Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

المعالجة سيفوبيرازون ماوس نموذج سريريا ذات صلة Published: December 10, 2016 doi: 10.3791/54850
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

Summary

ويحدد هذا البروتوكول نموذج الفأر سيفوبيرازون من كلوستريديوم العدوى العسيرة (CDI) باستخدام سلالة سريريا ذات الصلة وراثيا لين العريكة، R20291. وفيما يلي تفصيل التركيز على رصد السريري المرض، C. التعداد البكتيري العسيرة السمية الخلوية السم، والتغيرات التشريحية المرضية في جميع أنحاء CDI في نموذج الفأر في البروتوكول.

Introduction

المطثية العسيرة هو اللاهوائية، إيجابية الجرام، تشكيل بوغ عصية أن يسبب تهدد الحياة الإسهال 1. ويرتبط C. عدوى العسيرة (CDI) مع زيادة معدلات الاعتلال والوفيات البشرية والنتائج في أكثر من 4.8 مليار $ في تكاليف الرعاية الصحية سنويا 1-4. في عام 2013، ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها تصنف C. صعب بمثابة خطر المقاومة للمضادات الحيوية عاجل، مشيرا إلى أنه يشكل تهديدا عاجلا للصحة العامة 1. حاليا، تعتبر العلاج بالمضادات الحيوية مع فانكومايسين وميترونيدازول مستوى الرعاية لCDI 5. للأسف، تكرار CDI بعد نجاح العلاج بالمضادات الحيوية عالية، وتحدث في 20-30٪ من المرضى 2،5-7. ولذلك، فإن اكتشاف علاجات جديدة ضد هذا الممرض المعوي هو ضروري. لتقييم العلاجات ضد C. صعب، نموذج حيواني تقارب الأمراض التي تصيب البشر في ميلانوهناك حاجة سلالة linically ذات الصلة.

في البداية، تم إنشاء فرضيات كوخ لC. صعب في عام 1977 باستخدام نموذج الهامستر السوري المعالجة الكليندامايسين 8. لا تزال تستخدم هذا النموذج اليوم للتحقيق في آثار جيم السموم صعب على التسبب 9،10. ومع ذلك، CDI في النموذج الهامستر يؤدي إلى ارتفاع معدلات الوفيات ولا تقريب مظاهر المرض الخبيث المزمنة التي يمكن رؤيتها في البشر مع CDI 10،11. واستنادا إلى سهولة الوصول وكاشف توفر منصات الفئران في البحث، وهذا نموذج الفأر من CDI هو ذات الصلة.

في عام 2008، تم إنشاء نموذج الفأر قوية من CDI عن طريق علاج الفئران بخليط من المضادات الحيوية في مياه الشرب (كانامايسين، جنتاميسين، كوليستين، ميترونيدازول، وفانكومايسين) لمدة 3 أيام تليها حقن داخل الصفاق من الكليندامايسين 12. هذه الفئران المقدمة عرضة لالتهاب القولون CDI وشديد. تعتمدجي على جرعة اللقاح تديرها مجموعة من العلامات السريرية والفتك ويمكن ملاحظة باستخدام هذا النموذج. منذ هذا الوقت، وقد تم التحقيق في مختلف الصادات التي تغير الجراثيم الأمعاء الفئران، وخفض مقاومة الاستعمار إلى النقطة التي يمكن C. صعب استعمار الجهاز الهضمي (إعادة النظر في أفضل وآخرون. وLawley ويونغ) 13،14.

وفي الآونة الأخيرة، والسيفالوسبورين واسعة، سيفوبيرازون، التي وردت في مياه الشرب لمدة 5 أو 10 يوما يجعل بتكاثر الفئران عرضة للCDI 15. منذ ترتبط إدارة السيفالوسبورين الجيل الثالث مع زيادة خطر CDI في البشر، واستخدام نموذج سيفوبيرازون تعكس بشكل أدق تحدث طبيعيا ومرض 16. وقد تم الطعن الفئران عرضة للجيم صعب المعالجة سيفوبيرازون مع كل من جيم جراثيم صعب والخلايا النباتية من مجموعة متنوعة من السلالات التي تتراوح في سريريأهمية والفوعة 17. وعلى الرغم من بعض الدراسات الأصلية باستخدام جيم الخلايا النباتية صعب كما شكل المعدية، تعتبر جيم جراثيم صعب الوسيلة الرئيسية لنقل 18.

في العقد الماضي، C. صعب R20291، وNAP1 / BI / 027 سلالة، ظهرت، مما تسبب أوبئة CDI 19،20. سعينا لتحديد المسار السريري للمرض عندما طعن في الفئران المعالجة سيفوبيرازون مع جيم سلالة العسيرة سريريا ذات الصلة وراثيا لين العريكة، R20291. تفاصيل هذا البروتوكول على المسار السريري، بما في ذلك فقدان الوزن، والاستعمار الجرثومي، سمية الخلايا السمية، والتغيرات التشريحية المرضية في الجهاز الهضمي من الفئران تحدى مع جراثيم جيم صعب R20291. وعموما، هذا نموذج الفأر يبرهن على أن تكون منصة تجريبية قيمة لCDI تقارب الأمراض التي تصيب البشر. هذا نموذج الفأر يتميز بالتالي يمكن استخدامها لتقييم آثارعلاجات جديدة على تحسن المرض السريري وعلى استعادة مقاومة الاستعمار ضد C. صعب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاقي:
وافقت اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في ولاية كارولينا الشمالية كلية جامعة ولاية الطب البيطري (NCSU) هذه الدراسة. وNCSU رعاية الحيوان واستخدام سياسة تطبق المعايير والمبادئ التوجيهية الواردة في قانون قانون والإرشاد الصحي بحوث رعاية الحيوان من عام 1985. مرافق حيوان مختبر في NCSU تلتزم المبادئ التوجيهية الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم تقييم الأوضاع الصحية للحيوانات يوميا، وكانت الحيوانات تحتضر الموت الرحيم إنسانية من قبل CO 2 الخنق تليها تدابير الثانوية. الفنيين الحيوانات المدربة أو طبيب بيطري إجراء تربية الحيوانات في منشأة معتمدة AAALAC خلال هذه الدراسة.

1. الإدارة من المضادات الحيوية سيفوبيرازون في مياه الشرب على تحقيق القابلية للC. صعب الاستعمار والأمراض

ملاحظات: C57BL العمر 8 أسابيع 5- ل/ 6 الفئران WT (الإناث والذكور)تم شراؤها والحجر الصحي لمدة 1 أسبوع قبل بدء إدارة المياه للمضادات الحيوية. وبعد الحجر الصحي، وتم إيواء الفئران مع الغذاء تعقيمها، والفراش، والماء. تم إجراء تغييرات قفص الأسبوعية من قبل موظفي المختبر في غطاء تدفق الصفحي.

