Højt gennemløb, realtid, Dual-udlæsning Test af Intracellulær antimikrobielle aktivitet og eukaryote celle cytotoksicitet

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

Traditionelle foranstaltninger af intracellulær antimikrobiel aktivitet og eukaryote celle cytotoksicitet stole på endpoint analyser. Sådanne endpoint assays kræver adskillige yderligere eksperimentelle trin før udlæsning, såsom cellelysis, kolonidannende enhed bestemmelse, eller tilføjelse reagens. Når der udføres tusindvis af assays, for eksempel under high-throughput screening, downstream indsats, der kræves for disse typer assays er betydelig. Derfor, for at lette high-throughput antimikrobielle opdagelse har vi udviklet et real-time assay til samtidig identificere inhibitorer af intracellulær bakterievækst og vurdere eukaryot celle cytotoksicitet. Specifikt blev påvisning i realtid intracellulær bakterievækst aktiveret ved at mærke bakterielle screening stammer med enten en bakteriel lux operon (1 ^st generation assay) eller fluorescerende protein reportere (2 ^nd generation, ortogonal assay). En ikke-toksisk, cellemembran-impermeabel, nukleinsyrebindende farvestofblev også tilsat under den første infektion af makrofager. Disse farvestoffer er udelukket fra levedygtige celler. Men ikke-levedygtige værtsceller mister membranintegritet tillader ind- og fluorescerende mærkning af kerne-DNA (deoxyribonucleinsyre). Især DNA binding er forbundet med en stor stigning i fluorescerende kvantumudbytte, der giver en løsning baseret udlæsning af værtens celledød. Vi har anvendt denne kombinerede assay til at udføre en høj-throughput skærm i mikroplade-format, og for at vurdere intracellulære vækst og cytotoksicitet ved mikroskopi. Især kan antimikrobielle stoffer demonstrere synergi, hvor den kombinerede virkning af to eller flere antimikrobielle midler, når de anvendes sammen, er større end når den anvendes særskilt. Test for in vitro-synergi mod intracellulære patogener er normalt en uhyre opgave som kombinatoriske permutationer af antibiotika ved forskellige koncentrationer skal vurderes. Vi fandt imidlertid, at vores real-time analyse kombineret med automatiseret, digital dispensering teknologi permitted Facile synergi testning. Ved hjælp af disse fremgangsmåder, kunne vi systematisk overskue virkning af et stort antal antimikrobielle stoffer alene og i kombination imod det intracellulære patogen, Legionella pneumophila.

Introduction

Patogener, der vokser eller tager ophold midlertidigt i intracellulære rum er vanskelige at terapeutisk udrydde. Obligat eller relativt obligate intracellulære patogener som Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, og Mycobacterium spp. ofte kræver langvarig kurser af antimikrobiel terapi for kur, der kan variere fra måned til endda år. Endvidere kan ekstracellulære patogener forbigående besætte intracellulære nicher og på den måde slippe efter normale forløb af antimikrobiel behandling og senere dukke at starte nye runder af ondartet infektion. Staphylococcus aureus ¹ og uropatogene Enterobacteriaceae ^2,3 infektioner er to mere anerkendt eksempler. Derfor er en grundlæggende opdagelse af lægemidler mål er at identificere hidtil ukendte antimikrobielle midler, som trænger ind i intracellulære rum. Optimal behandling til hurtigt udryddeintracellulære organismer og forebygge udviklingen af ​​resistens gennem sub-hæmmende antimikrobielle eksponering er særligt ønskelig.

Til dette formål har vi udviklet en high-throughput screening teknologi til at identificere intracellulære-penetrant antimikrobielle målrettet mod intracellulær vækst af modellen patogen, Legionella pneumophila. ⁴ Tidligere kliniske observationer tyder på, at standard antimikrobiel resistensbestemmelse ikke præcist forudsige in vivo terapeutisk virkning mod denne organisme. ⁵ Konkret var det, fordi de store klasser af antimikrobielle stoffer såsom p-lactamer og aminoglykosider, selvom meget effektiv mod axenisk vokset Legionella, ikke i tilstrækkelig grad trænge ind i intracellulære rum, hvor Legionella bosat. ^5,6 Senere beviser, at der teknisk mere komplekse intracellulære vækstassays effektivt forudsagt klinisk virkning. ⁷ </sup> Desværre er disse assays var yderst arbejdskrævende endpoints assays, der kræver inficerede makrofager, der er behandlet med antimikrobielle midler, til at blive lyseret på forskellige tidspunkter point for kolonidannende enhed tælling. Sådanne assays er upraktisk at gøre i stor skala og er uegnede til high-throughput drug discovery.

Derfor har vi udviklet teknologi til tidstro bestemmelse af intracellulær bakteriel vækst. ⁶ Dette blev opnået ved anvendelse af en bakteriestamme modificeret ved integrering af enten en bakteriel luciferase operon ⁸ (første generation assay tidligere beskrevet) ⁴ eller fluorescerende protein ⁹ reportere (anden generation, ortogonal assay, der er beskrevet her) i det bakterielle kromosom. På denne måde, luminescerende eller fluorescerende signal giver et surrogat, real-time udlæsning af bakteriel nummer.

Men disse attributter ikke løse en større confounder i intracellulær infection assays, off-target effekter på værtsceller. Især død værtscellen ifølge sagens natur begrænser intracellulær vækst og fører til falsk positiv identifikation af antimikrobiel virkning. Som mange forbindelser i screeningsprogrammer biblioteker er eukaryote celle giftige, sådanne falske positiver ville overvælde sande antimikrobielle stoffer, hvilket nødvendiggør et stort antal opfølgning, endpoint cytotoksicitetsassays til opløsning.

