Summary
该协议概述了使用临床相关和转听话应变，R20291 艰难梭菌感染（CDI）的头孢哌酮小鼠模型。临床疾病的监测， 艰难梭菌细菌枚举，毒素的细胞毒作用，并在小鼠模型中在整个CDI病理学改变强调在协议中详述。
Introduction
艰难梭菌是一种厌氧，革兰氏阳性，形成孢子的杆菌引起危及生命的腹泻1。 艰难梭菌感染（CDI）与日益增多的人类发病率和死亡率，并导致每年1-4医疗费用相关的超过480十亿$。在2013年，美国疾病控制和预防归类难辨作为一项紧迫抗生素耐药性的风险，这表明它对公众健康的1紧迫的威胁。目前，万古霉素抗生素治疗和甲硝唑被认为是照顾的CDI 5标准。不幸的是，CDI复发成功治疗后用抗生素为高，在20发生-的患者2,5-7 30％。因此，新的治疗剂的发现对这种肠道病原体是必要的。为了评估对难辨梭状芽孢杆菌 ，动物模型近似交流人类疾病治疗需要linically相关的应变。
最初，柯赫氏法则是在1977年用克林霉素治疗的叙利亚仓鼠模型建立8 艰难梭菌 。这种模式是今天仍然利用探讨发病9,10的难辨梭状芽孢杆菌毒素的作用。然而，CDI在仓鼠模型导致高死亡率和不近似慢性阴险疾病表现可与CDI 10,11人看到。根据在研究鼠平台的辅助和试剂可用性，CDI的小鼠模型是相关的。
在2008年，CDI的健壮小鼠模型，通过用在饮用水3天之后克林霉素12腹膜内注射抗生素混合物（卡那霉素，庆大霉素，粘菌素，甲硝唑，万古霉素）治疗的小鼠建立的。这种小鼠呈现易受CDI和严重的结肠炎。依靠ING上施用接种的剂量，可以使用该模型被观察到的范围内的临床症状和杀伤力。因为这个时候，各个抗生素疗法已调查了改变的鼠肠道菌群，降低到艰难梭菌可以定植在胃肠道的点定植抗力（在最佳等人审查。和罗礼＆Young的）13,14。
最近，一种广谱头孢菌素，头孢哌酮，饮用水中的给定的5天或10天重复地呈现小鼠易感CDI 15。由于第三代头孢菌素的管理都与人类的CDI的风险增加，使用头孢哌酮模型更准确地反映自然发生的疾病16。头孢哌酮治疗小鼠容易艰难梭菌受到挑战既艰难梭菌芽孢和范围在临床多种菌株的营养细胞相关性和毒力17。尽管出现了一些利用难辨营养细胞的感染形式的原始研究， 艰难梭菌芽孢被认为是传动装置18的主要方式。
在过去十年中， 艰难梭菌 R20291，一个NAP1 / BI / 027株，已经出现，造成CDI 19,20流行。我们试图确定疾病的临床过程时头孢哌酮处理的小鼠用临床相关和基因-易于处理艰难梭菌菌株，R20291挑战。该协议细节的临床过程，包括体重减轻，细菌定植，毒素的细胞毒性，并与艰难梭菌 R20291孢子攻击的小鼠的胃肠道组织病理学变化。总体而言，这种小鼠模型被证明是CDI近似人类疾病的宝贵的实验平台。此其特征小鼠模型因此可用于评估的影响对临床疾病的改善和关于对艰难梭菌定植抗力的恢复新颖治疗剂。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
伦理声明：
机构的动物护理和使用委员会（IACUC）的兽医北卡罗莱纳州立大学（NCSU）批准了这项研究。北卡罗莱纳州立大学的动物护理和使用政策适用于在北卡罗莱纳州立大学的1985年实验动物设施动物福利法与健康研究扩展法案规定的标准和准则，坚持以指南为照顾和实验动物使用中规定的准则。动物的健康状态，每天进行评估和垂死的动物被人道地用CO 2窒息，再进行二次措施实施安乐死。训练有素的动物技术人员或兽医在本研究中进行畜牧业在AAALAC认证的设施。
1.饮用水管理的抗生素头孢哌酮，实现敏感性艰难梭菌定植与疾病
注意：5至8周龄的C57BL / 6野生型小鼠（雌性和雄性）在开始抗生素水施用前被购买和隔离1周。检疫之后，小鼠被安置与蒸压食品，床上用品和水。笼变化在层流罩中进行由实验室工作人员每周。
- 在无菌蒸馏水中挑战的目标天（ 图1）之前，至7天制备头孢哌酮（0.5毫克/毫升）。
- 装满水头孢哌酮蒸压水瓶（0.5毫克/毫升），并放置在每个鼠笼。
注：新鲜制备的头孢哌酮水应在5天的时间进行，并变出每2天，如在步骤1.1和1.2表示。建议适当处置以下的机构环境，健康和安全准则头孢哌酮水。 - 后头孢哌酮水5天，用高压灭菌水瓶充满无菌蒸馏水更换瓶。给予小鼠本饮用水在实验的持续时间。
2. 艰难梭菌孢子接种的制备及小鼠口服灌胃