  1. إعداد سيفوبيرازون (0.5 ملغ / مل) في الماء المقطر المعقم قبل 7 أيام من اليوم مستهدفة من التحدي (الشكل 1).
  2. ملء زجاجات المياه وتعقيمها بالماء سيفوبيرازون (0.5 ملغ / مل)، ووضعها في كل قفص الماوس.
    ملاحظة: يجب أن تكون المياه سيفوبيرازون الطازجة وتغير من كل أيام 2 خلال فترة 5 أيام، كما تدل في الخطوات 1.1 و 1.2. ويوصى التخلص السليم من المياه سيفوبيرازون التالية المبادئ التوجيهية للصحة البيئية والسلامة المؤسسية.
  3. بعد 5 أيام على المياه سيفوبيرازون، استبدال زجاجات زجاجات المياه تعقيمها مملوءة بالماء المقطر المعقم. إعطاء الفئران هذا مياه الشرب لمدة التجربة.

2. إعداد C. صعب سبور اللقاح وبالتزقيم عن طريق الفم من الفئران

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يتم وضع العناصر التالية في غرفة اللاهوائية لا يقل عن 24 ساعة ما يلي: 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، وانظر المواد)، سيكلوسيرين توروكولات سيفوكسيتين الفركتوز أجار (TCCFA) لوحات (انظر المواد وملف التكميلي )، والعقيمة على شكل حرف L رش.

ملاحظة: الفئران تحدى مع جيم جراثيم صعب يجب أن يضم في منشأة الحيوان السلامة الأحيائية المستوى 2.

  1. الحصول على جيم الأسهم بوغ العسيرة من سلالة المطلوب (في هذه الحالة، R20291) التي أعدت في وقت سابق وتخزينها في 4 درجات مئوية في الماء المعقم 21،22. تحديد تعداد هذه الأسهم بوغ قبل استخدامها.
  2. استنادا إلى تركيز المعروفة (جراثيم / مل) من الأسهم بوغ، وحساب التخفيف المطلوب للحصول على 10 5 الجراثيم في 25 ميكرولتر. ضمان حجم اللقاح غير كافية لتطعيم جميعالفئران في التجربة (25 ميكرولتر في الماوس)، لأداء التعداد من اللقاح (حوالي 30 ميكرولتر)، ولحساب الخطأ pipetting ل.
  3. دوامة الأصلي جيم الأسهم بوغ العسيرة. ثم، resuspend وحجم محسوب (من الخطوة 2.2) من جيم الأسهم بوغ العسيرة الأصلي في الماء المعقم داخل أنبوب microcentrifuge المغطاة المسمار. تنفيذ هذا هوائيا في غطاء تدفق الصفحي. تحديد هذا الخليط المخفف باسم "اللقاح بوغ".
  4. وضع اللقاح بوغ في حمام الماء 65 درجة مئوية والحرارة لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: هذه الخطوة أن تضمن النشطة فقط C. جراثيم صعب تبقى بعد المعالجة الحرارية.
  5. داخل غطاء تدفق الصفحي، واتخاذ 50 ميكرولتر من اللقاح بوغ ساخنة، ووضعه في أنبوب microcentrifuge العقيمة، وتمريرها الى غرفة اللاهوائية 23. استخدام هذه العينة لتعداد الجراثيم.
  6. داخل غطاء تدفق الصفحي، تحميل بوغ ساخنة اللقاح كثافة العمليات المتبقيةالزراعة العضوية حقنة 1 مل يعلق على ذات الرؤوس لمبة العقيمة أنبوب تغذية في المعدة إبرة. استخدام حقنة السائر اليدوي لضمان تكرار دقيق وسريع الجرعات بين الفئران. ضمان أن يتم شغل الإبرة أنبوب تغذية مع اللقاح بوغ ساخنة قبل استخدامها.
    ملاحظة: معقمة جديدة إبرة بالتزقيم لكل الماوس غير مطلوب. ومع ذلك، إذا تم الجرعات المختلفة من جيم جراثيم صعب، فمن المستحسن إبرة أنبوب تغذية جديدة لكل جرعة.
    ملاحظة: C. جراثيم صعب هي شديدة المقاومة للمطهرات التقليدية. ولذلك، فإن استخدام مطهر مبيد الأبواغ، مثل رقم 62 Perisept مبيد الأبواغ مطهر، أمر ضروري. الشركة المصنعة توصي وقت الاتصال 2-دقيقة لتدمير جيم جراثيم صعب.
  7. أنبوب تغذية كل فأر مع 25 ميكرولتر من اللقاح بوغ. كبح جماح كل فأر بلطف استيعاب الحيوان عن طريق الجلد فضفاض من الرقبة والظهر وذلك لشل حركة الرأس. باستخدام السبابة مزيد لشل حركة رأس الحيوان واستطال المريء. التأكد من أن الحيوان لا نطق أو تظهر علامات أخرى من الشدة أثناء ضبط النفس.
    ملاحظة: الحجم الكلي نظرا لالفئران عن طريق أنبوب تغذية ينبغي ألا يتجاوز 10 مل / كغ من وزن الجسم (0.1 مل / ز 10).
  8. الحفاظ على الماوس في وضع مستقيم، الرأسي وتمر بلطف الإبرة أنبوب تغذية في جانب الفم. توجيه الإبرة أنبوب تغذية على طول سقف الفم وتقدم ببطء الإبرة أنبوب تغذية في المريء.
    ملاحظة: إذا واجه أي مقاومة، وإبرة أنبوب تغذية يمكن أن يدخل إلى القصبة الهوائية، وبالتالي يجب أن لا تتقدم، وإنما إزالة وتعديل أوضاعها فورا.
  9. بعد الإبرة أنبوب تغذية تقريبا في منتصف الطريق إلى المريء، وضخ 25 ميكرولتر من اللقاح بوغ ساخنة وسحب بلطف الإبرة أنبوب تغذية من المريء.
    ملاحظة: تقدم بالقوة الإبرة بالتزقيم قد يؤدي إلى تمزق في المريء أو المعدة. لذلك، إذا تم مصادفة المقاومة عند دفع إبرة بالتزقيم، فمن الأفضل لإزالة فورا وإعادة الإبرة تسمين.
  10. عودة الحيوان إلى القفص، ومراقبة لأي السعال أو علامات ضيق التنفس، وهذا قد يشير إدارة القصبة الهوائية غير مقصودة أو تطلع من اللقاح بوغ ساخنة.
    ملاحظة: الفئران عرضة للغاية لC. صعب بعد العلاج بالمضادات الحيوية. وبالتالي، الاحتياطات اللازمة لمنع انتقال التلوث بين أقفاص أمر ضروري. هذا مهم بشكل خاص عند إدارة الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ولكن دون منازع والضوابط.
  11. بعد بتلقيح جميع الفئران، ضع ساخنة اللقاح بوغ المتبقية في أنبوب microcentrifuge معقمة وتمريرها الى غرفة اللاهوائية للتعداد الجراثيم.
  12. لتعداد اللقاح بوغ ساخنة (من الخطوة 2.4) والباقي gavaged ساخنة اللقاح بوغ، وجعل 01:10 التخفيفات المسلسل من كل اللقاح في برنامج تلفزيوني 1X. فمن المستحسن لجعل ولوحة 4-5 التخفيفات (أي 10 -1 من خلال10 -5).
  13. باستخدام تقنية العقيم، ونقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي على لوحة TCCFA الفردية.
  14. استخدام معقم على شكل حرف L رش، موزعة بالتساوي على تخفيف تطبيقها على المدى المتوسط ​​عبر لوحة. حتى نشر من اللقاح المخفف هو ضروري لتعداد دقيق للجراثيم.
  15. احتضان لوحات هوائيا لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، C. الوحدات المكونة للمستعمرة صعب (CFUs) يمكن تعداد للحصول على الجرعة المسببة للعدوى تدار على الفئران في 25 ميكرولتر (0.025 مل) حجم (راجع الملف التكميلي "الحسابات مثال"). جيم المستعمرات صعب مسطحة وشاحب اللون الأصفر ولها حواف غير منتظمة والزجاج مظهر الأرض 24.
    ملاحظة: الحد من الكشف عن التعداد البكتيري هو 10 2 كفو.

