyeste konsentrasjon med definerte topper for UV-Vis-spektra. Gjenta trinn 2.2.2 ved økende konsentrasjoner inntil den høyeste konsentrasjonen forholdet mellom Raman reportere til AuNPs er funnet.
MERK: dye og AuNP form, størrelse og produsent påvirke passende konsentrasjon. Derfor må fremgangsmåten skal evalueres og endres avhengig av de komponenter som anvendes. Denne protokollen involverte bruk av et positivt ladet fargestoff. Som sådan, var bindende mellom AuNP og reporter forbedret ved hjelp av negativt ladede AuNPs. Dette ble gjort ved hjelp citrate avkortet AuNPs. Se diskusjon seksjon for ytterligere detaljer.
- Binding Raman reporter og PEG-Ab å AuNP
- Fremstille to 1,5 ml porsjoner av AuNP og Raman reporter ved den tidligere fastsatte konsentrasjon, slik at Raman reporter for å binde seg til AuNPs i 30 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett PEGylert antistoff (PEG-Ab) til en sats av AuNP og Raman reporter løsning for å skape et 200: 1-forhold av antistoffer mot partikler. Denne løsningen vil være for stikkprøvene. I en separat mikrosentrifugerør, tilsett PEGylerte antigenet til den andre sats av AuNP og Raman reporter oppløsning ved en 200: 1 ratio av antistoff til partiklene som skal benyttes som kontroll. Inkuber løsninger for 30 minutter ved romtemperatur.
MERK: Forholdet mellom antistoffer mot partikler vil være spesifikke for de AuNPs og fargestoff som brukes og skal være optimalisert for hvert enkelt tilfelle. Formålet her er å ha den høyeste forholdet av antistoffer for AuNP prober for å binde seg til samtidig som man unngår aggregering av partiklene. Bruk følgende ligning for å finne riktige volumer å legge sammen:
hvor V er volumet, C er konsentrasjonen uttrykt i partikler eller antistoff per ml. finnenal volum bør være ca 1,5 ml.
- Block resterende områder på AuNP overflaten med MPEG-SH.
- Fremstille mPEG-SH ved å oppløse fast metoksypolyetylenglykol tiol til en 200 mM konsentrasjon med vann. Vortex løsningen til MPEG-SH er helt oppløst.
- Legg mPEG-SH i et 40000: 1 forhold til den AuNP-PEG-Ab oppløsning fremstilt i trinn 2.3. Inkuber av oppløsningen ved værelsestemperatur i 10 minutter for å sikre at de gjenværende områder på gull nanopartikkelen er blokkert. Bruk følgende ligning for å finne riktige volumer å legge sammen:
hvor V er volumet, C er konsentrasjonen uttrykt i partikler eller antistoff per ml. Sluttvolumet skal være omtrent 1,5 ml.
- Gjenopprette funksjon Raman sonder.
- Sentrifuger partikler ved 5000 xg for 20 min i lav bind centrifuge rør eller inntil den overliggende væske er klar. Fjern supernatanten ved å pipettere være forsiktig med å forstyrre AuNPs.
- Resuspender partiklene med 1 ml av 1 x PBS-oppløsning som ble gjort tidligere. Estimer AuNP-konsentrasjonen ved å ta et UV-Vis-måling av et lite volum av oppløsning (3 pl) og sammenligne resultatene til målinger fra en kjent AuNP konsentrasjon. Juster volumet slik at den endelige oppløsningen er minst 1 x 10 11 partikler per ml.
- Oppbevar oppløsninger ved 4 ° C inntil den brukes for funksjonalisering av den immunologiske måling platen. Bruk løsninger innen en uke.
| Volumene for å legge til av hver komponent (ml) | |||
| DTTC endelig konsentrasjon (mM) | DTTC arbeidsløsning (200 mM) | AuNP | Vann |
| 0.2 0.1 | 20 | 79.9 | |
| 0.6 | 0.3 | 20 | 79.7 |
| 1 | 0.5 | 20 | 79.5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2,5 | 20 | 77.5 |
| 7 | 3,5 | 20 | 76.5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
Tabell 1. DTTC fortynning eksempel. Forskjellige fortynninger av DTTC og de tilhørende volumer av lager DTTC, gull nanopartikler løsning, og vann.
3. Immunoassay Plate Forberedelse
- Bind ønsket antigen til immunologisk plate.
- Forbered nok utvannet antigen (50 ug / ml) for å fylle polystyren brønner. Vortex løsningen,og straks legge løsningen på platebrønnene. Tillater antigen å binde seg til platene i 1 time ved romtemperatur.
- Vask av ubundne antigener.
- Fjern overflødig antigen løsning ved dumping løsning i en avfallsbeholder og treffer platen mot et papirhåndkle dekket bordet.
