Abstract
Immunodosaggi sono utilizzati per rilevare le proteine in base alla presenza di anticorpi associati. A causa del loro ampio utilizzo nella ricerca e ambito clinico, una grande infrastruttura di strumenti e materiali immunodosaggio può essere trovato. Ad esempio, 96 e 384 e lastre di polistirene sono disponibili in commercio e hanno un design standard per ospitare ultravioletti visibile macchine spettroscopia (UV-Vis) di diversi produttori. Inoltre, una vasta gamma di immunoglobuline, tag di rilevamento, e agenti bloccanti per i disegni personalizzati per prove immunologiche come la metodica immunoenzimatica (ELISA) sono disponibili.
Nonostante l'infrastruttura esistente, i kit ELISA standard non soddisfano tutte le esigenze di ricerca, che richiede lo sviluppo immunologico individualizzato, che può essere costoso e richiede molto tempo. Ad esempio, i kit ELISA hanno bassa multiplexing (rilevamento di più di un analita in un momento) funzionalità come di solito dipendono fluorescenza o colmetodi orimetric per il rilevamento. Colorimetrici ed analisi fluorescenti a base hanno limitate capacità di multiplexing a causa di ampi picchi spettrali. Al contrario, Raman metodi spettroscopia basati hanno una maggiore capacità di multiplexing a causa di picchi di emissione strette. Un altro vantaggio della spettroscopia Raman è che i giornalisti Raman esperienza significativamente meno photobleaching di tag fluorescenti 1. Nonostante i vantaggi che i giornalisti Raman hanno più tag fluorescenti e colorimetriche, protocolli per fabbricare test immunologici Raman-based sono limitati. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per preparare sonde funzionalizzati da utilizzare in combinazione con lastre di polistirene per il rilevamento diretto di analiti di analisi UV-Vis e spettroscopia Raman. Questo protocollo permetterà ai ricercatori di adottare un approccio fai-da-te per il futuro il rilevamento multi-analita mentre capitalizzando sulle infrastrutture prestabilito.
Introduction
immunodosaggi panino tipici indirettamente rilevano la presenza di un antigene usando due anticorpi. L'anticorpo di cattura è legato ad una superficie solida e forma un complesso antigene-anticorpo quando in prossimità di un antigene appropriato. Un anticorpo di rilevazione viene quindi introdotto e si lega all'antigene. Dopo il lavaggio, i / antigene / anticorpo resti complessi di anticorpi e viene rilevato dal anticorpo di rilevazione etichettato come mostrato nella Figura 1A. Rilevamento Tipica è fatto da un rivelatore a fluorescenza o colorimetrico, limitando multiplexing a 10 analiti causa di ampi picchi spettrali 2,3. Al contrario, i sistemi basati su Raman hanno molto stretti picchi di emissione con conseguente capacità di multiplexing avanzate con le fonti che sostengono il rilevamento simultaneo di fino a 100 analiti 2,3.
Molte fonti bibliografiche sono disponibili che coprono importanti aspetti relativi alla saggi immunologici 4-6 come passo-passodettagli per creare kit personalizzati ELISA. Purtroppo, questi protocolli sono per il rilevamento a fluorescenza o colorimetrico, limitando la capacità di multiplexing di saggi immunologici personalizzati. Per rispondere a questa esigenza, vi presentiamo una procedura dettagliata per fabbricare l'UV-Vis / Raman immunologico pubblicato in precedenza 7 per un test immunologico diretta come illustrato nella figura 1B.
Questo protocollo comprende la fabbricazione di sonde a base di nanoparticelle di oro funzionalizzato, illustrata in figura 2. La procedura per effettuare le sonde / UV-Vis Raman inizia legandosi reporter Raman alla superficie di nanoparticelle di oro (AuNPs). I AuNPs vengono funzionalizzati con anticorpi che sono associati con polietilenglicole (PEG). Restanti siti di legame sulle AuNPs sono bloccati dal legame metossi tiolo polietilene glicole (MPEG-SH) per AuNPs per evitare la successiva legame non specifico durante l'analisi. Le sonde AUNP preparati sono testati legandosi agli antigenifissato ai pozzetti di una piastra di polistirene come illustrato in Figura 1B. Al lavaggio del piatto, le sonde AUNP vengono rilevati utilizzando la spettroscopia UV-Vis, mentre i reporter Raman associati vengono rilevati con spettroscopia Raman. La combinazione di UV-Vis e Raman spettrale dei dati fornisce due metodi di analisi, migliorando le capacità di questo test immunologico.