3. رصد فقدان وزن الفأر والسريرية علامات المرض في جميع أنحاء جيم العدوى العسيرة

  1. تزنnimals قبل وبعد العلاج بالمضادات الحيوية لمدة 5 أيام سيفوبيرازون، بعد انتعاش 2-يوم الخروج من المضادات الحيوية (يوم 0)، ثم لمدة التجربة.
    ملاحظة: الحصول على الأوزان في وقت ثابت كل يوم. حصلت الأوزان يوم التحدي (يوم 0) يجب أن تستخدم الوزن الأساسي الأولي للمقارنة في جميع أنحاء C. عدوى العسيرة.
  2. وضع مقياس رقمي إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. وضع كوب بلاستيكية معقمة على نطاق والفارغة وزن الكأس البلاستيك. ثم، واختيار بلطف صعودا والماوس عن طريق قاعدة الذيل ووضعه في كوب من البلاستيك.
    1. ضع الكأس مرة أخرى على نطاق واسع. تحوم اليد على الجزء العلوي من الكأس لضمان أن الماوس لا الهروب. قد يستغرق 2-3 ثانية للحصول على وزن ثابت. ثم، ضع بلطف الماوس مرة أخرى في قفصه. تسجيل هذا الوزن، وتكرار هذه العملية لكل الماوس في هذا القفص.
      ملاحظة: من الضروري أن تؤخذ الاحتياطات اللازمة لمنع انتقال contaminaنشوئها بين أقفاص عند الحصول على الأوزان. يجب أن يكون كل قفص من الفئران في كوب من البلاستيك الخاص للوزن. يجب تطهير الأكواب البلاستيكية مع وكيل مبيد الأبواغ بين كل استخدام ومغطاة بورق الألومنيوم العقيمة.
  3. مراقبة الحيوانات تحدى مرتين يوميا (كحد أدنى) لعلامات C. عدوى العسيرة سريريا شديدة، بما في ذلك الخمول، وفقدان الشهية، والإسهال، والتقوس في الجلوس.
  4. الموت ببطء إنسانية الحيوانات التي تفقد 20٪ من وزن الجسم الأساس الأولي و / أو تطوير علامات سريرية شديدة من جيم العدوى العسيرة (المذكورة في الخطوة 3.3).
    يجب أن يكون وزنه الفئران التي تعرض علامات سريرية للC. عدوى العسيرة حسب الحاجة أثناء التجربة للتأكد من أنها لم تكن قد فقدت 20٪ من وزن الجسم الأساسي الأولي: ملاحظة. خلال نقاط وقت مبكر في التجربة، وهذا قد يعني القياسات مرتين يوميا.

4. التعداد الجرثومي من جيم صعبمن البراز ماوس والمحتوى الأعور

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يتم وضع العناصر التالية في غرفة اللاهوائية لا يقل عن 24 ساعة: برنامج تلفزيوني 1X (انظر المواد)، لوحات TCCFA (انظر المواد)، العقيمة على شكل حرف L رش، وأنابيب microcentrifuge معقمة و / أو لوحات PCR لالتخفيفات.

