Abstract
Biyofilmler, modern biyomedikal en zorlu konulardan biri olarak kabul edilir, ve potansiyel antibiyotik dayanıklı enfeksiyonların% 80'i sorumludur. Biyofilm multifaktöryeldir olduğu düşünülen kemoterapi için olağanüstü yüksek tolerans, göstermiştir. Örneğin, matris biyofilm içine antibiyotik penetrasyonu azaltan fiziksel bir engel oluşturur. Ayrıca, biyofilm içindeki hücrelerin fenotipik çeşitlidir. Büyük olasılıkla, biyofilm esnekliği bu ve diğer, henüz bilinmeyen mekanizmalarla bir kombinasyonundan kaynaklanır. Şu anda mevcut antibiyotiklerin tüm tek hücreleri (plankton) bakterilere karşı geliştirilmiştir. Bu nedenle, şimdiye kadar, bir molekül çok sınırlı repertuarı selektif olgun biyofilm üzerinde hareket edebilir bulunmaktadır. Bu durum, anti-biyofilm için arama yaparak daha belirgin bir yer işgal çağrısı edildiği ilaç keşfi bir ilerici paradigma kayması, tahrik vardır. Ek bir zorluk olmasıdırÇok biyofilm araştırma için standart yöntemler, kimyasal kütüphaneler büyük hacimli tarama için kullanılabileceğini özellikle sınırlı sayıda. Burada, kimyasal tarama için deneysel bir anti-biyofilm platformu sunulmuştur. Poli N-asetil-glukozamin, PNAG ait bir buğday tohumu agglutinin kullanarak biyofilm (resazurin boyama ile) canlılığı, (kristal viyole boyama ile) toplam biyokütle ve biyofilm matrisi (ölçmek için üç deneyleri kullanır, WGA-floresan tabanlı boyama , fraksiyon). Tüm deneyler modeli bakteriler gibi Staphylococcus aureus kullanılarak geliştirilmiştir. Platform primer tarama için de tanımlanan anti-biyofilm hit fonksiyonel karakterizasyonu için nasıl kullanılabileceğini örnekleri sunulmaktadır. Bu deneysel sekansı ölçülen son noktaları dayalı isabet sınıflandırılmasını sağlar. Ayrıca, özellikle kısa süreli kemoterapötik etkilerinin karşılaştırılması, uzun vadede, etki biçimleri hakkında bilgi sağlar. Bu nedenle, çok Adva olançeşitli biyomedikal uygulamalar için başlangıç noktası hizmet verebilir yüksek kaliteli isabet bileşiklerinin hızlı belirlenmesi için ntageous.
Introduction
Bakteriler biyofilm en yaygın örneği olan iki çok farklı yaşam tarzları, planktonik ve sapsız, arasında geçiş yapabilirsiniz. Biyofilmlererde, bakteriler kendi ürettiği matrise 1 gömülü yapısal toplulukları oluştururlar. Bu kendi ürettiği matris bakteri ve dış çevre arasında bir bariyer olduğunu ve yakın tutarak, mikrobiyal hücreleri korur. biyofilm matrisin bileşimi ile ve hatta türler içinde değişir, ama daha çok lipopolisakaritler, hücre dışı DNA ve protein sıkı ağından oluşur. Matris zararlı maddelerin girişini engelleyerek fiziksel bir bariyer görevi görür, ama aynı zamanda dehidrasyon biyofilm korur ve hücre 2 kaçan besin önler.