Det var således af stor interesse for at kunne vurdere eukaryote celle levedygtighed og intracellulær vækst på samme tid. Især en egenskab af ikke-levedygtige eukaryote celler er tabet af cellemembranens integritet. Prober, der tester permeabiliteten af ​​cellemembranen kan derfor anvendes til at vurdere cellernes levedygtighed. Vi har tidligere karakteriseret evnen hos en række putativt cellemembran-impermeabel, fluorescerende, DNA-bindende farvestoffer til at få adgang til og plette nukleare DNA af døde celler. ⁴ Ved bindende nukleare DNA, disse farvestoffer vise en stor stigning i quantum fluorescerende udbytte resulterer i øget signal over baggrund løsning fluorescens. Som sådan er disse farvestoffer tilvejebragt en kvantitativ udlæsning af eukaryot celledød. ⁴ Især fandt vi, at flere var ikke-toksiske selv ved langvarig co-inkubering med J774 makrofager. Når det tilsættes under den indledende infektion, forudsat de en real-time, fluorescerende udlæsning af eukaryot celledød, der kan måles ved en mikroplade fluorimeter eller observeres mikroskopisk.

Derfor, ved at kombinere anvendelsen af ​​en bakteriel reporter og ikke-toksiske, membran-impermeabel, DNA-bindende farvestoffer, var vi i stand til at udvikle en enkel, ikke-destruktiv, real-time assay til at måle både bakteriel belastning og eukaryot celle cytotoksicitet samtidigt. Dette assay har tilladt os at screene i 384-brønds pladeformat ~ 10.000 kendte bioactives herunder ~ 250 antimikrobielle stoffer og> 240.000 små molekyler med funktionelt karakteriseret aktivitet for evnen til at inhibere intracellulær vækst afLegionella pneumophila, mens på samme tid at generere eukaryote celle cytotoksicitetsdata for hver forbindelse. ⁶ Vores analyse af kendte antimikrobielle stoffer mod intracellulær vækst af Legionella var den mest omfattende udforskning af denne type til dato. ⁶

Baseret på effektiviteten af ​​vores assayformat vi også efterfølgende undersøgt de potentielt synergistiske virkninger af kendte antibiotika, når de anvendes i kombination. En af de mest almindelige synergieffekter test, den såkaldte skakbræt assay standardmæssigt udføres ved at vurdere kombinatoriske virkninger af to-fold seriefortyndinger af to eller flere antimikrobielle midler. ¹⁰ I disse assays er synergi defineret ved observation af større virkning, når to eller flere antimikrobielle midler anvendes sammen end summen af virkningerne af hver anvendt særskilt. Af note, hidtil kun fokuseret og selektiv synergi test blev udført mod intracellulær Legionella pneumophila </em> grund af den store indsats, der er involveret i de traditionelle endpoint assays multipliceret med de kombinatoriske permutationer påkrævet.

For at lette synergi test, gjorde vi brug af vores real-time intracellulær vækst / eukaryote cytotoksicitet assay i kombination med automatiseret digital dispensering teknologi ^6. Denne automatisering tilladt os at dispensere serielle fortyndinger af forbindelser opløst i DMSO eller vandig opløsning alene eller i kombination i 384-brønds format. ¹¹ Desuden vil en sådan robust håndtering teknologi flydende tilladt os at nemt udføre højere opløsning, kvadratroden-of-to (snarere end standard, lavere opløsning, en fordobling) udvanding kombinationer for at opnå højere niveauer af specificitet i vores to-dimensionelle, skakternet synergi analyse. Denne resolution var især værdifulde i håndteringen bekymring i synergi feltet om reproducerbarhed ved brug af dobbelt fortyndingsserie ^12. Endelig vores assay var kvantitativt og også thernden målte gradueringer af hæmning. Som følge heraf assayet fanget samtlige inhiberende information, der kan udtrykkes i isocontour isobologrammer hvori isocontours forbinde kombinatoriske koncentrationer med tilsvarende niveauer af vækstinhibering. ⁶ Denne plotning strategi tillod visualisering af kombinatoriske dosisresponskurver. For at illustrere vores metode, vi beskrive vores protokol for at udføre disse analyser og viser repræsentative resultater.

Protocol

1. Real Time Intracellulær Vækst og eukaryote cellecytotoksicitetsassay Forberedelse værtsceller (J774A.1 celler) Kultur J774A.1 Mus musculus makrofag-lignende celler i suspension i RPMI 1640 med 9% jern-suppleret kalveserum. Oprindeligt passage i vævskulturkolber. Efter cellerne er blevet sammenflydende i en 75 cm2 vævskulturkolbe i 15 ml medium, opdeles ved skrabning og fortynding til 65 ml med den samme type medium, hvoraf 15 ml returneres til vævsdyrkningskolben og 50 ml…

Representative Results

Mikroplade intracellulær vækst assay Figur 1 viser som diagram analysetrin. kan udføres den automatiserede viste trin manuelt. Dog er throughput lettet betydeligt under anvendelse af flydende håndteringssystemer. Figur 2 viser repræsentative resultater fra en 384-brønds mikroplade, dual-udlæsning, real-time intracellulær væ…

Discussion

Vi beskriver realtid assays til samtidig detektering af intracellulær bakteriel vækst og værtscelle cytotoksicitet. Der er flere kritiske trin i protokollen. Først, for robust assay ydeevne, der skal være tilstrækkelig spektral adskillelse mellem bakterielle og cytotoksicitet udlæsninger. En sådan adskillelse er iboende for kombinationer af luciferase operon journalister og fluorescerende DNA-bindende farvestoffer. Men baseret på vores erfaringer (tabel 1-3, figur 2), brug af d…

Materials

J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water	Biotium	41003	For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader	Perkin-Elmer	(Contact manufacturer)	For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.