  1. الحصول على عينات لجيم تعداد العسيرة
    ملاحظة: قبل الحصول على البراز أو محتوى الأعور، تزن أنابيب microcentrifuge العقيمة على نطاق التحليلي. سجل وزن الأنبوب على الجانب من الأنبوب، التقريب إلى أربعة منازل عشرية (على سبيل المثال، 0.9864 ز). دلالة هذا الوزن باسم "وزن الأنبوب." يجب وضع كل عينة تم جمعها في أنبوب microcentrifuge عقيم، وزنه.
    1. جمع العقيمة من براز الفأر
      1. كبح بلطف كل الماوس عن طريق استيعاب الحيوان عن طريق الجلد فضفاض من الرقبة والظهر وذلك لشل حركة الرأس. استخدام إصبع الخنصر إلى كبح بلطف ذيل الحيوان، رHUS تعريض فتحة الشرج. التأكد من أن الحيوان لا نطق أو تظهر علامات أخرى من الشدة أثناء ضبط النفس.
      2. عقد العقيمة، أنبوب microcentrifuge وزنه مباشرة تحت فتحة الشرج الحيوان. ومن الضروري أن الأنبوب لا يأتي في اتصال مباشر مع الماوس.
        1. كما يتبرز الحيوان، وجمع بيليه البراز في أنبوب. الحفاظ على أنبوب في درجة حرارة الغرفة حتى يتم جمع كل العينات البرازية. يمكن أن يستغرق عدة دقائق للماوس لالتبرز، مما يستلزم محاولات تكرار لجمع البراز.
      3. وزن الأنابيب التي تحتوي على البراز على نطاق والتحليلي. تسجيل الوزن أنبوب، التقريب إلى أربعة منازل عشرية (على سبيل المثال، 1.0021 ز). دلالة على الوزن التي يتم الحصول عليها من "الوزن أنبوب النهائي."
      4. تمرير العينات البرازية في غرفة اللاهوائية للتعداد البكتيريا مباشرة بعد جمع البراز.
    2. جمع العقيمة من المحتويات الماوس الأعور في وقت التشريح
      1. بعد القتل الرحيم إنسانية من خلال CO 2 الخنق تليها تدابير الثانوية، إجراء تشريح للحصول على الأعور 25. الأعور هو، قسم كبير على شكل فاصلة في الجهاز الهضمي.
      2. ضع الأعور على طبق بتري بلاستيكية معقمة. استخدام المتاح، لا العقيمة. 10 شفرة مشرط لقطع الأعور مفتوحة من نهاية الطرف من الحقيبة لفضح محتويات الأعور.
        1. استخراج بلطف محتويات الأعور عن طريق الضغط الخفيف مع شفرة مشرط وتجتاح محتويات نحو الجزء قطعي من الأعور.
          ملاحظة: يجب الحرص على عدم تعطيل الأنسجة الأعور، الذي سيتم تقديمه للفحص الأنسجة.
      3. وضع محتويات الأعور إلى ذلك، أنبوب microcentrifuge العقيمة وزنه مباشرة بعد جمع. فقط حوالي 10 ملغ من محتوى الأعور هو مطلوب لتعداد البكتيريا.
      4. وزن الأنابيب التي تحتوي على محتوى الأعور على SCAL التحليليه. تسجيل الوزن أنبوب، التقريب إلى أربعة منازل عشرية (على سبيل المثال، 1.0021 ز). دلالة على الوزن التي يتم الحصول عليها من "الوزن أنبوب النهائي."
      5. تمرير عينات المحتوى الأعور في غرفة اللاهوائية للتعداد البكتيري.
  2. التعداد البكتيري C. صعب
    1. حساب الوزن النهائي للمحتويات (البراز أو أعوري) التي سيتم المذكورة لC. صعب. يقوم هذا عن طريق طرح "الوزن أنبوب النهائي" من "الوزن أنبوب."
    2. حساب 1:10 التخفيف من المحتويات في برنامج تلفزيوني 1X و resuspend وفقا لذلك. الكريات البرازية، استخدم غيض من ماصة لتعطيل بلطف بيليه في الحل (راجع الملف التكميلي "الحسابات مثال").
    3. لا هوائيا احتضان هذه العينات معلق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، والسماح للمحتويات ليستقر.
    4. جعل التخفيفات التسلسلية لكل عينة في برنامج تلفزيوني 1X لالتعدادمواصلة النظر في كفو لكل غرام من المحتوى (البراز أو أعوري). تنفيذ هذا هوائيا.
    5. باستخدام تقنية العقيم، ونقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف التسلسلي لوحات TCCFA. استخدام معقم على شكل حرف L رش، نشر تخفيف تطبيقها على وسائل الإعلام لنشر بالتساوي ذلك عبر لوحة. حتى انتشار التخفيف من الضروري لتعداد دقيق للمستعمرات.
    6. احتضان لوحات هوائيا لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية. في هذا الوقت، تعداد جيم المستعمرات صعب الحصول على كفو في غرام من المحتوى (البراز أو أعوري). جيم المستعمرات صعب مسطحة وشاحب اللون الأصفر ولها حواف غير منتظمة والزجاج مظهر الأرض 24.
      ملاحظة: هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتعداد C. صعب من غيرها من المحتويات GI الفئران، بما في ذلك فائفي ومحتوى القولون. لوحات PCR يمكن استخدامها لصنع التخفيفات المسلسل.

5. فيرو الخلية السمسة الفحص لتحديد C. صعب السمية Cytotoxiمدينة

ملاحظة: من المستحسن أن يتم إجراء هذا الاختبار بعد الانتهاء من نموذج الفأر على العينات التي تم جمعها في تشريح وتخزينها في -80 درجة مئوية. تقنيات زراعة الخلايا العقيم ضرورية لمنع التلوث من خلايا الفيرو خلال هذا الاختبار. هذا البروتوكول يأخذ 2 أيام لأداء. يجب أن يتم تخزين جميع البراز ومحتوى الأمعاء المستخدمة في هذا الاختبار في، أنبوب microcentrifuge العقيمة وزنه (الرمز مع "الوزن أنبوب،" انظر القسم أعلاه). يتم قياس الوزن أنبوب النهائي (بما في ذلك المحتويات) عبر نطاق التحليلي إلى أقرب أربعة أرقام عشرية (انظر أعلاه). من المستحسن استخدام ماصة متعدد القنوات لهذا الاختبار.

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن تتوفر العناصر التالية: خلايا فيرو، تعديل Dulbecco والنسر المتوسط ​​(DMEM) 1X مع 10٪ للحرارة المعطل مصل الجنين البقري (FBS) و 1٪ البنسلين / وسائل الإعلام الستربتومايسين (يرمز لها "DMEM 1X وسائل الإعلام، "انظر المواد وملف إضافي)، 0.25٪التربسين- EDTA، برنامج تلفزيوني 1X، 0.4٪ التريبان الأزرق، 96-جيدا ثقافة خلية لوحة القاع شقة، لوحة تصفية 96-جيدا، المطثية العسيرة السمية ألف (قسامة في 3 ميكرولتر في 1 ميكروغرام / ميكرولتر في الماء فائقة البحتة و مخزن في -80 درجة مئوية)، المطثية العسيرة الترياق، ورقة عمل (لإجراء العمليات الحسابية وخرائط لوحة، وانظر ملفات إضافية).

وينبغي اتخاذ الحذر خلال هذا الاختبار للتعرض الأفراد إلى C. صعب والسمية لها: ملاحظة.