Biyofilmler, modern biyomedikal en zorlu konulardan biri olarak kabul edilir ve bunlar antibiyotik dayanıklı enfeksiyonlarda 3% 80'i için ileri sürülen sorumludur. onlar dispnem, osmotik basınç, mekanik stres 4, ısı, UV radyasyonu 5, dezenfektanlar, antimikrobiyal ajanlar, ve ev sahibi bağışıklık sistemi 1: dış tehditlere karşı doğal olarak yüksek tolerans yatıyordu. Örneğin, bir biyofilm öldürmek için gerekli gerekli antimikrobiyel madde konsantrasyonu, planktonik bakterileri öldürmek için gerekene göre en fazla 1000 kat daha yüksek olduğu gösterilmiştir. bu daha yüksek tolerans açıklaması çok faktörlü olduğu görülmektedir. matris biyofilm içine antibiyotik penetrasyonu azaltan fiziksel bir engel oluşturur. Ayrıca, biyofilm içindeki hücrelerin fenotipik çeşitlidir; onlar yüzünden biyofilm 6 iç ve dış kısımları arasındaki oksijen, besin ve metabolitleri varolan degrade farklı metabolik durumları arasında geçiş. Dolayısıyla, bu tür çekirdek gibi bazı biyofilm bölgelerde, bakteri oksijen ve besin yoksun ve bir metabolik az aktif ya da tamamen atıl devlet içinde yaşamak
Bir methodolog itibarenbiyofilm yöntemler sadece sınırlı sayıda standart koyucu kuruluşlar, kimyasal kütüphanelerin yüksek verimli tarama için geçerli özellikle geliştirilmiştir gibi nik perspektif bir ek zorluklar mevcuttur. (Sadece bir istisna dışında) Bütün standart deneyler biyofilm reaktörleri dayalı ve bu yöntemler genellikle erken evrede araştırma 9-12 sırasında kullanılamaz geniş çalışma hacimleri ve test edilecek bileşiklerin büyük miktarda gerektirir. Yalnızca mevcut standart bir tarama uygulanamaz deney ticari olarak temin edilebilen en az biyofilm ortadan konsantrasyonu (MBEC) Sistem 13-15 geliştirilmiş olan sözde Calgary Biyofilm cihazdır. Ancak, bu testin sınırlama biyofilm mandal yetiştirilen ve tüm bakteri türleri ya da aynı türün içindeki bile suşları değil bu cihazda biyofilm oluşturmak mümkün olmasıdır. Ayrıca, özellikle de doğal bileşiklerin keşfi uygulanabilir yöntemlerdirgerekli. Doğal ürünler Geçen yüzyılda üzerinde 16 antimikrobiyal ilaç keşfi yenilik için önemli bir kaynak olmuştur. Ayrıca persister hücrelere karşı etkili olabilir etki benzersiz mekanizmaları, yeni anti-biyofilm bileşikler sağlayabilir. Böylece, doğal ve doğadan ilham kütüphanelerin keşif umut verici ve benzersiz anti-biyofilm potansiyel üreten yüksek şansı var.
Burada, Staphylococcus aureus biyofilm canlılığı, toplam biyokütle ve matris üzerinde etkilerini ölçmek için üç deneyleri kullanılarak anti-biyofilm bileşiklerin kimyasal taranması için geliştirilen testlerin bir platform deneysel ayrıntıları sunuyoruz. İlk deney biyofilm canlılığını ölçen ve resazurin boyama dayanır. Resazurin onun oksitlenmiş halde mavi ve floresan olmayan ve bakteri metabolik aktivitesi azalır zaman pembe, yüksek floresan resorufine dönüşen bir redoks leke olduğunu. Bu çok basit ve hızlı mBirincil gösterimleri 17-20 için müsait bu yöntemde. İkinci deney, kristal mor boyama dayalı olarak, toplam biyofilm kütlesi ölçer. Kristal viyole biyofilm 19,21-23 bakteri ve bakteri çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir leke olduğunu. Tahlil ucuz reaktif dayalı ve basit bir emme uç okuma vardır. Son olarak, üçüncü deney stafilokok biyofilm 24 matrisi içinde mevcut N-asetil-glukozamin (PNAG) poli- spesifik olarak bağlanan buğday tohumu agglutinin ile biyofilm (WGA), hücre-dışı polimerik madde (EPS) -Matris hedeflemektedir. WGA floresan yoğunluğu okuyucu 25 ile tespit edilebilen bir florofor ile konjuge edilir. Biz burada mantığını ve uygulama örnekleri de dahil olmak üzere, geliştirilen platformun detaylarını sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriler Büyüyen
- Ön-kültür, 220 rpm'de (16-18 saat) çalkalanarak 37 ° C'de bir triptik soya suyu (TSB) içinde, bir gece boyunca bakteri.
- Taze TSB içinde (burada 1000 kat S. aureus için kullanılan bakteri büyüme oranına bağlı olarak) ve (o üstel büyüme ulaşmak için 37 ° C'de ve 200 rpm'de büyümesi optik izin ön kültür 100-1,000 kez seyreltilir 0.2 ve 0.6) arasında 595 nm (OD 595) yoğunluk.
NOT: Bu adım suş spesifik optimizasyon gerektirir.
2. Biyofilm Oluşumu: Öncesi ve Sonrası pozlama
- (Bu mililitre başına yaklaşık 10 6 koloni oluşturan birim (CFU / ml) eşit) katlanarak büyüyen kültürün 100 kez seyreltilir.
