SILAC основе Протеомный Характеристика экзосомы от ВИЧ-1-инфицированных клеток
Summary
Здесь мы опишем количественный метод протеомики с помощью метода стабильных изотопов маркировки аминокислот в клеточной культуре (SILAC) для анализа последствий инфекции ВИЧ-1 на хосте exosomal протеомов. Этот протокол может быть легко адаптирован к клеткам при различных стрессовых условиях или инфекции.
Abstract
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Introduction
Многие заболевания человека, в том числе вирусных инфекций, часто связаны с характерными клеточными процессами, которые происходят внутри и вокруг пораженных клеток. Белки, часто выступая в качестве конечных клеточных эффекторов, опосредуют эти процессы. Анализ белков часто может дать ценную информацию относительно локального окружения пораженных клеток и помогают нам понять основной механизм патогенеза болезни. Среди различных методов анализа белков, протеомики имеет особенно большие перспективы. В качестве мощного, крупномасштабного инструмента, протеомики может обеспечить системное понимание клеточных процессов, в частности, в области функции и взаимодействия белков. Анализ специфических белков становится проще путем разработки методов маркировки, которые позволяют исследователям контролировать экспрессию клеточных компонентов, в частности белков, в месте расследования. Хотя многие протеомики анализы были выполнены на клеточномпротеом шкала, протеомические характеризации на субклеточных отсеков оказались особенно информативными 1. Примером этого может служить также в исследованиях ВИЧ-1-инфекции.
Экзосомы, 30-100 нм мембранные везикулы , секретируемые широким спектром типов клеток 2, 3, являются важнейшими компонентами межклеточной коммуникации и молекулярного транспорта. Они были ранее обнаружены, играют важную роль в процессе ВИЧ-1 многообещающий 4, 5. Объединив Протеомические анализ с функциональным рассечения, мы обнаружили , что экзосомы , освобожденные из инфицированных ВИЧ-1 клеток состоят из уникальных и количественно различных белков подписи и гавани регуляторных молекул , которые влияют на клеточные свойства на соседних восприимчивых клеток, в том числе клеточного апоптоза и пролиферации 6. Эти методы описаны в данном протоколе,а именно SILAC (стабильный изотоп маркировки аминокислотами в культуре клеток) 7 на основе протеомики характеристик экзосомы от инфицированных ВИЧ-1 клеток. Аналогичные подходы могут быть применены, чтобы лучше понять других субклеточных компартментах в процессе патогенеза, регулируя экспериментальную нагрузку на конкретном отделении или доли интереса и внесение необходимых изменений в описанных процедур.
Принимая во внимание недавнее развитие количественных методов протеомическим, есть много, чтобы выбрать из при выборе наиболее эффективного метода для конкретного эксперимента. Среди них на химической основе iTRAQ (изобарических метки для относительного и абсолютного квантификации) 8 и метка свободной МРМ (множественный мониторинг реакции) 9 методов. Оба метода являются мощными инструментами и являются хорошим выбором для конкретных установок. Для типичной лаборатории в основном работают с клеточными линиями, однако, эти два метода имеют relativelу более высокие затраты и более трудоемким по сравнению с методом, основанным SILAC. SILAC является метаболическим на основе технологии маркировки, которая включает в себя нерадиоактивных изотопные формы аминокислот из культуральной среды в клеточные белки. Как правило, SILAC эксперименты начинаются с двух клеточных популяций, например, для инфицированных и неинфицированных. Каждый из них по-разному маркированы в своей специфической среде изотопного до полной маркировки не будет достигнута. Меченые экзосомы этих клеток затем подвергают экстракции белка. После извлечения меченые exosomal белки анализировали с помощью жидкостной хроматографии тандемной масс – спектроскопии 10. Наконец, результаты масс-спектрометрии и значительно меченые белки подвергаются статистической и биоинформатика анализа, а также строгой биохимического контроля. Наши предыдущие следственные доклады свидетельствуют о том, что процедуры SILAC / экзосома являются более подходящими для клеточных линий, чем первичные клетки, так как клеточные линии, как правило, находятся вАктивное состояние пролиферирующих для эффективной маркировки изотопном,
Protocol
Representative Results
Discussion
В процедурах, описанных в этой статье, мы продемонстрировали применение методики SILAC, чтобы исследовать влияние ВИЧ-1-инфекции на хосте exosomal протеома. Первоначально неинфицированных и инфицированных ВИЧ-1 клетки дифференцированно меченого изотопом. Дифференциально меченые экзосомы з?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана ARRA дополнения к / Продолжительность жизни Тафтса / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 и K24HD080539 БР. Эта работа была также поддержана Фондом Продолжительность жизни пилотного исследования (# 701- 5857), Род-Айленд Фонда медицинских исследований Грант (# 20133969) и NIH Кобре URI / Роге пилотного исследования Grant (P20GM104317) ОД. Мы благодарим Джеймса Myall и Vy Dang за помощь в рукописи и фигурного подготовки.
Materials
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
References
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. . Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. . Current Protocols in Protein Science. , (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