  1. تقسيم خلايا فيرو (يوم 1)
    1. سخن وسائل الاعلام DMEM 1X، 0.25٪ التربسين-EDTA، وبرنامج تلفزيوني 1X في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. الحصول على قارورة من الخلايا فيرو من الحاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) ووضعه في الثقافة خلية غطاء تدفق الصفحي العقيمة. استخدام 70٪ من الإيثانول لمسح أسفل غطاء محرك السيارة والمعدات قبل استخدامها. باستخدام ماصة المصلية، نضح في وسائل الاعلام من قارورة زراعة الأنسجة لإزالته من الخلايا فيرو وتخلص منه في النفايات جontainer.
    3. شطف خلايا فيرو مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X (مسخن) في قارورة زراعة الأنسجة. نضح في برنامج تلفزيوني وتخلص منه في حاوية النفايات.
    4. إضافة 5 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA إلى قارورة زراعة الأنسجة. السماح لوقت الاتصال من 2-3 دقيقة. خلال هذا الوقت، ومراقبة الخلايا تبدأ تؤتي ثمارها على سطح القارورة. صخرة بلطف الأنسجة الجانب الثقافة قارورة إلى جنب لتخفيف خلايا فيرو.
    5. بعد وقت الاتصال مع التربسين-EDTA، على الفور إضافة 5 مل من DMEM 1X وسائل الإعلام في قارورة زراعة الأنسجة. هذا وسوف تحييد التربسين-EDTA. استخدام هذا الحل لغسل بلطف أي خلايا الفيرو غير مرتبط من الجزء الخلفي من القارورة. ثم، واستخدام ماصة المصلية لنقل هذا الخليط في أنبوب مخروطي 15 مل.
    6. الطرد المركزي الخلايا فيرو في أنبوب مخروطي الشكل لمدة 5 دقائق في 180 x ج و 25 درجة مئوية. تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي متوازن بشكل صحيح. بعد الطرد المركزي، ومراقبة بيليه المرئي من خلايا الفيرو في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي الشكل. يجب الحرص على عدم disrUPT هذا بيليه. نضح من طاف من أنبوب مخروطي الشكل وتخلص منه.
    7. resuspend الخلايا فيرو في 3 مل من DMEM 1X وسائل الإعلام.
  2. عد خلايا الفيرو
    1. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية فيرو (صنع في الخطوة 5.1.7) إلى 100 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الأزرق. المزيج بلطف بواسطة pipetting الحل صعودا وهبوطا.
    2. إضافة 10 ميكرولتر من هذا الخليط لكل غرفة من عدادة الكريات.
    3. حساب عدد خلايا قابلة للحياة في الأرباع الأربعة للعدادة الكريات. والخلايا الميتة فيرو يستغرق التريبان الأزرق، وبالتالي سيتم الملون الأزرق (لا ينبغي أن تحسب هذه الخلايا). تسجيل هذه الأرقام في "ورقة عمل خلية فيرو"، المقدمة.
    4. خلاصة القول أن العدد الكلي للخلايا فيرو قابلة للحياة في جميع الأرباع الأربعة وحساب المتوسط. ضرب من قبل عامل التخفيف، والذي هو 2 منذ 100 ميكرولتر من الخلايا هي في ما مجموعه 200 ميكرولتر من السائل.
    5. ضرب من قبل عامل التصحيح لإعطاء "وعدد من خلية / مل "عند استخدام عدادة الكريات، ومعامل التصحيح هو دائما 10 4 ضرب على الحجم الكلي لإعطاء". العدد الكلي للخلايا ".
  3. تحديد عدد الآبار المطلوبة لكل تجربة
    ملاحظة: عينة واحدة (أي البراز أو محتوى الأمعاء) يتطلب 24 بئرا منفصلة التي يتعين القيام بها في نسختين. مطلوب تركيز 10 5 خلايا فيرو لكل بئر (الحجم الكلي لل90 ميكرولتر).
    ملاحظة: إذا كان أحد يرغب في احتضان خلايا فيرو لوحات 96-جيدا ليلا 37 درجة مئوية، وتركيز من 10 3 خلايا فيرو لكل بئر ينصح لحساب فترة حضانة طويلة. سوف تحتاج إلى تعديل لمراعاة هذا التغيير الحسابات داخل ورقة عمل خلية فيرو.
    1. تحديد عدد الآبار التي يمكن استخدامها على أساس كمية من خلايا الفيرو المتاحة (من الخطوة 5.2، واستخدام ورقة عمل خلية فيرو، المقدمة).
    2. تحديد حجمفيرو تعليق خلية اللازمة لملء عدد من الآبار المطلوب (على أساس عدد العينات التي يجري اختبارها). تأكد من أن يتم إضافة أي الحجم الإضافي في لحساب pipetting لخطأ (استخدم المقدمة فيرو ورقة عمل الخلية).
    3. تمييع تعليق خلية فيرو (تم الحصول عليها في الخطوة 5.1.7) في وسائل الاعلام DMEM 1x إلى الحصول على الكمية المطلوبة للتجربة.
  4. خلايا فيرو بذر إلى 96 جيدا ثقافة خلية لوحة
    1. استخدام الخلية إعادة تعليق فيرو من الخطوة 5.3.2، واستخدام ماصة متعدد القنوات لإضافة 90 ميكرولتر من تعليق خلية فيرو إلى كل بئر من 96-جيدا ثقافة خلية لوحة القاع شقة.
    2. احتضان لوحة مع الخلايا فيرو في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 مدة لا تقل عن 4 ساعات قبل أن يضيف السم (عينات) إلى الآبار. هذه فترة حضانة سوف تسمح للخلايا الفيرو على الانضمام إلى الجزء السفلي من كل بئر.
  5. خلق الحلول المالية من عينات (البراز أوالمحتوى المعوي)
    ملاحظة: يجب أن يكون لجميع العينات "الوزن أنبوب" و "الوزن أنبوب النهائي" يقاس عن طريق مقياس تحليلي. استخدام فيرو ورقة عمل خلية للحسابات.
    1. حساب الوزن من محتويات. تحويل ز إلى ملغ، ثم ملغ إلى ميكرولتر. حساب العدد الإجمالي النهائي للميكرولتر من محلول اللازمة لجعل تخفيف 01:10 في برنامج تلفزيوني 1X. حساب المبلغ الإجمالي من برنامج تلفزيوني 1X إضافة إلى عينة.
    2. إضافة الحجم الكلي للبرنامج تلفزيوني 1X (محسوبة أعلاه) للعينة. تنفيذ هذا هوائيا، واستخدام تقنية العقيم. الكريات البرازية، استخدم غيض من ماصة لتعطيل بلطف بيليه في الحل.
    3. دوامة العينات ثم الطرد المركزي لها في 3522 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي متوازن بشكل صحيح. يجب الحرص على عدم تعطيل بيليه و resuspend العينة إلى حل.
      ملاحظة: أثناء الخطوة 5.5.3، إذا كان يتم معالجة سوى عدد قليل من العينات، محتويات يمكن تعقيمها من قبلتمريرها من خلال واحد مرشح 0.22 ميكرومتر بدلا من استخدام فلتر لوحة 96-جيدا. قد تتطلب بعض عينات عدة مرشحات لتعقيم محتوى حجم بأكمله باستخدام هذه التقنية.
    4. تعقيم عينة / PBS الخليط عن طريق أخذ 150 ميكرولتر من طاف ووضعه في آبار منفصلة على فلتر لوحة 96-جيدا. وضع لوحة مرشح بشكل آمن على رأس 96-جيدا ثقافة خلية لوحة مسطحة القاع بحيث محتويات سوف تصفية في هذه اللوحة.