- Ön poz protokolü
- muamele edilmemiş kontrol örnekleri için, steril bir 96 mikro tepsinin bölmesi başına seyreltilmiş bakteri kültürü 200 ul ekle.
- Bir test bileşiği veya bir kontrol 4 ul ekleAntibiyotik (50x stok çözelti) ve oyuk başına seyreltilmiş bakteri kültürü 196 ul.
- 18 saat 200 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 37 ° C 'de inkübe edin.
Not: Burada 2 mm yörüngeye bir shaker kullanın.
- Maruziyet sonrası protokol
- Tüm örnekler için, steril bir 96 mikro tepsinin bölmesi başına seyreltilmiş bakteri kültürü 200 ul ekle.
- 18 saat 200 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 37 ° C 'de inkübe edin.
Not: Burada 2 mm yörüngeye bir shaker kullanın. - Bir çok kanallı pipet kullanarak, biyofilm dokunmadan, dikkatle tüm planktonik çözüm çıkarın.
- Bir test bileşiğinin ya da bir kontrol antibiyotik (50x stok çözelti) ve oyuk başına TSB 196 ul 4 ul ekle.
- Ek bir 24 saat boyunca 200 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 37 ° C 'de inkübe edin.
Not: Burada 2 mm yörüngeye bir shaker kullanın.
3. Resazurin Boyama ProtocoBiyofilmler Canlılık Değerlendirmesi l
- steril PBS içinde 0.1 mg / ml resazurin (0.4 mM) bir stok çözeltisi hazırlanır. ışığa maruz kalmaktan korunmuş steril Bu stok tutun ve 4 ° C'de.
- 20 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) içinde resazurin stok 1:50 seyreltin.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak ayrı, temiz 96-plaka için, hava kabarcıkları biyofilm dokunarak veya yaratmadan, dikkatlice (kuyularda biyofilm bırakarak) tüm planktonik çözüm aktarın.
- kuyu başına 200 ul ekleyerek steril PBS ile bir kez biyofilm yıkayın ve dikkatli bir şekilde çok kanallı pipet kullanarak kaldırın.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak biyofilm plakası kaynağı başına seyreltilmiş resazurin 200 ul ekle.
- muamele edilmemiş biyofilm kontrol eşit pembe kadar yaklaşık 20 dakika çalkalanarak, oda sıcaklığında (RT) ve 200 rpm'de, Karanlıkta inkübe edin.
- at floresan ölçmekEXC = 560 nm ve λ em bir plaka okuyucu (üst okuma) ile 590 nm = λ.
4. Kristal Violet Boyama Protokolü Biyofilm Biyokütle Niceleme için Adım 3'te aynı plaka kullanma
- Bir çok kanallı pipet kullanarak kuyulardan dikkatlice resazurin leke çıkarın.
- 15 dakika boyunca metanol içinde 200 ul biyofilm düzeltildi.
- 10 dakika boyunca plaka hava kurumasını bekleyin.
- dikkatli bir şekilde çok kanallı pipet kullanarak, kristal viyole çözeltisi (deiyonize su içinde seyreltildi hacim / hacim),% 0.02 190 ul ekle. pipetle sırasında leke kuyuların yanlarını dokunmaktan kaçının ve darbe-out tamamlamak için pipet basarak değil hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek.
- Oda sıcaklığında 5 dakika için inkübe edilir.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, dikkatle leke çıkarın.
- iyonu giderilmiş su (her seferinde ul 200) ile iki kez yıkanır.
- Kuyular oda sıcaklığında 5 dakika kuruması ve geri kalan leke çözülür% 96 etanol ya da% 33 asetik asit içinde.
- Oda sıcaklığında 1 saat için inkübe ve 595 nm'de absorbans okundu.
5. Biyofilmler için aynı örnek Plate kullanılması Planktonik Bakteriler Üzerine Bakterisid Etkisinin Değerlendirilmesi
- 3.3 ile planktonik çözeltisi ile plakanın 595 nm'de bulanıklık ölçün.
- resazurin stokunun 10 ul ekleyerek başına kuyunun resazurin ile planktonik bakteri Leke. Pipetleme ile iyice karıştırın.
- muamele edilmemiş kontroller eşit pembe kadar yaklaşık 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe.
- Λ exc = 560 nm'de floresan ölçmek ve λ em 590 nm =.