注：在开始之前，确保以下物品被放置在厌氧室中至少24小时：1×磷酸盐缓冲盐水（PBS;参见材料），牛磺胆环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂（TCCFA）板（参见材料和辅助文件），和无菌L形吊具。
注：与艰难梭菌芽孢攻击小鼠应在二级生物安全水平动物设施被安置。
- 得到所需的应变（在这种情况下，R20291），该先前制备并贮存在4℃下在无菌水中21,22的艰难梭菌芽孢的库存。事先确定此孢子股票的枚举使用。
- 基于已知浓度的孢子股票的（孢子/ ml），计算所期望的稀释到每25微升得到10 5孢子。确保接种量足以所有接种在小鼠实验中（每只小鼠25微升），进行接种枚举（约30微升），并考虑到移液错误。
- 涡原有的艰难梭菌芽孢的股票。然后，悬浮计算体积（来自步骤2.2）一个螺旋盖微量离心管内的无菌水原艰难梭菌芽孢的股票。在层流罩有氧执行此。标识该稀释的混合物作为“孢子接种物”。
- 放置孢子接种到65℃水浴中并加热它为20分钟。
注意：此步骤将确保只有有源艰难梭菌芽孢保持热处理后。 - 在层流罩，取50微升加热孢子接种，将其放置在无菌的离心管中，并把它传递到厌氧室23。使用这个样本孢子枚举。
- 在层流罩，装载其余热孢子接种INTOA 1-ml注射器附连到无菌的灯泡尖灌胃针。利用手动注射器步进，以确保准确和快速重复小鼠之间的剂量。确保灌胃针填充有在使用之前被加热的孢子接种物。
注：一个新的无菌灌胃针每只小鼠是不需要的。然而，如果各种剂量艰难梭菌芽孢的给药，一个新的管饲针建议每次剂量。
注： 艰难梭菌芽孢是对传统消毒剂高度耐药。因此，使用一杀孢子消毒剂，如＃62 Perisept杀芽孢消毒剂，是必要的。厂家建议2分钟的接触时间摧毁艰难梭菌芽孢。 - 灌胃小鼠各25微升孢子接种。由颈部松弛皮肤和背面，以便固定头部抓动物轻轻抑制各小鼠。用食指进一步固定动物的头部和细长食道。确保动物不发声或约束时显示的苦恼等体征。
注：灌胃小鼠的总体积不应超过10毫升/公斤体重（0.1毫升/ 10克）。 - 保持在直立，垂直位置鼠标和灌胃针轻轻通入口的侧面。直接灌胃针沿口的屋顶和灌胃针缓慢前进到食道。
注意：如果遇到任何阻力，灌胃针可进入气管，因此不应该先进，而是取出并立即重新定位。 - 灌胃针是约一半进入食道后，注入25微升加热孢子接种并轻轻撤出从食道的灌胃针。
注：灌胃针的坚强进步可能导致食道或胃的破裂。因此，如果电阻推进灌胃针时遇到，最好立即删除，并重新定位灌胃针。 - 返回动物笼子，观察它的任何咳嗽或呼吸困难的症状，因为这可能表明无意气管管理或加热孢子接种的愿望。
注：小鼠有以下抗生素治疗极易患上难辨 ;因此，预防措施，以防止交叉污染的笼子是必不可少的。管理抗生素治疗，但受到挑战的小鼠作为对照组时，这是特别重要的。 - 接种所有小鼠后，将剩余的热孢子接种到无菌的离心管中，并把它传递到孢子枚举厌氧室。
- 用于加热的孢子接种物的枚举（来自步骤2.4），剩余的管饲加热孢子接种物，使在1×PBS中的每个接种物的1:10系列稀释。它建议，使和板4 - 5稀释液（ 即，10 -1通过10 -5）。
- 使用无菌技术，转移100微升每个串行稀释到个人TCCFA板。
- 使用无菌L形吊具，均匀地分布施加到整个板的培养基中的稀释液。即使在稀释接种物的扩频为孢子的准确枚举必不可少的。
- 孵育所述板厌氧24小时，在37℃。 24小时后， 艰难梭菌菌落形成单位（CFU的）可以举出以获得在25微升（0.025毫升）体积施用于小鼠感染剂量（参见补充文件“实施例计算”）。 难辨梭状芽孢杆菌菌落平坦，淡黄色，并有不规则的边缘和毛玻璃外观24。
注：检测细菌计数限为10 CFU 2。
疾病3.监测老鼠体重减轻和临床症状整个艰难梭菌感染
- 权衡之前和5天头孢哌酮抗生素治疗后nimals，为期2天的恢复关闭的抗生素（0天）后，然后在实验的持续时间。
注：每天在一个一致的时间获得的权重。权重得到的挑战（第0天）一天应作为初始基准重量为整个艰难梭菌感染的比较。 - 将数字刻度成生物安全柜。放置一个无菌塑料烧杯上的规模和去皮塑料烧杯的重量。然后，轻轻的尾巴的基部拿起小鼠，并将其放置到塑料烧杯中。
- 放置烧杯背面上的刻度。将鼠标悬停一拱手烧杯的顶部，以确保鼠标没有逃脱。它可能需要2 - 3秒以获得稳定的重量。然后，鼠标轻轻放回笼子里。记录这个重量，重复该过程在笼子里每只小鼠。