- Legg TBST til brønnene for å vaske overflaten og deretter fjerne vaske på samme måte som tidligere nevnt. Gjenta dette trinnet to ganger til.
- Blokk gjenværende bindingsseter på platen for å forhindre ikke-spesifikk binding.
- Legg 70 ul HSA-blokkerende løsning til hver brønn på platen og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
- Ta ut og skylle platen ved hjelp av samme fremgangsmåte som angitt i trinn 3.2. Dekk platen og butikken tørr ved 4 ° C til den er klar for videre bruk.
- Functionalize immunoassay plate.
- Legg 70 mL av than probe nanopartikler fremstilt i avsnitt 2 til den første kolonnen i en 96-brønns plate og fortynne etterfølgende kolonner ved anvendelse av en 1: 2 seriefortynning. Tillat platen inkuberes i minst 1 time. Et eksempel på hvordan man skal fremstille immunanalyse platen er gitt i Figur 3.
- Vask platen med TBST fem ganger som beskrevet i trinn 3.2, og pass på å kvitte seg med de AuNPs riktig. Etter siste vask, tilsett 70 mL 1x PBS til hver brønn og dekk til med en tallerken segl.
MERK: Kontrollprøvene skal være klar. Hvis ikke-spesifikk binding har funnet sted, vil kontrollprøvene har en lignende farge som testprøvene.
- Test analysen følsomhet ved UV-Vis og Raman-spektroskopi.
- For hver brønn, måle UV-Vis-spekteret strekker 400-700 nm ved hjelp av en plate-leser UV-Vis spektrofotometer.
- Ved hjelp av et invertert mikroskop Raman, fokusere målet på overflaten av brønnen som har AuNP prober. obholde et Raman-spektrene av brønnen. Samle et spekter som spenner fra 1800 cm -1 til 400 cm -1. Gjenta dette trinnet for alle brønner.
- Ved hjelp av en passende spektral programvare, utføre en 11 th ordens baseline korreksjon for Raman spektra og en 3. ordens for UV-Vis spektra.
- Ved hjelp av en passende spektral programvare, normalisere Raman og UV-Vis spektra. Angi den maksimale verdien til 1 og skalere alle andre verdier tilsvarende. Å normalisere Raman spektra, velger du en unik polystyren topp og sette den lik 1 og skalere alle andre verdier tilsvarende.
- Ved hjelp av en passende spektral programvare, utføre peak integrasjon for hvert spektrum. For Raman-spektra, må den topp som representerer den Raman reporteren være i et område fraværende av polystyren topper. For å utføre peak integrasjon, angi integrerte grenser for den ønskede topp og tar opp ønsket toppareal for alle prøver inkludert kontrollene.
- plot den gjennomsnittlige toppområdet av interesse som en funksjon av logaritmen av konsentrasjonen AuNP med feilfelt for hvert punkt som angir den tilhørende standardavvik. Monter disse kalibreringspunkter til en 4-parameter logistikk kurve.
- Bestem gjennomsnittet av emnet ved å midle området av toppen av interesse for en blindprøve. Bestemme standardavviket av disse områdene; Dette er standardavviket av emnet.
- For den samme topp analysert i forrige trinn finner standardavviket til at topparealet for den laveste konsentrasjon.
- Beregn grensen av emnet og nedre deteksjonsgrense som er angitt i representative resultater delen. Bruk disse verdiene med 4PL kalibreringskurver for å bestemme LLOD i form av AuNP konsentrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble 60 nm gullpartikler anvendes for UV-vis spektroskopi. UV-Vis absorpsjon spektra fra 400 til 700 nm ble samlet inn og topparealene for hvert AuNP konsentrasjon ble bestemt ved hjelp av åpen kildekode spektralanalyse programvare 8. Før topp integrasjon, samlet spektra gikk baseline korreksjon ved hjelp av en tre-punkts eksakt tilpasning. Topparealene ble brukt til å generere en logaritmisk kalibreringskurve som vist i figur 4. Det skal bemerkes at figurene 4 og 5 innlemmet logaritmiske kalibreringskurver. Bruk av ikke-lineære kalibreringskurver kan betydelig utvide det dynamiske området til en analyse, og har blitt en akseptert praksis for ulike immunologiske analyser som krever lav rekkevidde deteksjon 9,10.
For å vurdere kvantitativt sensitiviteten til analysen, grensen for den tomme (LOB) ogden nedre deteksjonsgrense (LLOD) ble beregnet som følger 
hvor standardavvik av emnet og av den laveste prøvekonsentrasjon er σ BLANK og σ lav, henholdsvis, mens 
er middelverdien av emnet 11,12. Ved hjelp av disse definisjonene, samt den genererte 4-parameters logistisk kalibreringskurve, den LLOD for UV-Vis var 15:05 av gull nanopartikler.