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Protocol
1. Preparazione del buffer
- Tampone fosfato (PBS)
- Diluire 50 ml di 10x PBS con 450 ml di acqua di grado HPLC per fare una concentrazione 1x PBS. filtro sterile la soluzione con un filtro di 0,22 micron.
- Conservare la soluzione a temperatura ambiente.
- Preparazione di Tris Buffered Saline + Tween 20 (TBST)
- Diluire 50 ml di 10x Tris Buffered Saline (TBS) con 450 ml di acqua di grado HPLC per fare una concentrazione 1x. Aggiungere 250 ml di Tween-20 per un 0,05% (v / v) di Tween-20. filtro sterile la soluzione con un filtro di 0,22 micron.
- Conservare a temperatura ambiente.
- Preparazione di Human albumina sierica (HSA) soluzione di saturazione
- Pesare 0,45 g di HSA in 15 ml di filtrato sterile PBS 1x per fare un 3% w / v soluzione di HSA. soluzione Vortex fino HSA è completamente sciolto.
- Conservare la soluzione di HSA a 4 ° C.
NOTA: Bovine Serum Albumin(BSA) può essere utilizzato anche come soluzione bloccante.
- Preparazione di anticorpo PEGylated soluzione (PEG-Ab)
NOTA: La soluzione di anticorpi deve essere esente da carrier o stabilizzanti proteine come BSA, che potrebbero interferire con reazioni di coniugazione dalla competizione per il n-hydroxysulfosuccinimide (NHS) siti di legame. Se l'anticorpo viene fornito in una soluzione Tris o tampone glicina, deve subire un cambio di buffer per evitare ammine o sali di ammonio di interferire con la reazione di coniugazione NHS. Se l'anticorpo è in forma liofilizzata, può essere risospeso secondo le raccomandazioni del produttore ad una concentrazione di 1-10 mg / ml.- Per gli anticorpi in tampone Tris o glicina, eseguire uno scambio buffer 100 mM di bicarbonato di sodio usando una colonna dissalazione. Utilizzare il buffer 100 mM per aumentare il pH a circa 8,5 per accelerare la reazione di coniugazione.
- Idratare orto-piridil disolfuro-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) con 100 mM sodium bicarbonato per un volume di 1 ml ad una concentrazione di 1 mg / ml o superiori.
NOTA: OPSS-PEG-NHS dovrebbe essere fresco e utilizzato entro circa 20 minuti. Il gruppo NHS sulla OPSS-PEG-NHS ha una emivita di circa 20 minuti in una soluzione acquosa a pH 8,5. - Aggiungere OPSS-PEG-NHS alla soluzione di anticorpi in un rapporto 2: 1 (PEG: Anticorpo) Rapporto coniugazione da utilizzare per i campioni di prova. In una provetta da microcentrifuga, aggiungere OPSS-PEG-NHS alla soluzione di antigene in un rapporto 2: 1 coniugazione ad essere utilizzato per il controllo.
NOTA: Il rapporto 2: 1 è supponendo un'efficienza coniugazione 50%. L'obiettivo è quello di etichettare ogni anticorpo con una catena di PEG. In questa fase, un eccesso di etichettatura è meglio di sotto-etichettatura. Utilizzare la seguente equazione per determinare i volumi adeguati di OPSS-PEG-NHS e soluzione di anticorpi:
dove V è il volume, C è la concentrazione espressa in molecole otibodies per ml. Indici PEG e Ab sono OPSS-PEG-NHS e anticorpi, rispettivamente. Il volume finale deve essere di circa 250 microlitri. - Incubare soluzione di PEG-Ab a 4 ° C per 8 ore o durante la notte. Conservare la soluzione in aliquote di circa 25 ml di lavoro a -20 ° C per limitare i cicli di gelo-disgelo e assicurarsi di utilizzare basse tubi vincolanti.