Matris Kantifikasyon ve Biyofilmler Floresan Mikroskopi Görüntüleme 6. buğday tohumu Aglütinin Boyama
- matris ölçümü
- steril PBS WGA prob, 5 ug / ml solüsyonu hazırlayın.
- Paralel örnek pla kullanınBu boyama te. kuyulardan planktonik çözüm çıkarın ve dikkatli bir şekilde biyofilm dokunmadan çok kanallı pipet kullanılarak, steril PBS (oyuk başına 200 ul) ile bir kez yıkanır.
- iyi lekeli edilecek başına WGA solüsyonu 200 ul ekleyin.
- 2 saat süreyle 4 ° C de karanlıkta o inkübe edin.
- PBS, üç kez 200 ul ile kuyu yıkanarak bağlanmamış lekeyi.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca plaka kurumasını bekleyin.
- Yuva başına 200 ul kullanılarak,% 33 asetik asit içinde ilişkili leke çözülür.
- şerit kapakları ile kuyu Seal ve oda sıcaklığında 30 saniye ve 40 kHz için bir su banyosu sonikatör kullanarak ses dalgalarına maruz.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
- sonication adımı yineleyin. kuyular Sonication adımlar arasında kapalı kalabilir.
- Λ ex = 495 nm floresan ölçmek ve λ em bir plaka okuyucu (üst okuma) ile 520 nm =.
- Matrisi ile görselleştirmefloresan mikroskopi
- Adım 6.1.6 kadar yukarıdaki aynı protokolü kullanın.
- Kurutma adımından sonra, bir FITC filtresi (ya da bir başka uygun yeşil uyarım filtre) kullanılarak bir floresans mikroskobu ile örnekleri görselleştirmek.
Floresan Mikroskopi ve Yeşil-to-kırmızı-oranı için Sinyal Niceleme (G / R) ile Görüntüleme Biyofilmler içinde 7. Boyama Canlı ve Ölü Hücreler
- Floresan mikroskobu ile görüntüleme
- üreticinin talimatlarına uygun olarak, her bir prob (bir boyama canlı hücreler ve bir kullanıcı boyama ölü hücreleri) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
- kuyulardan planktonik çözüm kaldırmak ve çok kanallı pipet kullanarak (oyuk başına 200 ul) steril PBS ile bir kez yıkanır.
- Oyuk başına boyama solüsyonu 6 ul ekleyin.
- 15 dakika karanlıkta plaka inkübe edin.
- mikroskopi önce fazla sıvı m kaldırmakanually bir çok kanallı pipet kullanarak.
- Örneğin bir FITC filtresi (yeşil floresan için, canlı hücreler) ya da bir TRITC filtresi (kırmızı floresan, ölü hücreler) kullanarak, bir floresan mikroskop kullanılarak görüntüler çekin.
- Yeşil-to-kırmızı flüoresans oranı olarak sinyal miktarının (G / R)
- adımlar 7.1.1 ve 7.1.2 ile aynı protokolü uygulayın.
- Oyuk başına boyama çözeltisi 200 ul ilave edin ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe.
- uyarma / emisyon dalga boyları yeşil ve kırmızı floresan 485/535 nm ve 485/635 sırasıyla (üst okuma) bir plaka okuyucu ile floresan ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önerilen platformda, canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi üzerinde etkileri ölçülür. Çalışma dizisi (Şekil 1), bir örnek plakası aynı anda bakteriyel biyofilm canlılığı ve toplam biyofilm biyokütle üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kristal viyole ile resazurin ile ve daha sonra lekeli. Bu resazurin bir birinci boyama kristal mor plakalar arasında maksimum sinyal emme birimleri karşılaştırmak için kristal viyolet sonucu (p = 0,4149 üzerinde istatistiksel olarak önemli bir etki ayrıca, lekeli ya da daha önce olduğu gösterilmiştir, çünkü her iki deney aynı plaka ardışık olarak gerçekleştirilebilir resazurin-boyama, n = 20) 26 sonrası. planktonik bakteri üzerindeki etkisi aynı anda değerlendirilebilir.
hit canlılığı ya da biyokütle bazlı tahlil birinden tespit edildiğinde, ikinci tabak st WGA probu ile ained biyofilm matrisinin polisakarit bileşeninin (PNAG) üzerindeki etkilerini ölçmek için. aşağıda açıklanacağı gibi bu iş akışı, hem de vuruş bileşiklerinin gücü ölçümleri için fonksiyonel takip çalışmalara, kimyasal kütüphanelerin taranması uygulanabilir.