    5. الطرد المركزي فلتر لوحة / خلية لوحة الثقافة المكدس في 431 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي متوازن بشكل صحيح وأن / خلية كومة وحة الثقافة فلتر لوحة تتماشى بإحكام ولن تحول خلال الطرد المركزي.
      ملاحظة: هذه المحتويات التي تمت تصفيتها هي الأسهم 10 -1 التي سوف تستخدم في لوحات التخفيف.
    6. وضع لوحة مع العينات التي تمت تصفيتها على الجليد.
  6. خلق التخفيف لوحة رقم 1
    ملاحظة: التخفيف جيش التحرير الشعبى الصينىوالشركة المصرية للاتصالات رقم 1 (DP 1 #) تتطلب 6 آبار في العينة، بما في ذلك إيجابيا (جيم العسيرة السمية أ) والسالب (برنامج تلفزيوني 1X) ضوابط (انظر موانئ دبي # 1 تخطيط على ورقة عمل خلية فيرو).
    1. لإعداد مراقبة إيجابية (جيم العسيرة السمية أ) لهذا الاختبار، يجب الحصول قسامات 3 ميكرولتر (1 ميكروغرام / ميكرولتر) من -80 درجة مئوية وإضافة 297 ميكرولتر من الماء عالى النقاء، مما أسفر عن تركيز النهائي من 0.01 ميكروغرام / ميكرولتر. مكان على الجليد.
    2. تسمية الآبار مع التخفيفات من (10 -1 إلى 10 -6) لكل عينة، وبيان الضوابط الإيجابية والسلبية (انظر موانئ دبي # 1 تخطيط).
    3. إضافة كميات مناسبة من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل بئر. في 10 -1 الآبار، إضافة NO برنامج تلفزيوني. ل10 -2 الى 10 -6 الآبار، إضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.
    4. إضافة كميات مناسبة من العينات إلى كل بئر. في 10 -1 الآبار، إضافة 100 ميكرولتر من الأسهم 10 -1 لكل عينة (راجع الخطوة 5.5.7 من بلات فلتره). ل10 -2 الى 10 -6 الآبار، وجعل التخفيفات المسلسل. تبدأ من خلال اتخاذ 10 ميكرولتر من البئر 10 -1 وإضافته إلى -2 10 أيضا. مواصلة التخفيفات المسلسل إلى التخفيف 10 -6.
    5. تغطية موانئ دبي # 1 لوحة مع واضح الختم لاصق من البلاستيك ووضعها على الجليد.
  7. خلق التخفيف اللوحة رقم 2
    ملاحظة: لوحة لتخفيف (DP # 2) سيتطلب 2 حارات 6 آبار لكل عينة، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية (انظر موانئ دبي # 2 تخطيط على ورقة عمل خلية فيرو).
    1. تسمية الآبار مع التخفيفات من (10 -1 إلى 10 -6) لكل عينة، وبيان الضوابط الإيجابية والسلبية (انظر موانئ دبي رقم 2 التخطيط). تسمية الآبار مع اسم العينة (يشار إليها باعتبارها "آبار عينة") أو اسم عينة مع الترياق (يرمز لها "آبار الترياق").
    2. حساب كمية من الترياق اللازم لهذا الاختبار. ملاحظة: إن الترياق هو المخزون 25Xالحل الذي يحتاج إلى أن تضعف 01:25 في برنامج تلفزيوني 1X. وضع استعداد الترياق 1X الحل على الجليد.
    3. ل "آبار عينة"، إضافة 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل بئر لجميع التخفيفات (10 -1 إلى 10 -6) من تلك العينة. ل "آبار الترياق"، إضافة 20 ميكرولتر من 1X الترياق إلى كل بئر لجميع التخفيفات (10 -1 إلى 10 6) من تلك العينة.
    4. نقل 20 ميكرولتر من العينة المخفف في الآبار من موانئ دبي # 1 في الآبار المعينة على موانئ دبي رقم 2 للصفوف 1-6 والصفوف 7-12 (انظر موانئ دبي # 2 تخطيط على ورقة عمل خلية فيرو). مزيج الحل بلطف بواسطة pipetting صعودا وهبوطا.
    5. تغطية موانئ دبي رقم 2 مع واضح الختم لاصق من البلاستيك والسماح 40 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة. هذه الحضانة هو السماح للالترياق لربط وبالتالي على تعطيل وتحييد جيم السم العسيرة.
    6. بعد الحضانة، إضافة 10 ميكرولتر من خليط من موانئ دبي رقم 2 لآبار خلية فيرو المناسبة (انظر فيرو تخطيط لوحة الخلية على Vايرو ورقة عمل الخلية). المزيج بلطف حل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا فيرو التي انضمت إلى السطح السفلي من الآبار.
    7. احتضان لوحة خلية فيرو بين عشية وضحاها في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  8. تقييم خلايا فيرو لتقريب باستخدام مجهر الضوء (اليوم 2)
    ملاحظة: أذكر أن التغييرات عامل التخفيف بمعامل 10 عند إضافة خليط من العينة إلى لوحة خلية فيرو (على سبيل المثال، 10 -3 الآن 10 -4). يجب أن الآبار التي لديها الترياق الحالي ليس لديهم أي خلية التقريب فيرو لاحظت. وسوف يلاحظ فيرو التقريب الخلية (السمية الخلوية) في عينات التي تحتوي على جيم صعب السم. إذا تم تحييد النشاط السامة للخلايا في تخفيف تحتوي على عينة والترياق، وأكدت وجود جيم السم العسيرة مما أدى إلى فيرو الخلايا السمية الخلوية.
    1. دراسة لفيرو الخلية التقريب باستخدام من lighر المجهر في 200X التكبير. للآبار عينة (بما في ذلك مراقبة إيجابية)، تسجيل التخفيف من البئر الذي هو آخر أن يكون 80٪ فيرو الخلية التقريب لاحظ.
    2. حساب عيار السامة للخلايا، والذي يعرف بأنه مقلوب أعلى التخفيف التي تنتج 80٪ فيرو التقريب خلية لكل غرام من العينة. على سبيل المثال، إذا كان أعلى تخفيف 10 -5، ثم عامل التخفيف سيكون 10 -6 لهذه العينة. وهكذا، سجل [عامل التخفيف النهائي] / غرام من العينة سيتم تسجيل [10 6]، والتي ينتج عيار المتبادل لل6.
      ملاحظة: خلايا الفيرو تحتاج إلى خضعت ما لا يقل عن 3-4 الممرات وليس أكثر من 30 مقاطع قبل استخدامها في هذا الاختبار 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أثناء دراسة التمثيل، وسابقة التجهيز من العمر 5 أسابيع C57BL / 6 الفئران WT مع سيفوبيرازون في مياه الشرب (0.5 ملغ / مل) لمدة 5 أيام، وسمح ليوم 2 تغسل مع مياه الشرب العادية. وقد تم الطعن الفئران مع 10 5 أبواغ C. صعب R20291 خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم في يوم 0 (الشكل 1A). تم رصد الفئران لفقدان الوزن والعلامات السريرية (الخمول، وفقدان الشهية، والإسهال، والموقف منحنية) من CDI لمدة 14 يوما. أدى تحدي C57BL / 6 WT الفئران مع جراثيم جيم صعب R20291 في الإسهال خلال 24 ساعة ونقص ملحوظ في الوزن خلال 48 ساعة بعد التحدي (الشكل 1B). وإن لم يكن لوحظ في هذه التجربة، يمكن أن الفئران تحدى مع جرعة عالية من جيم صعب R20291 يمرضون بشدة أو يكون أكبر من 20٪ فقدان الوزن عن طريق 48-72 ساعة بعد التحدي، مما يستلزم القتل الرحيم إنسانية. لذلك، الفئران تتطلب حدا أدنى من مرتين يوميامراقبة بعد التحدي مع جيم جراثيم صعب.