注：当务之急是采取预防措施，以防止交叉contamina获得权重的笼之间的重刑。小鼠每笼应该有称量其自己的塑料烧杯中。塑料烧杯每次使用之间的杀孢子剂进行消毒，并盖上无菌铝箔。
- 放置烧杯背面上的刻度。将鼠标悬停一拱手烧杯的顶部，以确保鼠标没有逃脱。它可能需要2 - 3秒以获得稳定的重量。然后，鼠标轻轻放回笼子里。记录这个重量，重复该过程在笼子里每只小鼠。
- 每日两次（至少）为临床上严重的艰难梭菌感染的迹象，包括嗜睡，食欲不振，腹泻等，以及弯腰驼背的姿势监视攻击的动物。
- 入道安乐死即失去其初始基线体重的20％的动物和/或开发艰难梭菌感染（在步骤3.3中列出）的严重临床症状。
注：在实验期间根据需要，以确保它们没有失去其初始基线体重的20％的小鼠显示艰难梭菌感染的临床体征应进行权衡。在实验中早期时间点，这可能意味着每日两次测量。
4. 难辨梭状芽孢杆菌细菌计数从小鼠粪便和盲肠内容
注：在开始之前，确保以下物品被放入厌氧室中至少24小时：1×PBS中（参见材料），TCCFA板（参见材料），无菌L形吊具，和无菌的离心管和/或PCR板进行稀释。
- 获取样本艰难梭菌枚举
注：在获得粪便或盲肠内容，称在分析大规模无菌离心管。记录在管的一侧的管的重量，四舍五入至小数点后四位（ 例如，0.9864克）。记这个重量的“重管”。收集每个样品应置于无菌，称重微量离心管。- 老鼠粪便收集无菌
- 由颈部松弛皮肤和背面，以便固定头部抓动物轻轻抑制各小鼠。用小指轻轻抑制动物的尾巴，THUS露出肛门。确保动物不发声或约束时显示的苦恼等体征。
- 保持无菌的，称重的离心管直属动物的肛门。当务之急是管不来与老鼠的直接接触。
- 当动物排便，收集粪便颗粒进入管。保持所述管在室温下，直到所有的粪便样品被收集。它可能需要几分钟的鼠标排便，因此需要重复尝试收集粪便。
- 称量载有分析天平屎管。记录该管重量，四舍五入至小数点后四位（ 例如，1.0021克）。表示获得的重量为“最后的管的重量。”
- 粪便收集后直接传递粪便标本进入厌氧培养室进行细菌计数。
- 鼠标盲肠内容无菌收集在尸检时
- 通过CO 2窒息，再进行二次措施人性化的安乐死后，进行尸检，以获得盲肠25。盲肠是胃肠道的大，逗号形截面。
- 放置在盲肠上无菌塑料培养皿。使用一次性的，无菌无。 10手术刀刀片切割盲肠开放从袋的封闭端，以暴露盲肠内容物。
- 轻轻轻微用力用手术刀刀片和席卷向盲肠切开部分内容解压盲肠内容物。
注：应注意不要扰乱盲肠组织，这将进行组织病理学检查提交。
- 轻轻轻微用力用手术刀刀片和席卷向盲肠切开部分内容解压盲肠内容物。
- 放置盲肠内容到立即收集下列无菌的，称重微量离心管。只有大约10盲肠内容毫克所需的细菌枚举。
- 称量含在分析财政盲肠内容管即记录该管重量，四舍五入至小数点后四位（ 例如，1.0021克）。表示获得的重量为“最后的管的重量。”
- 通过盲肠内容样本进入厌氧培养室进行细菌计数。
- 老鼠粪便收集无菌
- 艰难梭菌的细菌计数
- 计算的将要列举的艰难梭菌的内容（粪便或盲肠）最终重量。从减去“总决赛管重量”执行该“管的重量。”
- 计算1:10稀释的内容到1X PBS中，并相应地重悬。对粪粒，用吸移管的尖端，以沉淀轻轻打乱成溶液（参见补充文件“实施例计算”）。
- 厌氧孵育在室温下这些悬浮的样品30分钟，使内容沉降。
- 使系列稀释于1×PBS中每个样品枚举每克含量（粪便或盲肠）的CFU的累加器。厌氧执行此。
- 使用无菌技术，转100每微升连续稀释至TCCFA板。使用无菌L形吊具，散布施加到介质稀释横跨板均匀分布的。即使在稀释的扩展是用于菌落精确计数是必不可少的。
- 孵育所述板厌氧24小时，在37℃。此时，枚举梭状菌落，以获得每克含量（粪便或盲肠）的CFU。 难辨梭状芽孢杆菌菌落平坦，淡黄色，并有不规则的边缘和毛玻璃外观24。
注意：此协议可用于从其它鼠胃肠内容，包括回肠和结肠内容列举艰难梭菌 。 PCR板可用于制造连续稀释。
5.细胞的Vero细胞毒性检测量化艰难梭菌毒素Cytotoxi市
注：建议该测定的小鼠模型上在尸检收集并储存在-80℃下的样品完成之后进行。无菌细胞培养技术是本测定期间防止Vero细胞的污染是必不可少的。该协议需要2天进行。所有粪便和在该试验中使用的肠内容必须存储在一个称重，无菌的离心管（与表示为“管的重量，”见上部分）。最终的管重量（包括内容）经由分析规模到最近的四个小数位测定（参见上文部分）。一个多通道移液器，建议使用用于该测定。