Şekil 1: Üç deney platformu iş akışı. biyofilm örnekleri üzerinde üç tahlilleri birleştirerek iş akışı şematik gösterimi. Platform canlılığı, biyokütle ve EPS katmanda bir etki için boyama içerir; floresan mikroskobu kullanarak görüntüleme; ve planktonik faza üzerindeki etkisini değerlendirmek. "A" ve "NA" ", Etkin Değil" "Aktif" ve sırasıyla ayakta. Skogman ark modifiye. 26jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tarama Amaçlı Üç tahlil Platformu Performans
Burada, iki tarama çalışır platformun performansı Örnek sonuç olarak gösterilmiştir. Ilk kampanya (Şekil 2A) olarak, kınakına alkaloit türevlerinin küçük bir kütüphane S. aureus karşı anti-biyofilm aktivite için tarandı, 27 biyofilmlerde ise ikinci örnekte (Şekil 2B), abietane tipi doğal ve doğadan ilham kütüphanesi diterpenleri ve türevleri 28,29 araştırılmıştır. Aktif isabetler hesaplanan isabet sınırları (Denklem 6, Tablo 1 eşikleri) kullanılarak belirlenmiştir. Her tarama çalışmasında, çok iyi bir korelasyon ilk iki tahlillerin sonuçları; hit her w canlılığı ve biyofilm biyokütle azaltmak için başardıkHile etkin olmayan bileşikler ya tahlilinde üzerinde bir etki göstermemiştir. Bütün tespit isabetler, sonra üçüncü (WGA) deneyi ile test edilmiş, ancak bunlar (sonuçlar gösterilmemiştir), matris-sökülmesi (ya da matris-bozucu) etkileri vardı.
Şekil 2: S. aureus biyofilm ile platformu kullanarak tarama kampanyalarının Temsilcisi sonuçları. proof-of-concept doğrulama ekranlar iki örnek tahlil platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar işlenmemiş biyofilm kontrol yüzdesi olarak sunulmuştur isabet bileşikler kırmızı ile gösterilmiştir ve çizgiler hesaplanan isabet sınırlarını temsil etmektedir. (A), çinkona alkaloid-türevi kütüphanenin taranması işlemi, bir aktif bileşik tespit etti. (B) beş hareket tespit abietane tipi diterpenleri ve türevlerinin bir kütüphanenin taranmasıive bileşikler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Takip Çalışmaları Üç tahlil Platformu Performans
Örnek sonuçlar iki bilinen antibiyotikler, S. aureus biyofilmlere karşı konsantrasyonlarda çok geniş bir aralık (0.5 nM-5 mM) test edildi, Şekil 3'te görülebilir. planktonik bakterilere karşı referans bileşikler (ya literatürde veya laboratuarda gerçekleştirilen) minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) değerleri aynı türün biyofilm karşı test etmek için konsantrasyonlarını seçtiğiniz için kılavuz olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, sitotoksisite, memeli hücrelerinde tespit edildiği konsantrasyon değerlerinin bilgisi aynı zamanda anti-biyofilm takip için test etmek için konsantrasyon seçiminde yardımcı olur. İdeal olarak,Belirli bir bileşik için iki antimikrobik ve sitotoksisite verileri mevcut olup olmadığını Müller ve Kramer 30 ile tanımlanan, "Biyouyumluluk İndeksi" (BI) adı verilen bir parametre hesaplanabilir. Burada, penisilin G ve siprofloksasin için planktonik S. aureus karşı MİK değerleri sırasıyla 0.04 uM ve 6 uM, olduğu belirlendi (sonuçlar gösterilmemiştir). Böylece, konsantrasyon aralığı yaklaşık 10 5 x MIC 10 -2 x MIC ve sırasıyla penisilin ve siprofloksasin, 10 3 x MİK -4 10 x MİK arasında değişmekteydi. Onlar biyofilm oluşum süreci (Şekil 3a) başlamadan önce tek hücreli bakteriler maruz kaldılar her iki antibiyotikler önemli ölçüde canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi PNAG içeriği azaltabilir. Bununla birlikte, önceden oluşturulmuş (18 saat), biyofilm test antibiyotiklerin yüksek konsantrasyonuna rağmen, canlılık ve biyokütle, sadece T yaklaşık% 50 azaldıTedavi edilmeyen biyofilm (Şekil 3b) hortum. En önemli sonuç, burada önceden biyofilm önceden biyofilm siprofloksasin ile tedavi edildiğinde biyofilm matrisi içeriğinde hiçbir değişiklik tespit edildi penisilin G. yüksek konsantrasyonlarda ile tedavi edildi (200 üzerinden%) biyofilm matrisi artış oldu.