في هذه الدراسة التمثيلية، وقد لوحظ وجود كمية كبيرة من فقدان الوزن والعلامات السريرية للمرض في الفئران أيضا في أيام 2-7 بعد التحدي (الشكل 1B). في 7 أيام بعد التحدي، بدأت الفئران لزيادة الوزن، وخفت الأعراض السريرية للمرض. في الأسبوع الأخير من التجربة، ويبدو أن الفئران العادية سريريا، مع عدم وجود دليل على علامات سريرية للCDI، بما في ذلك الإسهال.

تم جمع الكريات البرازية قبل التحدي مع جيم جراثيم صعب وكل 48 ساعة بعد التحدي (الشكل 1C). قبل العلاج بالمضادات الحيوية، ولم تكن مستعمرة الفئران مع جيم صعب. في غضون 24 ساعة بعد التحدي مع جيم جراثيم صعب، كان تحت الاستعمار الفئران مع 10 7 CFUs جيم صعب في غرام من البراز (الشكل 1C </ قوي>). ظلت الفئران المستعمر باستمرار مع جيم صعب في كافة مراحل التجربة، على الرغم من أي دليل على فقدان الوزن أو علامات سريرية للCDI لمدة 7 أيام الأخيرة من التجربة.

شكل 1
الشكل 1: سيفوبيرازون المعالجة الفئران تحدى مع جيم صعب R20291 فقدان الوزن معرض والمستعمر مع جيم صعب. أ) العمر 5-أسابيع C57BL / 6 الفئران WT جاكس (ن = 3M / 3F في كل مجموعة) وكانت سابقة التجهيز مع سيفوبيرازون في مياه الشرب (0.5 ملغ / مل) لمدة 5 أيام وسمح ليوم 2 تغسل مع مياه الشرب العادية ماء. وقد تم الطعن الفئران مع 10 5 أبواغ C. صعب R20291 خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم في يوم تم رصد 0. الفئران لفقدان الوزن والعلامات السريرية (الخمول، وفقدان الشهية، والإسهال، والموقف منحنية) من CDI لمدة 14 يوما. تم جمع البراز واستخدامها لتعداد البكتيريا قبل البدء سيفوبيرازون، وعلى الفور بعد عملية الشراءص الانتهاء من المضادات الحيوية، وعلى أيام 0، 1، 2، 3، 4، 5، 7، 9، 11، 13، و 14 في جميع أنحاء العدوى. تم إجراء التشريح في أيام 0، 2، 4، 7، و 14. ب) الفئران فقدت قدرا كبيرا من وزنهم الأساسي بعد التحدي مع جيم صعب R20291. وقد تم قياس متوسط ​​وزن الجسم من الفئران يوميا من اليوم الذي شهد 0. كبيرة وفقدان الوزن في أيام من 2 إلى 7 بالمقارنة مع اليوم 0، والوزن الأساسي. تحميل C) C. صعب R20291 البكتيريا في البراز بعد التحدي. في غضون 24 ساعة بعد التحدي مع جيم جراثيم صعب، كان تحت الاستعمار جميع الفئران مع 10 7 CFUs (وحدات تشكيل مستعمرة) لكل غرام من البراز. لم تشاهد فروق كبيرة في هذه المعايير بين الإناث والذكور. تم تحديد الأهمية التي كروسكال اليس في اتجاه واحد اختبار ANOVA غير حدودي تليها البعدي دان (*، ص ≤ 0.05؛ **، ص ≤ 0.01، ***، ص ≤ 0.001، ****، ص الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أربعة الفئران (2 ذكور و 2 إناث) والموت الرحيم إنسانية وإعدادها للتشريح يوم 0، قبل العدوى، لخدمة التحكم كما هو غير المصابة. وبالإضافة إلى ذلك، والماوس واحد من كل قفص والموت الرحيم إنسانية وإعدادها للتشريح في أيام 2 و 4 و 7 و 14 بعد التحدي (الشكل 1A). تم إجراء تعداد C. صعب في محتوى الأعور في كل التشريح. في التوافق مع تعداد البراز، تم الكشف عن أي C. صعب في محتوى الأعور الفئران قبل التحدي مع جيم صعب. في 48 ساعة بعد التحدي، كان تحت الاستعمار الفئران مع ما يقرب من 10 8 CFUs جيم صعب في غرام من المحتوى الأعور (الشكل2A). ظلت كل الفئران التي استعمرت باستمرار في كافة مراحل التجربة.

تم تقييم محتوى الأعور أيضا في جميع أنحاء العدوى لوجود جيم السم صعب باستخدام فيرو الخلية السمسة مقايسة. تم الكشف عن أي دليل على جيم السم العسيرة السمية الخلوية في محتويات الأعور قبل التحدي (الشكل 2B). تم الكشف عن جيم السمية الخلوية صعب 2 بعد أيام من التحدي مع جيم جراثيم صعب واستمرت طوال العدوى. وعلى الرغم من الاستعمار موحدة إلى حد ما مع جيم صعب، والتباين في مستويات جيم النشاط السامة للخلايا العسيرة هو واضح في الفئران الفردية (الشكل 2B).