2. Preparare UV-Vis / Raman Sonde
- Preparare la soluzione AUNP nuda
- Preparare una soluzione 2 ml di AuNPs con una concentrazione di circa 1 x 10 11 particelle per ml.
- Se i AuNPs devono essere concentrati, riempire i tubi a bassa centrifuga legame con 2.000 ml di brodo AUNP e centrifugare a 5000 xg per 20 minuti o fino a quando il surnatante è chiaro. Rimuovere il surnatante pipettando, facendo attenzione a non disturbare il pellet AUNP.
- Unire le soluzioni rimanenti AUNP in un tubo e stimare la concentrazionezione ottenendo una misurazione UV-Vis e confrontando i valori di concentrazioni note come questa è una relazione lineare.
- Preparare una soluzione 2 ml di AuNPs con una concentrazione di circa 1 x 10 11 particelle per ml.
- Determinare il rapporto di etichettatura giornalista Raman appropriato
- Preparare una soluzione di lavoro del reporter Raman sciolto in metanolo. Questa concentrazione dipenderà reporter utilizzato. In questo lavoro, preparare ioduro 3,3'-diethylthiatricarbocyanine (DTTC) ad una soluzione di lavoro di 200 micron.
- Assumendo un volume finale di 100 microlitri per ciascun pozzetto, aggiungere sufficiente della soluzione giornalista lavoro a ciascun pozzetto della prima riga di una piastra a 96 pozzetti in modo che il reporter Raman varierà in concentrazioni da 0,2 micron a 10 micron. Aggiungere acqua sufficiente per HPLC a ciascun pozzetto tale che il volume è di 80 microlitri. Aggiungere 20 ml di AUNP a ciascun pozzetto fare un volume finale di 100 microlitri per ciascun pozzetto. Un esempio è fornito nella Tabella 1.
- Misurare la UV-Vis spettri da 400 a700 nm con una piastra di lettura UV-Vis spettrofotometro. La concentrazione appropriata è la più alta concentrazione con picchi definiti per gli spettri UV-Vis. Ripetere il punto 2.2.2 a concentrazioni crescenti fino a quando il più alto tasso di concentrazione di giornalisti Raman per AuNPs viene trovato.
NOTA: Il colorante e la forma AUNP, le dimensioni, e il produttore influenzano la concentrazione adeguata. Pertanto, i passaggi elencati devono essere valutati e modificati a seconda dei componenti utilizzati. Questo protocollo ha comportato l'uso di un colorante carica positiva. Come tale, vincolante tra il AUNP e reporter è stato migliorato utilizzando AuNPs carica negativa. Ciò è stato fatto utilizzando citrato innevate AuNPs. Vedi la sezione di discussione per ulteriori dettagli.
- Binding Raman giornalista e PEG-Ab per AUNP
- Preparare due 1,5 ml lotti di AUNP e Raman reporter alla concentrazione precedentemente determinata, consentendo il reporter Raman di legarsi ai AuNPs per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere l'anticorpo PEGylated (PEG-Ab) per un lotto di soluzione giornalista AUNP e Raman per creare un 200: 1 rapporto di anticorpi alle particelle. Questa soluzione sarà per i campioni di prova. In una provetta da microcentrifuga, aggiungere l'antigene PEGylated all'altro lotto della soluzione giornalista AUNP e Raman a 200: 1 rapporto di anticorpo a particelle ad essere utilizzato come controllo. Incubare le soluzioni per 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: Il rapporto tra anticorpi per particelle sarà specifico per le AuNPs e colorante usato e deve essere ottimizzato per ogni singolo caso. L'obiettivo qui è quello di avere il più alto rapporto di anticorpi per le sonde AUNP di legarsi evitando l'aggregazione delle particelle. Utilizzare la seguente equazione per determinare i volumi adeguati di aggiungere insieme:
dove V è il volume, C è la concentrazione espressa in particelle o anticorpi per ml. La pinnaVolume al dovrebbe essere di circa 1,5 ml.
- Blocca i siti sulla superficie AUNP con MPEG-SH rimanente.
- Preparare mPEG-SH sciogliendo solido metossipolietilenglicole tiolo ad una concentrazione di 200 mM con acqua. Agitare la soluzione fino a MPEG-SH è completamente sciolto.
- Aggiungere MPEG-SH a 40.000: 1 rapporto alla soluzione AUNP-PEG-Ab fatto in fase 2.3. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 minuti per garantire i siti rimanenti sul nanoparticelle d'oro sono bloccati. Utilizzare la seguente equazione per determinare i volumi adeguati di aggiungere insieme:
dove V è il volume, C è la concentrazione espressa in particelle o anticorpi per ml. Il volume finale deve essere di circa 1,5 ml.
- Recuperare sonde funzionalizzati Raman.
- particelle centrifugare a 5000 xg per 20 minuti in condizioni di scarsa legano ctubi entrifuge o fino a quando il surnatante è chiaro. Rimuovere il surnatante pipettando facendo attenzione a non disturbare i AuNPs.
- Risospendere le particelle di 1 ml di soluzione PBS 1x che è stato fatto in precedenza. Stimare la concentrazione AUNP prendendo una misura UV-Vis di un piccolo volume di soluzione (3 ml) e confrontare i risultati di misurazioni da una concentrazione nota AUNP. Regolare il volume tale che la soluzione finale è di almeno 1 x 10 11 particelle per ml.
- Le soluzioni Conservare a 4 ° C fino a quando non è utilizzato per la funzionalizzazione della piastra immunologico. Utilizzare le soluzioni entro una settimana.
| Volumi per aggiungere di ciascun componente (ml) | |||
| DTTC concentrazione finale (mm) | Soluzione di lavoro DTTC (200 mm) | AUNP | acqua |
| 0.2 0.1 | 20 | 79.9 | |
| 0.6 | 0.3 | 20 | 79,7 |
| 1 | 0.5 | 20 | 79.5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77,5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76,5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
Tabella 1. DTTC esempio di diluizione. Varie diluizioni di DTTC ei volumi associati di magazzino DTTC, soluzione di nanoparticelle d'oro, e l'acqua.
3. Immunoassay Piastra Preparazione
- Associare l'antigene desiderato alla piastra immunologico.
- Preparare abbastanza antigene diluito (50 mg / ml) per riempire i pozzi di polistirolo. Agitare la soluzione,e aggiungere immediatamente la soluzione ai pozzetti della piastra. Consentire l'antigene di legarsi alle piastre per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare gli antigeni legati.
- Rimuovere la soluzione eccesso di antigene per soluzione scarico in un contenitore per lo smaltimento e di colpire la piastra contro un tavolo di carta asciugamano coperto.
- Aggiungere TBST ai pozzetti per lavare la superficie quindi rimuovere il lavaggio nello stesso modo come detto in precedenza. Ripetere questa operazione altre due volte.
- Blocco rimanendo siti di legame sul piatto per evitare legame non specifico.
- Aggiungere 70 ml di soluzione di saturazione HSA a ciascun pozzetto della piastra ed incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere e lavare la piastra con la stessa procedura, come specificato al punto 3.2. Coprire la piastra e magazzino a secco a 4 ° C fino al momento per un ulteriore uso.
- Funzionalizzare piatto immunologico.
- Aggiungere 70 ml di tegli sonda nanoparticelle preparate nella sezione 2 alla prima colonna di una piastra a 96 pozzetti e diluire colonne successive utilizzando una diluizione 1: seriale 2. Lasciare che la piastra per incubare per almeno 1 ora. Un esempio di come preparare la piastra immunodosaggio La Figura 3.
- Lavare la piastra con TBST cinque volte come descritto nei passi 3.2, facendo in modo di disporre delle AuNPs in modo appropriato. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 70 ml di PBS 1x per ogni pozzetto e coprire con una guarnizione della piastra.
NOTA: I campioni di controllo devono essere chiari. Se si è verificato legame non specifico, i campioni di controllo avranno un colore simile a campioni di prova.
- Test di sensibilità del test da UV-Vis e spettroscopia Raman.
- Per ciascun pozzetto, misurare l'UV-Vis spettri compresa tra 400 e 700 nm con una piastra lettura UV-Vis spettrofotometro.
- Utilizzando un microscopio invertito Raman, focalizzare l'obiettivo sulla superficie del pozzo che ha le sonde AUNP. Obnere un spettri Raman del pozzo. Raccogliere uno spettro che va da 1.800 cm -1 a 400 cm -1. Ripetere questo passaggio per tutti i pozzetti.
- L'utilizzo di un software di spettrale del caso, eseguire un ordine correzione polinomiale di base 11 ° per gli spettri Raman e un ordine polinomiale 3 ° per l'UV-Vis spettri.
- L'utilizzo di un software adeguato spettrale, normalizzare il Raman e UV-Vis spettri. Impostare il valore massimo di 1 e scalare tutti gli altri valori di conseguenza. Per normalizzare gli spettri Raman, seleziona un picco polistirene unico e impostarlo uguale a 1 e scalare tutti gli altri valori di conseguenza.
- L'utilizzo di un software di spettrale del caso, eseguire l'integrazione di picco per ogni spettro. Per spettri Raman, il picco corrispondente al giornalista Raman deve essere in una regione assente di picchi di polistirene. Per eseguire l'integrazione dei picchi, specificare i limiti integrali per il picco desiderato e registrare l'area del picco desiderato per tutti i campioni inclusi i controlli.
- Plot la superficie media picco di interesse in funzione del log della concentrazione AUNP con barre di errore per ciascun punto indica la sua deviazione standard associati. Montare questi punti di calibrazione per una curva logistica a 4 parametri.
- Determinare il valore medio del bianco dalla media dell'area del picco di interesse per un campione in bianco. Determinare la deviazione standard di queste aree; questa è la deviazione standard del fustellato.
- Per lo stesso picco analizzata nel passaggio precedente, per la deviazione standard di tale area di picco per la concentrazione più bassa.
- Calcolare il limite del limite vuoto e inferiore di rilevamento come specificato nella sezione risultati rappresentativa. Utilizzare questi valori con le curve di calibrazione per determinare la 4PL LLOD in termini di concentrazione AUNP.
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Representative Results
In questo studio, 60 particelle di oro nm sono stati usati per spettroscopia UV-Vis. UV-Vis spettri di assorbimento da 400 a 700 nm sono stati raccolti e le aree dei picchi per ciascuna concentrazione AUNP sono stati determinati utilizzando un sistema open source software di analisi spettrale 8. Prima di picco integrazione, gli spettri raccolto subito correzione al basale utilizzando un polinomio tre punti. Aree dei picchi sono stati usati per generare una curva di calibrazione logaritmica come mostrato nella Figura 4. Va notato che figure 4 e 5 incorporati curve di calibrazione logaritmiche. L'uso di curve di calibrazione non lineari in grado di ampliare significativamente la gamma dinamica di un test ed è diventata una pratica accettata per vari test immunologici che richiedono capacità di rilevamento bassa gamma 9,10.
Per valutare quantitativamente la sensibilità del saggio, il limite del vuoto (LOB) eil limite inferiore di rilevamento (LLOD) è stato calcolato come segue 
dove deviazione standard del vuoto e della concentrazione del campione a partire da σ BLANK e σ Basso, rispettivamente, mentre 
è il valore medio del bianco 11,12. Usando queste definizioni, nonché la curva di calibrazione logistica a 4 parametri generati, il LLOD per UV-Vis era 15:05 di nanoparticelle di oro.
Utilizzando una configurazione spettroscopia Raman descritto in precedenza 7, una 785 nm microscopio Raman invertito è stato utilizzato per raccogliere gli spettri dal giornalista DTTC Raman associato con la piastra immunologico funzionalizzato. I parametri operativi inclusi 7 MW potenza del laser e di un AC 10 sectempo quisizione. Spectra subito correzione al basale (11 ° ordine polinomiale) e l'integrazione dei picchi. La Figura 5 mostra la curva di calibrazione logistica a 4 parametri generato per le aree dei picchi DTTC per i 493 cm -1 e 508 cm -1 picchi DTTC. Come l'esatta concentrazione di Raman reporter legata alla superficie AUNP era sconosciuta, la curva di calibrazione è stata basata sulla concentrazione AUNP. Utilizzando le equazioni di cui sopra, la LLOD è stata determinata da 1:07 di AUNP.
Figura 1. Illustrazione di diretta e indiretta immunologico analisi. Illustrazione di indiretta (A) e sistemi (B) di rilevazione diretta per saggi immunologici. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. nanoparticelle sonda fabbricazione illustrazione. Processo di funzionalizzazione / sonde UV-Vis Raman per gli immunodosaggi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Clicca qui per vedere una versione molto più grande di questa figura.
Figura 3. piatto immunologico preparati. Immagine di un piatto preparato immunologico. Le righe da A a E sono prove di campioni, mentre le righe F attraverso H sono campioni di controllo. La colonna 1 contiene le nanoparticelle non diluiti e ogni colonna successiva ha la metà della concentrazionedi sonde AUNP. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. curva di calibrazione UV-Vis per immunodosaggio che utilizza sonde nanoparticelle. Curva di calibrazione logaritmica per gli UV-Vis aree dei picchi di concentrazione di nanoparticelle. La linea montato è una curva a 4 parametri logistici (4PL). Le barre di errore indicano l'area del picco deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Cliccate qui per vedere una versione molto più grande di questa figura.
Figura curva di calibrazione 5. Raman per dosaggio immunologico basati su sonde nanoparticelle. Curva di calibrazione correlando Raman giornalista area del picco di concentrazione delle nanoparticelle d'oro. La linea montato è una curva a 4 parametri logistici (4PL). Le barre di errore indicano l'area del picco deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Cliccate qui per vedere una versione molto più grande di questa figura.
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Discussion
Nel protocollo dettagliato, ci sono diversi punti critici da affrontare. Un problema è la scelta di Raman giornalista e nanoparticelle d'oro. Anche se il protocollo è stato scritto per essere adattato per l'uso individuale, il giornalista Raman DTTC è stato utilizzato come esempio. DTTC è un reporter carico positivamente e si lega a superfici come citrato innevate AuNPs carica negativa. Questo protocollo può essere adattato per giornalisti caricati negativamente utilizzando nanoparticelle di oro con una carica superficiale positiva. Ad esempio, Polyethyleneimine (PEI) innevate AuNPs forniscono una carica superficiale positiva e una migliore legame con i giornalisti caricati negativamente.
Mantenere l'equilibrio tra le proteine e nanoparticelle è un passaggio fondamentale di questo protocollo. Questo equilibrio si ottiene aggiungendo anticorpi PEG ad un anticorpo ottimizzato rapporto nanoparticelle di oro di 200: 1. Se gli anticorpi PEG vengono aggiunti alla soluzione di oro nanoparticelle con un rapporto significativamente superiore this, può verificarsi l'aggregazione delle particelle di ioni indotta. In alternativa, a troppo piccolo di un rapporto, si sarebbe verificato aggregazione proteica e l'insolubilità. Questo rapporto deve essere determinata in ogni singolo caso.
Un altro passo protocollo critico è la coniugazione di OPSS-PEG-NHS per l'anticorpo. Questa fase è preceduta sospendendo OPSS-PEG-NHS in bicarbonato di sodio in cui il gruppo NHS si lega all'anticorpo. Questo passo coniugazione compete con la reazione di idrolisi sfavorevole come descritto in precedenza 7. La reazione di idrolisi è più probabile che accada nel tempo, e, come tale, il OPSS-PEG-NHS di legame anticorpale deve essere eseguita immediatamente.
Il prodotto finale del protocollo è un immunodosaggio che possono essere testati per la sensibilità per la costruzione di una curva di calibrazione utilizzando UV-Vis e spettroscopia Raman. I risultati indicano che l'immunodosaggio è paragonabile ad altri saggi biologici 13 - 17 anni che hanno limiti di rivelazione of 13:00. Non solo la sensibilità immunodosaggio Raman competitivo con altri saggi biologici, ha il potenziale di miglioramento della sensibilità mediante Spettroscopia Raman amplificata da superfici (SERS). SERS incorpora l'uso di nanoparticelle d'oro o una superficie d'oro ruvida per migliorare l'emissione Raman. Poiché questo protocollo prevede già l'uso di sonde oro-nanoparticelle, è adatto per lo sviluppo in un test immunologico SERS. In futuro, questa tecnica può essere utilizzata per lo sviluppo di un immunodosaggio dispersione della luce che potrebbe essere utilizzato per rilevare molti analiti proteici simultaneamente. Come biomarker profiling diventa sempre più importante per la diagnosi e il trattamento di un'ampia varietà di malattie, questa tecnica può avere applicazioni cliniche profonde.
Problemi comuni associati a questo protocollo includono aggregazione di nanoparticelle di oro, insufficiente legame di bloccare proteine, legame delle proteine non specifici, ed un segnale Raman debole. Questi problemi sonoelencati nella tabella 2 con la possibile causa del problema e di azione misure per affrontare ogni problema. Altri problemi possono sorgere a causa di limitazioni del protocollo. Innanzitutto, questo protocollo è limitato a concentrazioni AUNP fino a 5 x 10 12 particelle / ml come concentrazioni più elevate tendono a causare aggregazione. La tecnica si basa su stabili, nanoparticelle non aggregate per la stima delle concentrazioni di nanoparticelle. Se c'è aggregazione, la stima della concentrazione di nanoparticelle sarà distorto. Il protocollo è limitata ai giornalisti Raman con punte abbastanza forte da superare lo sfondo polistirolo e sono unici in polistirolo. Infine, l'uso di tradizionali piastre a 96 pozzetti limitare il protocollo da utilizzare di un microscopio invertito Raman a causa dell'altezza delle piastre. Altrimenti, un basso ingrandimento deve essere utilizzato per l'obiettivo microscopio Raman per accomodare l'altezza piastra a 96 pozzetti.
| Sintomo | Causa probabile | Azione correttiva |
| nanoparticelle d'oro aggregano dopo centrifugazione e risospensione. | La concentrazione giornalista Raman è troppo alta. | Prova una serie di concentrazioni giornalista Raman come specificato al punto 2.2 o questo protocollo. |
| L'anticorpo rapporto AUNP è troppo alto. | Ridurre il numero di anticorpi PEG legate alla superficie delle nanoparticelle per aumentare la stabilità delle particelle. | |
| L'agente bloccante MPEG-SH non è vincolante alla superficie AUNP. | Preparare la soluzione MPEG-SH fresco prima di nanoparticelle di blocco. | |
| legandosi alla superficie della piastra immunologico Non specifici | La piastra immunologico non è sufficientemente bloccata. | Preparare il blocco soluzione fresca prima di placcare divertimentoctionalization. |
| Il peso molecolare di mPEG-SH non è sufficientemente grande. | Assicurarsi che la molecola MPEG-SH utilizzato per il blocco ha un peso molecolare di 5.000 kDa o superiore. | |
| Segnale debole o assente Raman | Il reporter Raman non è vincolante per la superficie delle particelle. | Assicurarsi che il giornalista Raman è consentito di collegarsi per almeno 30 minuti prima dell'aggiunta dell'anticorpo PEGylated. |
| Il peso molecolare di mPEG-SH non è sufficientemente grande. | Assicurarsi che il nanoparticelle agente di incappucciamento ha il diritto adeguato per il legame ionico Raman giornalista. |
Tabella 2. risoluzione di problemi comuni. Elenco dei problemi comuni riscontrati durante il protocollo con le cause associate e elementi di azione correttiva.
In questo manoscritto, abbiamo presentato apROTOCOLLO per la fabbricazione su misura di un test immunologico basato nanoparticelle-sonda per l'analisi mediante spettroscopia UV-Vis / Raman. Il protocollo include funzionalizzazione di nanoparticelle d'oro con i giornalisti Raman e le immunoglobuline per la rilevazione diretta degli antigeni legati ad una lastra di polistirene. Il protocollo può essere adattato per soddisfare un particolare giornalista Raman e lunghezza d'onda di eccitazione associata. forma di nanoparticelle d'oro e le dimensioni possono anche essere modificati. Tuttavia, i rapporti soluzione per fasciare varierà secondo il giornalista Raman utilizzati, nonché le dimensioni delle nanoparticelle, forma e produttore appropriato. Il protocollo è stato scritto per cue ricercatori di quando i rapporti di soluzione devono essere determinati per ciascuna disposizione unica e quindi consentire per la fabbricazione su misura in base alle esigenze di ricerca. A differenza dei protocolli immunodosaggio tipici fluorescenti / colorimetrico, questo protocollo ha il potenziale per una maggiore capacità di multiplexing mentre capitalizzando su un'infrastruttura preesistente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 ml | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 | |
| In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
References
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