Şekil 3: S. aureus biyofilm karşı iki modeli antibiyotik kullanılarak anti-biyofilm etkileri izlem çalışmasında örneği. Penisilin G ve siprofloksasin etkileri burada sunulmuştur: (A) oluşumunu (ön maruz kalma) ve (B) post-biyofilm oluşumu (maruziyet sonrası) biyofilm önce. Şekil Anlaşılır olması için, sadece düşük ve test edilen en yüksek konsantrasyonlar gösterilmektedir. standart sapmalar% 20 aşmamaktadır. *** equals p <0.01. Skogman ark modifiye. 26 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Flüoresan Mikroskopi tabanlı Görüntüleme
(Şekil 3b'de gösterildiği gibi, hem de daha yüksek konsantrasyonları) sonuç, penisilin, 400 uM G önceden S. aureus biyofilm bakteri nüfusunun yaklaşık% 50 bir geçerlilik boyaması deneyi ile teyit edildi öldürür. Tedavi edilmeyen biyofilm kuyuları için yeşil-to-kırmızı (G / R) floresan oranları ortalama ölü (kırmızı lekeli) hücreleri üzerinde canlı (yeşil boyanmış) hücre üstünlüğünü belirten, 2.75 idi. Bununla birlikte, penisilin-muamele edilmiş hücrelerde K / R oranı kontrol kuyuları% 56 tekabül eden, 1.54 düşmüştür. penisilin tedavisi pro sonra hayatta kalan hücrelermuamele edilmemiş biyofilm ile karşılaştırıldığında yeşil (WGA) floresan tespit artış (Şekil 4b) değerlendirildiği gibi, EPS'nin önemli ölçüde daha yüksek miktarda sokulmaktadır. Biz daha özellikle hit adayların karakterizasyonu aşamasında, platformun sonuçları doğrulamak için bu görüntüleme bazlı deneyler gerçekleştirmek için mümkünse, tavsiye ederim.
Şekil 4: Floresan mikroskopi. canlılık ve EPS üretim penisilin ek (400 uM) etkisi burada gösterilmektedir. Üst görüntüleri (A) canlı hücreler lekeli yeşil ve ölü hücreler kırmızı lekeli olan işlenmemiş biyofilm ve penisilin ile tedavi edilen biyofilm karşılık gelir. takılı grafik G / R floresan oranları hesaplamalarını göstermektedir. Alt görüntüler (B) işlenmemiş biyofilm ve penisilin uygunWGA probu ile boyanmış ile tedavi edilen hücreler. eklenen grafik işlenmiş ve işlenmemiş biyofilm örnekleri için WGA sinyallerin ölçümü sunar ve hata çubukları standart sapmaları temsil etmektedir. Skogman ark modifiye. 26 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Veri İşleme ve İstatistiksel Analiz
İstatistiksel parametreler deneylerinde kalitesini karakterize etmek ve tarama çalışmaları sırasında performanslarını takip hesaplanır. Kullanılan en önemli parametreler, hem de elde edilen ve hedef değerlerinin eşitlikleri, Tablo 1 'de listelenmiştir. Tüm denklemler, SD min μ dakika, SD max ve maksimum minimum standart sapmalarını ve araçları temsil u içindesırasıyla (dk) ve maksimal (max) sinyalleri. Burada gösterilen sonuçları, özgün değerleri karşılaştırmaları p <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi Welch düzeltme, bir eşleştirilmemiş t-testi ile yapıldı eşleştirilmiş.
Tablo 1: tahlillerin performansını değerlendirmek için kullanılan istatistiksel parametreler. Tüm denklemler, SD min μ dakika, SD max ve u max sırasıyla, standart sapma ve araçları en az (min) ve maksimal (max) sinyalleri temsil etmektedir. boyama yöntemleri, resazurin, kristal viyole ve buğday tohumu agglutininli, kısaltılmıştır RES, CRV, ve WGA, sırasıyla. RFU: bağıl floresan birimleri; RAU: göreceli emme üniteleri. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aynı anda canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi üzerinde bir bileşiğin etkisini ölçmek tek yöntem yoktur. Bu nedenle, tercih edilen birincil tarama aşamasında, üç uç noktası üzerinde bir etki tespit etmek için deneyler ile birleştirmek için bir ihtiyaç vardır.
Resazurin, yalnızca redoks probun ilavesinden oluşan çok basit boyama protokolüdür. Ancak, resazurin ile biyofilm optimal inkübasyon süresi kuran bu testin başarısı için çok önemlidir. Bazılarında ise birkaç saat 19 sürebilir iken bazı bakteri türleri de, pembe, floresan resorufine resazurin prob azaltılması, çok hızlı bir şekilde gerçekleşir. Dahası, aynı bakteri suşu içinde, aynı zamanda planktonik bakteri ve biyofilm arasında önemli farklılıklar olabilir. planktonik bakteri genellikle daha kolay bakteriyel yoğunluk biyofilm po daha planktonik popülasyonlar düşük başlıca nedeni, ulaşıldığındaReaksiyonun daha hızlı devir teşvik pulations. Biyofilm canlılığı boyama prob yayımlanmış bir karşılaştırıldığında, resazurin en doğru kullanımı basit ve en ucuz deneyleri 19 biri olarak sonucuna varılmıştır. Ayrıca, bakteriyel ve fungal organizmalar 19 bir dizi uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. Öte yandan, kristal viyole deney en yaygın biyofilm kütlesi ölçümü 19,32,33 için kullanılmaktadır. Bu protokolün en kritik adımlar kristal viyole leke çözeltisinin eklenmesi ve çıkarılması vardır. Bu adımlar (nedeniyle kuyu duvarlarında leke damla, gibi) spesifik olmayan boyama önlemek için çok dikkatli bir şekilde yapılmış olması gerekir. İlk boyama deneyi olarak resazurin kullanmanın temel yararlarından biri, kristal viyole boyama için aynı plaka kullanımını sağlar hücreleri için toksik olmayan olmasıdır. Her iki tahlillerin kombinasyonu önemli ölçüde iş akışını kolaylaştırır maliyetleri düşürür, tüketen kaydederkinesi ve bir tarama ortamında özellikle değerlidir Test bileşiklerinin kullanımını en aza indirir.
Daha önce belirtildiği gibi, kendi ürettiği ekstraselüler polisakkarit matriks biyofilm önemli bir bileşenidir. matris içeriği (özellikle temel polisakkaritler) ölçmek için, üçüncü bir tahlil floresan etiketli WGA dayalı, buraya dahil edilmiştir. Başlangıçta WGA miktar, bir enzim-bağlantılı lektin sorbent deneyi (ELLA) 24 olarak tanımlanmıştır. Dimetilmetilen mavisi (DMMB) S. aureus biyofilm matris boyama glikozaminoglikanlar (GAG) dayanan benzer bir deney, 31,34 kullanılmıştır. GAG'lar Staphylococcus spp matris içinde bulundu polisakkarit arası adezinler (PIA) ile benzerdir. 35 biyofilmlerde. WGA-tahlil özellikle benzer hedefler PIA, ama WGA biyofilm matrisinde 36 <önemli bir rol oynamaktadır N-asetil-glukozamin artıkları, poli bağlanır/ Sup>. matris Hedefleme nedeniyle matris kimyasal ya da antibiyotik tedavisi sonrasında bırakılırsa biyofilm kolayca yeniden saç gerçeği yüksek önem taşımaktadır. Bakteriler de daha kolay bir matriks 35 önceden kaplanmış bir yüzeye eklenebilir. Bazı antibiyotikler etkili bir canlılık ve biyofilm biyokütle düşük olduğunu göstermiştir, fakat matris üzerinde herhangi bir etkisi olmaksızın edilmiştir. Deneylerde, bu siprofloksasin 31 durumunda ile örneklendirilir. Penisilin G 26 ile burada gösterildiği gibi bazı antibiyotikler bile, matris üretimini artırabilir. Bu değişiklikler göre, antibiyotikler, Tablo 2'de listelenen kategorilerde sınıflandırılabilir. Bizim tarama çalışmalarında (Şekil 2) tüm hit biyofilm bakterileri öldürür ve biyokütle azaltmak ancak sökmeye ya da biyofilm matrisi bozmak yok bileşikler olarak, birlikte siprofloksasin ile sınıflandırılabilir.
| Kategori | Bakteriler üzerinde etkisi | Matris üzerindeki etkisi | Örnek antibiyotik (hedef biyofilm) | Referans |
| 1 | Yok | Yok | ampisilin (SA) | (Tote ve ark. 2009) |
| 2 | Yok | - | Cefalotin (SA) | (Tote ve ark. 2009) |
| 3 | - | Yok | polymyxin (SA) | (Tote ve ark. 2009) |
| 4 | - | - | kanamisin (PA) | (Tote ve ark. 2009) |
| siprofloksasin (SA) | (Skogman ve ark., 2012) | |||
| 5 | (+) - | - | doksisiklin (PA) | (Tote ve ark. 2009) |
| 6 | - | + | penisilin G (SA, AT) | (Skogman ve ark., 2012) |
Tablo 2: Antibiyotiklerin sınıflandırılması. antibiyotikler ve (WGA veya dimetilmetilen mavi (DMMB) boyama kullanarak) matrisi (boyama resazurin kullanarak) biyofilm bakterilerin canlılığı üzerindeki etkileri dayalı kategoriye ayrılır. SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; EC: Escherichia coli. Tote ve ark modifiye. 31
Bundan başka, bu platform primer tarama kampanyaları gerçekleştirmek için idealdir. En maliyet ve zaman etkin bir strateji birinci kademe stratejisi olarak resazurin ve kristal viyole tabanlı deneyleri uygulamak ve ikinci kademe (takip) çalışmalarında WGA-matris tahlil için hareket etmektir. Bu WGA prob oldukça pahalı olmasından kaynaklanmaktadır ve bu deney daha zahmetli ve zaman alıcı hale getiren, çeşitli adımlardan oluşur.
Bu platformun bir ilgili bir özellik tespit antimikrobiyal uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için olasılığıdır. biyofilm matrisi demonte halinde uzun vadeli kemoterapötik etkileri sadece elde edilebilir. Matris geride ise biyofilm enfeksiyon resüsitasyon riski çok daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Bu platform sayesinde, genel biyofilm biyokütle kristal viyole boyama kullanılarak etkilenen ise ilk değerlendirmek mümkündür. Daha DWGA analizi kullanılarak biyofilm matrisi polisakkaritlerin etailed değerlendirilmesi, takip edebilirsiniz. Not, matris sökmeye ve etkileri düşük olarak kabul edilebilir antibakteriyel (biyosidal) uygulamayın hem tek bir molekül belirleme olasılığı. Nitekim, bugüne kadar, biz belirledik bu tip tek bileşikler antimikrobiyal peptidler 37 vardır. Bu strateji, ayrı biyosit veya matris-bozucu aktiviteye sahip bileşiklerin teşhisine izin verir çünkü bu adrese, takipleri, resazurin- veya kristal viyole-aktif hit biriyle bu platformda gerçekleştirilmektedir. Bu tip ara kablolar, çok-bileşenli stratejileri için potansiyel olarak ilginç olabilir. Biyosidal veya antibiyotik tipi bileşikleriyle matriks-yıkıcı moleküllerinin bir kombinasyonu daha etkin biyofilm eradikasyonu sağlaması beklenmektedir.
Özetle, burada sunulan bir platform matris quantifi ile birlikte canlılık ve biyokütle ölçümleri kullanılarak, anti-biyofilm tarama için iyi bir temel sağlarkatyon ve görselleştirme. Hem resazurin tutulabilir ve kristal mor boyama deneyleri de biofilm- oluşturan diğer mikroorganizma türlerini temizlemek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bu deneyler, hem büyüyen hem de boyama koşulları için ayrı bir optimizasyon gerektirir. WGA boyama tahlilinde uygulanabilirliği poli N-asetil-glukozamin, biyofilm matrisin ana bileşeni olan bu bakteri ile sınırlıdır. (Örneğin dimetil-metilen mavisi boyama göre bir) diğer matris miktar deneyleri Diğer durumlarda uygulanabilir. Tamamen, bu platformda deneyleri gerçekleştirmek oldukça kolay ve tüm reaktifler kolayca kullanılabilir ve genel olarak uygun bulunmaktadır. Bu platform, pahalı ekipman yatırımlarının gerek kalmadan orta verimli bir anti-biyofilm tarama düşük için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar kendi laboratuvarında filme sürecinde verdiği destekten ötürü profesörü Paul Kos ve LMPH, Antwerp Üniversitesi, Belçika teşekkür ederim. Bu çalışma Finlandiya projeleri Akademisi (272266 ve 282981 projeleri) ve Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandiya tarafından finanse edildi. Yüksek Lisans Janni Kujala teknik katkıları kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al.
- Lewis, K.
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