غالبية الماوس محتوى الأعور متعادلة مع جيم الترياق العسيرة خلال فحص فيرو الخلايا السمية الخلوية وليس لديها دليل للخلايا (فيرو مليرة لبنانية التقريب) في التخفيفات التي يؤدونها. ومع ذلك، عدد قليل من الفئران الفردية، على الرغم من إعادة الاختبار، كان دليلا على 50-100٪ السمية الخلوية في 10 -1 تخفيف (التخفيف حيث كانت العينة الأكثر تركيزا)، مع عدم وجود دليل على خلية فيرو التقريب في التخفيفات أخرى. الترياق المستخدمة في هذا الاختبار هو تحييد بولكلونل الأجسام المضادة إلى C. صعب السم، الذي أعد في الماعز (27). لذلك، هذا الترياق قد لا تحييد السم جيم ثنائي العسيرة التي تم إنتاجها من سلالة R20291. ومع ذلك، لا يعتبر جيم السم ثنائي العسيرة أن تكون سامة للخلايا 10. الإفراط C. صعب السم قادر على أن تحييد بواسطة الترياق أو وجود وكيل السامة للخلايا أخرى غير C. صعب السم يمكن أن تساهم في هذه النتيجة. لم هذه الملاحظة لا يؤثر على تحديد عيار السمية الخلوية لهذه العينات، منذ تخفيف كل عينة في الماضي مع 80٪ فيرو الخلية التقريب زيارتهايوجد دليل للخلايا عند دمجها مع الترياق في التخفيف محدد.

الشكل 2
الشكل 2: استعمار الأعور والسمسة خلال العدوى مع C. صعب R20291. أ) CECA الفئران ظلت المستعمر باستمرار مع جيم صعب في كافة مراحل التجربة، على الرغم من قرار من العلامات السريرية وزيادة الوزن الملحوظة. وقد استعمرت كل الفئران مع أكثر من 10 8 CFUs في غرام من محتويات الأعور عند تقييمها في 2 يوما بعد التحدي. ب) فحص خلية فيرو السمية الخلوية من محتوى الأعور في جميع أنحاء الإصابة بفيروس C. صعب R20291. بعد التحدي مع جيم جراثيم صعب، كانت الفئران مستويات عالية من السمية الخلوية، كما تم قياسها في سجل 10 التخفيف المتبادل من السم في غرام من المحتوى الأعور في أيام 2 و 4 و 7 بعد التحدي مقارنة مع اليوم 0 (الوساطات ةلثممد من الخط). تم تحديد الأهمية التي كروسكال اليس في اتجاه واحد اختبار ANOVA غير حدودي تليها البعدي دان (*، ص ≤ 0.05؛ **، ص ≤ 0.01، ***، ص ≤ 0.001، ****، ص ≤ 0.0001 ). تمثل أشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية من الوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فمن المستحسن أن يتم إجراء تقييم نسيجية من قبل الطبيب الشرعي الطب البيطري المجلس معتمدة بشكل أعمى. لتسجيل الأنسجة، وينبغي استخدام نظام تسجيل رقمي 0-4 لتقييم منفصل وذمة، وتسلل خلية التهابات، وتلف الخلايا الظهارية في الدقاق، الأعور والقولون استنادا إلى خطة التسجيل التي صدرت سابقا 17.

على امتحان الإمراضية أعمى ination التحدي الدقاق، الأعور والقولون التالية الفئران مع جيم صعب R20291، لوحظت التغيرات الباثولوجية الأكثر أهمية في الأعور (الشكل 3). بلغ إجمالي عشرات نسيجية الأعور اختلافا كبيرا بين يوم 0 وأيام 2 و 4 بعد التحدي. ولم تلاحظ أي إصابات كبيرة في جميع أنحاء الدقاق الإصابة (الشكل 3). ولوحظت الآفات أكثر اعتدالا في القولون. وكانت مجموع الدرجات النسيجية القولون تختلف اختلافا كبيرا بين يوم 0 وأيام 2 و 7 تحديا آخر (الشكل 3).

هي ممثل H & E أقسام الدقاق، الأعور والقولون في جميع أنحاء العدوى المتاحة في الشكل 4. تتضمن كل صورة منها مجموع رصيده النسيجية وعشرات الفردية عن الضرر الظهارية، والتهاب، وذمة، وعلى النحو الذي يحدده الطبيب الشرعي الطب البيطري أعمى المجلس معتمدة ( SAM).

: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (3)
الشكل (3): يحرز النسيجي للالفئران الدقاق، الأعور، والقولون خلال العدوى مع C. صعب R20291. تم حساب مجموع الدرجات النسيجية بإضافة جميع الدرجات الثلاث من المعلمات تقييم: الضرر الظهارية، والتهاب، وذمة. ولم تلاحظ أي تغيرات نسيجية كبيرة في جميع أنحاء الدقاق العدوى. الأنسجة الأعور الواردة الآفات النسيجية والتي تبرز أثناء CDI. وكانت مجموع الدرجات النسيجية الأعور تختلف كثيرا عن اليوم 0 في أيام 2 و 4 بعد التحدي. ولوحظت الآفات أكثر اعتدالا في القولون. وكانت مجموع الدرجات النسيجية القولون تختلف كثيرا عن اليوم 0 في أيام 2 و 7 بعد التحدي. تم تحديد الأهمية التي كروسكال اليس في اتجاه واحد اختبار ANOVA غير حدودي تليها البعدي دان (*، ص ≤ 0.05؛ **، ص ≤ 0.01، ***، ص804؛ 0.001. ****، ص ≤ 0.0001). تمثل أشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية من الوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: التشريح المرضي خلال العدوى مع C. صعب R20291. تحتوي هذه اللوحة أقسام H & E التمثيلية للالدقاق، الأعور والقولون في جميع أنحاء الإصابة بفيروس C. صعب R20291. مجموع الدرجات النسيجية هي بين قوسين () ليوم المقابلة والأنسجة المذكورة: لليوم الدقاق 0 (0)، يوم 2 (1)، يوم 4 (0)، يوم 7 (0)، ويوم 14 (0) . لليوم الأعور 0 (0)، يوم 2 (5)، يوم 4 (4)، يوم 7 (3)، ويوم 14 (3)؛ ولليوم القولون 0 (0)، يوم 2 (4)، يوم 4 (1)، يوم 7 (4)، ويوم 14 (2). وقد تم الحصول على Photomicrographs على مجهر الضوءه مع كاميرا رقمية 5 ميجا بكسل والبرامج المصاحبة لها (يمثل شريط مقياس 200 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1x PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1x Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  4. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
  5. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  6. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  7. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  8. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  9. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
  10. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  11. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  12. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  13. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  14. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  15. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  16. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
  17. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  18. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  19. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  20. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  21. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  22. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
  23. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787 (2013).
  24. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  25. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).
  26. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).
  27. Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
  28. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
  29. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  30. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
  31. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  32. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  33. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
  34. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).

Tags

عدوى، العدد 118،
المعالجة سيفوبيرازون ماوس نموذج سريريا ذات صلة<em&gt; المطثية العسيرة</em&gt; سلالة R20291
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winston, J. A., Thanissery, R.,… More

Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter