एचआईवी -1 संक्रमित कोशिकाओं से Exosomes की SILAC आधारित प्रोटिओमिक विशेषता
Summary
यहाँ, हम सेल संस्कृति (SILAC) में अमीनो एसिड से स्थिर आइसोटोप लेबलिंग की तकनीक का उपयोग कर मेजबान exosomal proteomes पर एचआईवी -1 संक्रमण के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल आसानी से अलग तनाव या संक्रमण की शर्तों के तहत कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Introduction
वायरल संक्रमण सहित कई मानव रोगों, अक्सर विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं है कि में और प्रभावित कोशिकाओं के आसपास जगह लेने के साथ जुड़े रहे हैं। प्रोटीन, अक्सर परम सेलुलर प्रभावोत्पादक के रूप में अभिनय, इन प्रक्रियाओं मध्यस्थता। प्रोटीन का विश्लेषण अक्सर प्रभावित कोशिकाओं के स्थानीय पर्यावरण के लिए के रूप में अमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं और रोग रोगजनन की अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए हमें मदद कर सकते हैं। विभिन्न प्रोटीन विश्लेषण तकनीक के अलावा, प्रोटिओमिक्स विशेष रूप से महान वादा है। एक शक्तिशाली, बड़े पैमाने पर उपकरण के रूप में, प्रोटिओमिक्स सेलुलर प्रक्रियाओं की एक प्रणालीगत समझ प्रदान कर सकते हैं, विशेष रूप से समारोह और प्रोटीन की बातचीत के क्षेत्र में। विशिष्ट प्रोटीन का विश्लेषण लेबलिंग तकनीक है, जो जांचकर्ताओं सेलुलर घटकों, विशेष रूप से प्रोटीन की अभिव्यक्ति की निगरानी करने की अनुमति के विकास के माध्यम से सरल बना दिया है, जांच की साइट में। कई प्रोटिओमिक विश्लेषण सेलुलर पर प्रदर्शन किया गया है हालांकिproteome पैमाने पर, subcellular डिब्बों पर प्रोटिओमिक अभिलक्षण विशेष रूप से जानकारीपूर्ण 1 साबित हुई है। यह एचआईवी -1 संक्रमण की पढ़ाई में अच्छी तरह से उदाहरण है।
Exosomes, 30-100 एनएम झिल्ली पुटिकाओं सेल प्रकार 2, 3, की एक विस्तृत श्रृंखला से स्रावित कहनेवाला संचार और आणविक परिवहन के महत्वपूर्ण घटक हैं। वे पहले से एचआईवी -1 नवोदित प्रक्रिया 4, 5 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए खोज रहे थे। कार्यात्मक विच्छेदन के साथ प्रोटिओमिक विश्लेषण के संयोजन से, हमने पाया कि एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं से जारी exosomes एक अद्वितीय और मात्रात्मक अलग प्रोटीन हस्ताक्षर और बंदरगाह नियामक अणुओं है कि पड़ोसी सेलुलर apoptosis और प्रसार 6 सहित ग्रहणशील कोशिकाओं, पर सेलुलर गुण के प्रभाव से बना रहे हैं। तरीकों इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं,अर्थात् SILAC एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं से exosomes के 7 आधारित प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन (सेल संस्कृति में अमीनो एसिड से स्थिर आइसोटोप लेबलिंग)। इसी तरह के दृष्टिकोण बेहतर विशिष्ट डिब्बे या ब्याज के अंश को प्रयोगात्मक तनाव समायोजन और वर्णित प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक परिवर्तन करने से रोगजनन के दौरान अन्य subcellular डिब्बों को समझने के लिए लागू किया जा सकता है।
मात्रात्मक प्रोटिओमिक तरीकों का हाल ही में विकास को देखते हुए जब एक विशेष प्रयोग के लिए सबसे कारगर तरीका चयन से चुनने के लिए कई हैं। इनमें रासायनिक आधारित iTRAQ (सापेक्ष और निरपेक्ष मात्रा का ठहराव के लिए समदाब रेखीय टैग) 8 और लेबल मुक्त एमआरएम (एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी) 9 तकनीक है। दोनों ही तरीकों से शक्तिशाली उपकरण हैं और विशिष्ट सेटिंग्स के लिए अच्छा विकल्प हैं। एक ठेठ प्रयोगशाला मुख्य रूप से सेल लाइनों के साथ काम करने के लिए, हालांकि, इन दोनों तरीकों relativel हैY उच्च लागत और कर रहे हैं और अधिक समय लेने वाली है जब SILAC आधारित पद्धति की तुलना में। SILAC एक चयापचय आधारित लेबलिंग तकनीक है कि सेलुलर प्रोटीन में संस्कृति मीडिया से एमिनो एसिड की nonradioactive समस्थानिक रूपों को शामिल किया गया है। आमतौर पर, SILAC प्रयोगों दो सेल आबादी, उदाहरण के लिए, संक्रमित और असंक्रमित के साथ शुरू करते हैं। प्रत्येक विभिन्न अपनी विशिष्ट समस्थानिक वातावरण में लेबल तक पूर्ण लेबलिंग हासिल की है। इन कोशिकाओं के लेबल exosomes तो प्रोटीन निकासी के अधीन हैं। एक बार निकाले, लेबल exosomal प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर जन स्पेक्ट्रोस्कोपी 10 का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं। अंत में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणाम और काफी लेबल प्रोटीन सांख्यिकीय के अधीन हैं और जैव सूचना विज्ञान कठोर जैव रासायनिक सत्यापन के रूप में रूप में अच्छी तरह विश्लेषण करती है। हमारे पिछले खोजी रिपोर्टों का सुझाव है कि SILAC / exosome प्रक्रियाओं, के रूप में सेल लाइनों एक में आमतौर पर प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में सेल लाइनों के लिए अधिक उपयुक्त हैंकुशल समस्थानिक लेबलिंग के लिए सक्रिय proliferating राज्य,
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रक्रियाओं इस पत्र में वर्णित में, हम मेजबान exosomal proteome पर एचआईवी -1 संक्रमण के प्रभाव की जांच करने के लिए SILAC तकनीक के आवेदन का प्रदर्शन किया। प्रारंभ में, असंक्रमित और एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं विभिन्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए बीआर उम्र / टफ्ट्स / ब्राउन CFAR, P30AI042853-13S1, एनआईएच P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, और K24HD080539 के लिए एक ARRA पूरक द्वारा समर्थित किया गया। यह काम भी उम्र पायलट रिसर्च फंड (# 701- 5857), रोड आइलैंड फाउंडेशन चिकित्सा अनुसंधान अनुदान (# 20133969), और एनआईएच COBRE URI / RIH पायलट अनुसंधान माले के लिए अनुदान (P20GM104317) द्वारा समर्थित किया गया। हम पांडुलिपि और आंकड़ा तैयारी के साथ मदद के लिए जेम्स मेयॉल और Vy डांग धन्यवाद।
Materials
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. . Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. . Current Protocols in Protein Science. , (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