Ved hjelp av en Raman-spektroskopi oppsett beskrevet tidligere 7, en 785 nm invertert mikroskop Raman ble brukt til å samle spektra fra DTTC Raman reporter forbundet med den funksjonaliserte immunoanalyse plate. Driftsparametre inkludert 7 mW laser makt og en 10 sek actakelse tid. Spektra gikk utgangskorreksjons (11 th ordens polynom) og toppintegrering. Figur 5 viser den fire-parameters logistisk kalibreringskurve generert for de DTTC topparealene for de 493 cm-1 og 508 cm-1 DTTC topper. Ettersom den nøyaktige konsentrasjonen av Raman reporter bundet til AuNP overflaten var ukjent, ble kalibreringskurve basert på AuNP konsentrasjon. Ved hjelp av ligningene som er beskrevet ovenfor, ble LLOD bestemt til å være 13:07 av AuNP.
Figur 1. Illustrasjon av direkte og indirekte immunologisk analyse. Illustrasjon indirekte (A) og direkte (B) deteksjon ordninger for immunologiske analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Nanopartikkel sonde fabrikasjon illustrasjon. Prosessen med funksjon Raman / UV-Vis prober for immunologiske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Klikk her for å se et mye større versjon av dette tallet.
Figur 3. Forberedt immunologisk plate. Bilde av en forberedt immunoassay plate. Rader A til E er tester prøver mens radene F gjennom H er kontrollprøver. Kolonne 1 inneholder ufortynnet nanopartikler og hver påfølgende kolonne har halvparten av konsentrasjonenav AuNP sonder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. UV-Vis-kalibreringskurve for immunologisk analyse ved hjelp av nanopartikkel-prober. Logaritmisk kalibreringskurve for UV-Vis topparealene til nanopartikkel-konsentrasjon. Den tilpassede linjen er en 4-parameter logistikk (4PL) kurve. Feilfelt angir toppområdet standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Klikk her for å se et mye større versjon av dette tallet.
Figur 5. Raman kalibreringskurve for immunoanalyse ved hjelp av nanopartikkel-prober. Kalibreringskurve korrelere Raman reporter topparealet til gull nanopartikkelkonsentrasjon. Den tilpassede linjen er en 4-parameter logistikk (4PL) kurve. Feilfelt angir toppområdet standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Klikk her for å se et mye større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den detaljerte protokollen, er det flere viktige punkter til adressen. Ett problem er valget av Raman reporter og gull nanopartikler. Selv om protokollen ble skrevet for å være tilpasset for individuell bruk, ble den Raman reporteren DTTC brukt som et eksempel. DTTC er et positivt ladet reporter og binder seg til negativt ladet overflater som citrate avkortet AuNPs. Denne protokollen kan tilpasses for negativt ladet journalister ved hjelp av gull nanopartikler med en positiv overflateladning. For eksempel, polyetylenimin (PEI) avkortet AuNPs gi en positiv overflateladning og bedre binding med negativt ladede journalister.
Å opprettholde balansen mellom proteiner og nanopartikler er et kritisk trinn i denne protokollen. Denne balanse er oppnådd ved å tilsette PEGylerte antistoffer ved en optimalisert antistoff til gull nanopartikkel-forhold på 200: 1. Dersom det pegylerte antistoffer tilsettes til gull nanopartikkel-oppløsning ved en vesentlig høyere forhold enn this, kan ion-indusert partikkel aggregering oppstå. Alternativt kan det, for lite av et forhold, ville protein aggregasjon og uløselighet forekomme. Dette forholdet må avgjøres i hvert enkelt tilfelle.
En annen kritisk protokoll trinn er konjugering av OPSS-PEG-NHS til antistoffet. Dette trinnet blir etterfulgt av suspende OPSS-PEG-NHS i natriumbikarbonat hvor NHS gruppen bindes til antistoffet. Denne konjugering trinn konkurrerer med ugunstig hydrolyse reaksjon som beskrevet tidligere 7. Hydrolysereaksjonen er mer sannsynlig å skje over tid, og som sådan, skal det OPSS-PEG-NHS til antistoffbinding skal utføres umiddelbart.