注：在开始之前，请确保以下项目可用：Vero细胞，贝科的10％热灭活胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素媒体（表示为“DMEM 1X Eagle培养基（DMEM）1X修改媒体;“见材料和辅助文件），0.25％胰蛋白酶-EDTA，1×PBS中，0.4％台盼蓝，在96孔细胞培养平底板，96孔过滤板， 艰难梭菌毒素A（等分试样在3微升1微克/微升的超纯水和存储在-80℃下）， 艰难梭菌抗毒素，一个工作表（用于计算和板地图;见补充文件）。
注：应注意这个实验人员暴露于艰难梭菌及其毒素期间进行。
- 拆分Vero细胞（1天）
- 预热的DMEM 1x介质，0.25％胰蛋白酶-EDTA，和1x PBS在37℃水浴中。
- 从细胞培养培养箱中（37℃和5％的CO 2）获得的Vero细胞的烧瓶中，并放置在无菌的细胞培养层流罩。使用70％的乙醇擦拭下来使用前罩和设备。使用血清学吸管，从组织培养瓶中吸媒体从Vero细胞取出，并并弃置于废Çontainer。
- 冲洗Vero细胞用5毫升1×PBS中的（预热）在组织培养烧瓶中。吸出PBS并丢弃到废物容器中。
- 5毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA的添加到组织培养烧瓶中。允许2的接触时间 - 3分钟。在此期间，观察细胞开始脱落烧瓶表面。轻轻摇动组织培养瓶一边到另一边松开Vero细胞。
- 后接触时间胰蛋白酶-EDTA，立即加5的10ml DMEM 1x介质的进入组织培养烧瓶中。这将中和胰蛋白酶-EDTA。使用此溶液轻轻洗任何未附着的Vero细胞离烧瓶的背面。然后，使用血清吸管向此混合物转移到15毫升锥形管中。
- 离心在锥形管中的Vero细胞在180 xg离心5分钟和25℃。确保离心机是适当的平衡。离心后，在锥形管的底部观察的Vero细胞的可见颗粒。要小心，不要DISRUPT此沉淀。吸掉从锥形管的上清液并丢弃。
- 悬浮Vero细胞在3毫升的DMEM 1X媒体。
- 计数的Vero细胞
- 加入100μl的Vero细胞悬液（步骤5.1.7制造）的100微升0.4％台盼蓝的。轻轻地上下吹打混合溶液。
- 添加10微升该混合物到血球的各腔室。
- 计数活细胞的血细胞计数仪的四个象限内的数目。死Vero细胞会占用台盼蓝，因而将被染成蓝色（这些细胞不应该被计算在内）。在记录这些数字“的Vero细胞表”提供。
- 综上所述活Vero细胞中的所有四个象限的总数目，并计算平均值。乘以稀释因子，其值为2，因为将100μl细胞是在共200微升的液体。
- 由校正系数相乘，得到“细胞数/ ml的“当使用血细胞计数器中，校正因子是总是10 4由总体积以得到正片。”细胞总数“。
- 确定井必需的数量为每个实验
注：单一样本（或粪便或肠内容物）需要一式两份，进行24个独立的井。每孔10 5个 Vero细胞的浓度（90微升总体积）是必需的。
注意：如果一个人希望孵育Vero细胞的96孔板在37℃下，每孔10 3 Vero细胞的浓度过夜，建议考虑延长的温育时间。维拉的工作表单元格内的计算需要进行调整以适应这种变化。- 确定可以基于可用的Vero细胞的量使用井的数量（来自步骤5.2;使用的Vero细胞表，提供）。
- 确定的体积需要填充所需井的数量Vero细胞悬浮液（基于样品的数量被测试）。确保任何额外的容量在增加以弥补移液错误（使用所提供的Vero细胞表）。
- 稀释在DMEM 1x介质的Vero细胞悬浮液（步骤5.1.7获得）以获得用于实验所需的体积。
- 播种Vero细胞到96孔细胞培养板
- 从步骤5.3.2使用Vero细胞重悬浮，使用多通道移液器以90微升Vero细胞悬浮液添加到96孔细胞培养平底板的每个孔中。
- 孵育的Vero细胞在细胞培养孵化该板在37℃和5％CO 2的加入毒素（样本）至孔之前至少4小时的。此温育时间将允许Vero细胞附着到每个孔的底部。
- 创建从样品股票解决方案（或粪便肠内容物）
注：所有的样品应该有“重管”和“最后的管重量”通过分析量表测量。用于计算的Vero细胞表。- 计算的内容物的重量。转换克至毫克，然后毫克至微升。计算作1:10稀释在1×PBS中所需的溶液微升的最终总数量。计算1×PBS中的总量可添加到样品中。
- 1×PBS中（如上计算）的总体积加至样品。有氧执行此，并使用无菌技术。对粪粒，使用吸管尖轻轻扰乱小球在溶液中。
- 涡样品，然后在3522 xg离心离心它们在室温下5分钟。确保离心机是适当的平衡。要小心，不要破坏颗粒和悬浮样品成溶液。
注：在步骤5.5.3，如果只有几个样品被处理，内容可以通过灭菌并使它们通过一个单一的0.22μm的过滤器，而不是使用96孔过滤板的。一些样品可能需要多个过滤器，以消毒使用这种技术的全部体积的内容。 - 通过取150微升上清液，将其放置到单独的孔中在96孔过滤板消毒样品/ PBS混合物。放置过滤板牢固地在96孔细胞培养平底板的顶部，使得内容将过滤到该板。
- 离心过滤板/细胞培养板堆在431 xg离心在室温下5分钟。确保该离心机是适当的平衡，并且过滤板/细胞培养板堆被紧密对准并且离心分离过程中不会移动。
注：这些过滤内容，将在稀释板被利用的10 -1库存。 - 放置板用过滤的样品在冰上。
- 创建稀释板＃1
注：中国人民解放军稀释TE＃1（DP＃1）将要求每个样品6口井，包括正面（ 艰难梭菌毒素A）和阴性（1X PBS）控件（参见上的Vero细胞表的DP＃1布局）。- 为了制备用于该测定法的阳性对照（ 艰难梭菌毒素A），得到-80℃的3微升等分试样（1微克/微升），并添加297微升的超纯水，得到0.01微克/微升的最终浓度。广场上冰。
- 与他们的稀释液（10 -1〜10 -6）每个样品标记的孔，并指明阳性和阴性对照（参见DP＃1的布局）。
- 加1×PBS中的合适的量向每孔中。在10 -1井，增加NO PBS。为10 -2至10 -6井，添加90微升1×PBS中。
- 加样品的适当的量向每孔中。在10 -1井，加100微升10 -1股，用于每个样品（请参阅从过滤器开发平台5.5.7步E）。为10 -2至10 -6井，使连续稀释;通过从10 -1以及采取10微升和它添加到10 -2井开始。继续连续稀释到10 -6稀释度。
- 覆盖DP＃1板用透明胶的粘接密封，将它放在冰上。
- 创建稀释板＃2
注：稀释板（DP＃2）将需要2个车道6口井的每个样本，包括阳性和阴性对照（请参见Vero传代细胞表的DP＃2布局）。- 与他们的稀释液（10 -1〜10 -6）每个样品标记的孔，并指明阳性和阴性对照（见DP＃2的布局）。标记与样品名称（表示为“样品井”）或与抗毒素的样品名称（表示为“抗毒素孔”）的孔中。
- 计算抗毒素的该测定所需的量。注：抗毒素是25倍的股票的解决方案，需要在1×PBS中稀释1:25。广场上冰准备抗毒素1X解决方案。
- 为“样品井，”添加20微升1×PBS中，以每个孔用于该样本的所有稀释液（10 -1至10 -6）。为“抗毒素井，”添加20微升1×抗毒素的到各孔中该样本的所有稀释液（10 -1至10 6个 ）。
- 转让20微升的稀释样品的井DP从1号到指定孔的DP＃2行1 - 6和行7 - 12（请参见Vero传代细胞表的DP＃2布局）。吹打向上和向下轻轻搅拌溶解。
- 盖DP＃2用透明胶的粘接密封，并允许在室温下40分钟孵育。该温育是允许抗毒素结合并因此灭活且中和的艰难梭菌毒素。
- 孵化后，从DP＃2加入10微升混合到适当的Vero细胞孔中（请参见伏的Vero细胞板布局ERO细胞表）。轻轻混匀通过上下吹打，注意不要破坏被附着到孔的底面的Vero细胞的溶液。
- 过夜孵育Vero细胞板在细胞培养培养箱中于37℃和5％的CO 2。
- 评估使用光学显微镜对舍入Vero细胞（第2天）
注：回想一下，通过10倍稀释因子变化添加样品的混合物到Vero细胞板时（ 例如，10 -3现在是10 -4）。具有抗毒素目前富国应该有很少或几乎没有Vero细胞四舍五入指出。 Vero细胞四舍五入（细胞毒性）将含有艰难梭菌毒素样品中注明。如果细胞毒活性在含有样品和抗毒素稀释中和，产生的Vero细胞的细胞毒性的艰难梭菌毒素的存在被确认。- 使用二极管灯检查Vero细胞四舍五入在200倍的显微镜牛逼。对于样品孔（包括阳性对照），记录这是最后有80％的Vero细胞四舍五入指出，良好的稀释。
- 计算出的细胞毒性效价，这被定义为产生的每克样品的80％的Vero细胞变圆的最高稀释度的倒数。例如，如果最高稀释度为10 -5，则稀释因子将是10 -6对于该样本。因此，日志[最终稀释因子] /样品克将被记录[106]，它产生的6倒数滴度。
注：Vero细胞需要经历至少3 - 4通道和不超过30代之前将其用在该测定26。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
期间的代表性研究中，5周龄的C57BL / 6野生型小鼠用头孢哌酮在其饮用水中（0.5毫克/毫升）预处理5天，并允许一个2天的洗出与普通的饮用水。小鼠用经由在第0天（ 图1A）口服强饲法10 5孢子梭状 R20291的挑战。小鼠14天的CDI体重减轻和临床症状（嗜睡，食欲不振，腹泻，和驼背姿势）进行了监测。 C57BL / 6 WT小鼠艰难梭菌 R20291孢子的挑战导致腹泻24小时，并于48小时后的挑战（ 图1B）显著体重减轻内。虽然在本实验中没有观察到，与较高剂量梭状 R20291的攻击的小鼠可以成为严重患病或有由48大于20％的重量损失- 72小时后的挑战，因此需要人道的安乐死。因此，将小鼠要求最低每日两次的与艰难梭菌芽孢的挑战后的监测。
在该代表性研究中，体重损失和疾病的小鼠的临床症状的一个显著量天也观察到2 - 7攻击后（ 图1B）。在后7天的挑战，老鼠开始发胖，并且疾病的临床症状消退。由上周实验中，小鼠出现临床上正常，没有任何的CDI的临床症状，包括腹泻证据。
粪粒用艰难梭菌芽孢的挑战和每48小时攻击后（ 图1C）之前收集。之前的抗生素治疗，小鼠不与艰难梭菌定植。在24小时后的挑战与艰难梭菌芽孢，小鼠用每克10 7 CFU的艰难梭菌的粪便（ 图1C <定植/ STRONG>）。小鼠仍然坚持与C整个实验难辨殖民统治，尽管在过去的7天实验没有体重减轻或CDI的临床症状的证据。
图1： 艰难梭菌 R20291展览减肥挑战， 艰难梭菌是被殖民头孢哌酮治疗小鼠。 A）5周龄C57BL / 6 WT JAX小鼠（n = 3M /每组3F）用头孢哌酮预处理在他们的饮用水（0.5毫克/毫升），5天，并允许2天洗出与经常饮用水。小鼠通过在第0天的小鼠为14天的CDI体重减轻和临床症状（嗜睡，食欲不振，腹泻，和驼背姿势）进行了监测口服强饲法10 5个孢子梭状 R20291的挑战。粪便中头孢哌酮开始之前收集和使用细菌计数，立即AFTEř完成抗生素，和第0天，1，2，3，4，5，7，9，11，13，和14在整个感染。尸检第0天，第2，第4，第7进行，14 B）的小鼠艰难梭菌 R20291挑战后失去其基线体重的显著量。小鼠的平均体重在相对于0天，基线重量时至7每天测量从第0天显着重量损失看到的天2。在激发后粪便C） 梭状 R20291细菌负荷。内与艰难梭菌芽孢的挑战后24小时，所有小鼠用每克粪便的10 7 CFU的（菌落形成单位）定植。这些参数没有显著差异，看到女性和男性之间。显着性通过非参数Kruskal-Wallis单因素方差分析测试随后唐恩的后测（测定*， 第 ≤0.05; **，P≤0.01; ***，P≤0.001; ****， 第 请点击此处查看该图的放大版本。
四只老鼠（2男2女）被安乐死和尸检感染前准备第0天，作为未感染的对照。另外，从每笼一只小鼠被处以人道的安乐死，并在天2，4，7剖检制备和14攻击后（ 图1A）。 C.盲肠内容内艰难枚举在每个尸检进行。在粪便枚举一致性，在小鼠的前与艰难梭菌的挑战盲肠内容没有检测艰难梭菌 。在48小时后的挑战，小鼠用每克盲肠内容约10 8 CFU的艰难梭菌的定植（ 图2A）。所有小鼠仍然坚持在整个实验定植。
盲肠内容还评估在整个感染使用Vero细胞毒性测定艰难梭菌毒素的存在。在之前的挑战（ 图2B）盲肠内容物中检测艰难梭菌毒素的细胞毒性的证据。检测艰难梭菌芽孢的挑战后第2天的艰难梭菌细胞毒性并持续整个感染。尽管相当均匀定植艰难梭菌 ， 艰难梭菌细胞毒性活性的水平的变化是在个体小鼠（ 图2B）明显的。
大部分的Vero细胞毒性试验中艰难梭菌抗毒素中和鼠标盲肠内容和无细胞毒性的证据（维罗CELL中进行的稀释四舍五入）。然而，一些个体小鼠，尽管重新测试，有50个的证据-在10 -1稀释液（稀释，其中所述样品是最浓的）100％的细胞毒性，没有Vero细胞中的其它稀释液四舍五入的证据。在该测定中使用的抗毒素是中和多克隆抗体艰难梭菌毒素，山羊27制备。因此，该抗毒素可能不中和是受应变R20291产生的艰难梭菌二元毒素。然而， 艰难梭菌二元毒素不被认为是细胞毒性的10。过度艰难梭菌毒素无法由抗毒素或大于艰难梭菌毒素可有助于这一发现其他另一细胞毒性剂的存在下中和。这个观察没有影响的细胞毒性效价为这些样品的测定中，由于各样品的最后稀释的80％的Vero细胞变圆了无细胞毒性的证据时在指定的稀释抗毒素相结合。