Sluttproduktet av protokollen er en immunoanalyse som kan bli testet for følsomhet ved bygging av en kalibreringskurve ved hjelp av UV-Vis og Raman-spektroskopi. Resultatene tyder på at immunanalysen er sammenlignbare med andre bioanalyser 13-17 som har deteksjonsgrenser of 13:00. Ikke bare er Raman immunologisk følsomhet konkurransedyktig med andre biologiske tester, har det potensial for økt følsomhet ved hjelp av overflate forbedret Raman-spektroskopi (SERS). SERS omfatter bruk av gull nanopartikler, eller en ru overflate for å forbedre gull Raman-utslipp. Som denne protokollen inneholder allerede bruk av gull-nanopartikler sonder, er det godt egnet for utvikling i en SERS immunoassay. I fremtiden, kan denne teknikken bli anvendt for utvikling av en lysspredende immunoanalyse som kan brukes for å påvise mange protein analytter samtidig. Som biomarkør profilering blir stadig viktigere for diagnose og behandling av en rekke sykdommer, kan denne teknikken ha dyptgripende kliniske anvendelser.
Vanlige problemer forbundet med denne protokollen omfatter aggregering av gull nanopartikler, utilstrekkelig binding av proteiner som blokkerer binding av ikke-spesifikke proteiner, og en svak Raman signal. Disse problemene eroppført i tabell 2 sammen med den mulige årsaken til problemet og handlings skritt for å løse hvert problem. Andre problemer kan oppstå på grunn av begrensninger i protokollen. For det første er denne protokollen begrenset til AuNP konsentrasjoner opp til 5 x 10 12 partikler / ml som høyere konsentrasjoner har en tendens til å forårsake aggregasjon. Teknikken er avhengig av stabile, uaggregerte nanopartikler for estimering av nanopartikkel konsentrasjoner. Hvis det er aggregering, vil estimering av nanopartikkelkonsentrasjonen være forutinntatt. Protokollen er også begrenset til Raman reportere med topper sterk nok til å overvinne polystyren bakgrunn og er unike fra polystyren. Til slutt, ved bruk av tradisjonelle 96-brønners plater begrenser protokollen som skal brukes av en invertert mikroskop Raman på grunn av høyden av platene. Ellers må en lav forstørrelse anvendes for Raman-mikroskopobjektiv for å få plass til den 96-brønns plate høyde.
| Symptom | Sannsynlig grunn | Løsning |
| Gull nanopartikler samle etter sentrifugering og resuspensjon. | Raman-reporter-konsentrasjonen er for høy. | Test en rekke Raman reporter konsentrasjoner som spesifisert i punkt 2.2 eller denne protokollen. |
| Antistoffet til AuNP-forholdet er for høyt. | Redusere antall PEGylerte antistoffer bundet til nanopartikkeloverflaten for å øke partikkelstabilitet. | |
| MPEG-SH blokkeringsmiddel, er ikke bindende for AuNP overflaten. | Forbered MPEG-SH løsning frisk før nanopartikkel blokkering. | |
| Ikke-spesifikk binding til immunoanalyse plateoverflaten | Immunologisk Platen er utilstrekkelig blokkert. | Forbered blokkering løsning frisk før platen moroctionalization. |
| Molekylvekten av mPEG-SH er ikke stor nok. | Kontroller at mPEG-SH-molekylet anvendt for blokkering har en molekylvekt på 5000 kDa eller høyere. | |
| Svak eller fraværende Raman signal | Raman-reporter er ikke bindende til partikkeloverflaten. | Sikre Raman-reporter tillates å binde i minst 30 minutter før tilsetning av PEGylert antistoff. |
| Molekylvekten av mPEG-SH er ikke stor nok. | Pass på at nanopartikkel blokkeringsmidlet har riktig kostnad for ioniske Raman reporter bindende. |
Tabell 2. Feilsøking for vanlige problemer. Liste over vanlige problemer i løpet av protokoll med tilhørende årsaker og korrigerende gjøremål.
I dette manuskriptet, har vi presentert aprotocol for tilpasset fabrikasjon av en nanopartikkel-probe basert immunologisk analyse for analyse ved hjelp av UV-Vis / Raman-spektroskopi. Protokollen inneholder funksjonalisering av gull nanopartikler med Raman journalister og immunglobuliner for direkte påvisning av antigener bundet til en polystyren plate. Protokollen kan tilpasses en bestemt Raman reporter og tilhørende eksitasjon bølgelengde. Gull nanopartikkel form og størrelse kan også forandres. Men løsningen forholdstall for riktig binding vil variere i henhold til Raman reporter brukt samt nanopartikkel størrelse, form og produsent. Protokollen er skrevet for å cue forskere når løsningsforhold må bestemmes for hver unike arrangementet og dermed gi rom for tilpasset fabrikasjon i henhold til forskningsbehov. I motsetning til de typiske fluorescerende / kolo immunologiske protokoller, har denne protokollen potensial for større multipleksing evner mens utnytte en allerede eksisterende infrastruktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 ml | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 | |
| In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/ (2004).
- ELISA development guide. , [Accessed: 28-Mar-2016] https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.effemm2.de/spekwin/ (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