图2：用C感染时盲肠和细胞毒性的殖民化。难辨 R20291。 A）小鼠CECA仍坚持与C整个实验难辨殖民地，尽管临床症状分辨率和观察到的体重增加。当第2天攻击后评估所有小鼠用每克盲肠内容物大于10 8 CFU的定植。 B）从用C整个感染盲肠内容Vero细胞毒性检测。难辨 R20291。以下与艰难梭菌芽孢的挑战，小鼠的细胞毒性的显著水平，如在每克天2,4盲肠内容毒素的日志10倒数稀释测定，7攻击后，相对于0天（中位数represente由线D）。 **， 第 ≤0.01; ***，P≤0.001; ****， 第 ≤0.0001意义是由非参数Kruskal-Wallis单因素方差分析测试随后唐恩的后测（*，P≤0.05测定）。误差棒代表与平均值的标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
建议在组织学评价通过以盲方式委员会认证的兽医病理学家进行。用于组织得分，一个0-4的数值评分系统应采用分别评估在回肠，盲肠，并且基于先前发布的得分方案17结肠水肿，炎性细胞浸润，和上皮细胞的损伤。
失明后病理检查艰难梭菌 R20291鼠回肠，盲肠以及结肠以下挑战的萌发的，最显著病理变化在盲肠（ 图3）进行说明。总的盲肠组织学评分分别为第0天和天2和4攻击后之间显著不同。无显著病变整个感染回肠（ 图3）进行说明。温和的病变结肠指出。总结肠组织学评分分别为0天和天2和7攻击后（ 图3）之间的显著不同。
在整个感染回肠，盲肠和结肠的代表性H＆E部分是在图4中可用的每一个图像具有其各自的总的组织学分数和个人得分为上皮损伤，炎症，水肿，如由盲板认证的兽医病理学家确定（ SAM）。
图3：鼠回肠，盲肠的组织学计分，并且结肠用C感染期间。难辨 R20291。上皮损伤，炎症和水肿：总的组织学分数通过加入从评估的参数的所有三个得分来计算。无显著组织病理学改变遍布感染回肠指出。盲肠组织CDI中所含的最显著组织学病变。总的盲肠组织学评分分别从天2和4攻击后0天显著不同。温和的病变结肠指出。总的结肠组织学评分均来自天2和7后的挑战0天显著不同。显着性通过非参数Kruskal-Wallis单因素方差分析测试随后唐恩的后测（测定*， 第 ≤0.05; **，P≤0.01; ***，P804; 0.001; ****，P≤0.0001）。误差棒代表与平均值的标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：组织病理学在与肝炎感染。难辨 R20291。此面板包含回肠，盲肠和结肠的代表性H＆E切片整个感染艰难梭菌 R20291。总的组织学分数在圆括号（）为相应的日期和列出组织：为0的回肠天（0），2天（1），4天（0），7天（0），第14天（0） ;为0盲肠天（0），2天（5），4天（4），7天（3）和14天（3）;和0结肠天（0），2天（4），4天（1），7天（4），第14天（2）。在光显微镜获得的显微照片Ë一颗500万像素的数码相机及其配套软件（比例尺代表200微米）。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
| 0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 1 ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
| 96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
| 96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
| Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
| Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
| Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
| D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Distilled Water | Gibco | 15230 | |
| DMEM 1x Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
| NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
| PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
| Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
| Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
| Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
| Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5 - 8 weeks of age |
| Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
| DP27 camera | Olympus Life Science | ||
| cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
References
- Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
- Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
- Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
- Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
- Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
- Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
- Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
- Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
- Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
- Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
- Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
- Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
- He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787 (2013).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).
- Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).
- Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
- Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
- Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
- Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
- Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
- Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).
