Summary
Denne protokol beskriver cefoperazon musemodel for Clostridium difficile infektion (CDI) ved anvendelse af en klinisk relevant og genetisk-tractable stamme, R20291. Fokus på klinisk sygdom overvågning, C. difficile bakteriel optælling, toksin cytotoksicitet, og histopatologiske ændringer i hele CDI i en musemodel er beskrevet i protokollen.
Introduction
Clostridium difficile er en anaerob, grampositiv, sporedannende bacillus, der forårsager livstruende diarré 1. C. difficile infektion (CDI) er forbundet med øget menneskelig sygelighed og dødelighed og resulterer i over $ 4.8 milliarder i udgifter til sundhedsvæsenet om året 1-4. I 2013, Centers for Disease Control og Forebyggelse kategoriseret C. difficile som et presserende antibiotikaresistens risiko, hvilket indikerer, at det udgør et presserende trussel mod den offentlige sundhed en. I øjeblikket er antibiotisk behandling med vancomycin og metronidazol overvejet standard for pleje af CDI 5. Desværre fornyet CDI efter vellykket behandling med antibiotika er høj, forekommer i 20 - 30% af patienterne 2,5-7. Derfor er det nødvendigt opdagelsen af nye lægemidler mod denne enterisk patogen. For at evaluere terapeutiske midler mod C. difficile, en dyremodel tilnærme den humane sygdom i acDer er behov linically-relevant stamme.
Indledningsvis blev Kochs postulater fastsat for C. difficile i 1977 under anvendelse af en clindamycin-behandlede syriske hamster model 8. Denne model er stadig udnyttes i dag til at undersøge virkningerne af C. difficile-toksiner på patogenese 9,10. Imidlertid CDI i hamstermodellen resulterer i høj dødelighed og ikke indbyrdes kroniske snigende sygdomsmanifestationer, der kan ses hos mennesker med CDI 10,11. Baseret på tilgængelighed og reagens tilgængeligheden af murine platforme i forskning, en musemodel for CDI er relevant.
I 2008 blev en robust musemodel af CDI etableret ved at behandle mus med et antibiotikum cocktail i drikkevand (kanamycin, gentamicin, colistin, metronidazol, og vancomycin) i 3 dage efterfulgt af en intraperitoneal injektion af clindamycin 12. Dette gøres mus følsomme over for CDI og alvorlig colitis. Afhænge afgigt af inokulum dosis indgivet, kan en række kliniske symptomer og letalitet observeres ved hjælp af denne model. Siden den tid har forskellige antibiotiske regimener blevet undersøgt som ændrer murine tarmens mikrobiota, faldende kolonisering modstand mod det punkt, hvor C. difficile kan kolonisere mavetarmkanalen (gennemgået i Best et al. Og Lawley & Young) 13,14.
For nylig en bredspektret cephalosporin, cefoperazon, givet i drikkevandet i 5 eller 10 dage reproducerbart gør mus modtagelige for CDI 15. Da administration af tredje-generations cephalosporiner er forbundet med en øget risiko for CDI i mennesker, anvendelse af cefoperazon model mere præcist afspejler naturligt forekommende sygdom 16. Cefoperazon-behandlede mus modtagelige for C. difficile er blevet udfordret med både C. difficile sporer og vegetative celler af forskellige stammer, der spænder i kliniskrelevans og virulens 17. Trods nogle af de oprindelige forsøg med C. difficile vegetative celler som den smitsomme form er C. difficile sporer betragtet den store smittemåde 18.
I det sidste årti, C. difficile R20291, en NAP1 / BI / 027-stammen, er opstået, forårsager epidemier af CDI 19,20. Vi har forsøgt at bestemme kliniske forløb af sygdommen, når cefoperazon-behandlede mus blev udfordret med klinisk relevant og genetisk tractable C. difficile-stamme, R20291. Denne protokol beskriver det kliniske forløb, herunder vægttab, bakteriel kolonisering, toxin cytotoksicitet, og histopatologiske ændringer i mave-tarmkanalen hos mus udfordret med C. difficile R20291 sporer. Samlet set denne musemodel viser sig at være en værdifuld eksperimentel platform for CDI tilnærme sygdom hos mennesker. Denne kendetegnet musemodel kan således anvendes til at vurdere virkningerneaf hidtil ukendte terapeutiske midler på lindring af klinisk sygdom og om genoprettelse af kolonisering modstand mod C. difficile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk erklæring:
Den institutionelle Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) godkendte denne undersøgelse. Den NCSU Animal Care og Brug politik gælder standarder og retningslinjer, der er fastsat i dyreværnsloven og Health Research Udvidelse Act of 1985. forsøgsdyr faciliteter NCSU overholder retningslinjerne, som beskrevet i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Dyrenes sundhed status blev vurderet dagligt, og døende dyr blev humant aflivet ved CO 2 kvælning efterfulgt af sekundære foranstaltninger. Uddannede dyreteknikere eller en dyrlæge udført husdyrbrug i en AAALAC-akkrediteret facilitet i løbet af denne undersøgelse.
1. Administration af antibiotiske Cefoperazon i drikkevand at opnå Modtagelighed for C. difficile Colonization og Sygdom
NOTER: 5- til 8 uger gamle C57BL / 6 WT-mus (hunner og hanner)blev indkøbt og i karantæne i 1 uge før start antibiotikummet vand administration. Efter karantæne blev musene opstaldet med autoklaveret mad, sengetøj og vand. Cage ændringer blev udført ugentligt ved laboratoriepersonale i en laminar flow hætte.
- Forbered cefoperazon (0,5 mg / ml) i sterilt destilleret vand 7 dage før den målrettede dag challenge (figur 1).
- Fyld autoklaveres vandflasker med cefoperazon vand (0,5 mg / ml) og placere dem i hver mus bur.
BEMÆRK: Frisk forberedt cefoperazon vand bør gøres og ændres ud hver 2 dage i løbet af en periode på 5 dage, som angivet i trin 1.1 og 1.2. Korrekt bortskaffelse af cefoperazon vand efter institutionelle retningslinier miljø sundhed og sikkerhed anbefales. - Efter 5 dage på cefoperazon vand, udskifte flaskerne med autoklaverede vandflasker fyldt med sterilt destilleret vand. Giv mus denne drikkevand under hele forsøget.
2. Forberedelse af C. difficile Spore Inoculum og oral sonde af mus
BEMÆRK: Inden du begynder, skal du sikre, at følgende dele er placeret i den anaerobe kammer i mindst 24 timer: 1x phosphatpufret saltvand (PBS, se Materials), taurocholat cycloserin cefoxitin fruktose agar (TCCFA) plader (se Materialer og den supplerende fil ), og en steril L-formet spreder.
BEMÆRK: Mus udfordret med C. difficile sporer bør anbringes i en biosikkerhedsniveau 2 dyr facilitet.
- Opnå en C. difficile sporedannelse bestand af den ønskede stamme (i dette tilfælde, R20291), der blev fremstillet tidligere og opbevaret ved 4 ° C i sterilt vand 21,22. Bestem opregning af denne Spore lager før anvendelse.
- Baseret på den kendte koncentration (sporer / ml) af sporen materiel, beregne den ønskede fortynding til opnåelse 10 5 sporer per 25 pi. Sørg for inokulum volumen er tilstrækkelig til at pode allemus i eksperimentet (25 pi per mus), til at udføre tælling af podestoffet (ca. 30 pi), og for at svare pipetteringsfejl.
- Vortex den oprindelige C. difficile sporedannelse lager. Derefter resuspendere det beregnede volumen (fra trin 2.2) af den oprindelige C. difficile sporedannelse lager i sterilt vand i en med skruelåg mikrocentrifugerør. Udfør denne aerobt i en laminar flow hætte. Identificere denne fortyndede blanding som "sporen inokulum."
- Placer sporen inokulum til en 65 ° C vandbad og opvarme det til 20 min.
BEMÆRK: Dette trin vil sikre, at kun aktive C. difficile sporer tilbage efter varmebehandlingen. - Inden for laminar flow hætte, tage 50 pi opvarmet spore inokulum, placere den i et sterilt mikrocentrifugerør, og videregive det til det anaerobe kammer 23. Brug denne prøve til spore tælling.
- Inden for laminar flow hætte, indlæse resterende opvarmede spore inokulum intoa 1 ml sprøjte fastgjort til en steril kolbe-tippes mavesonde nål. Udnyt en manuel sprøjte stepper for at sikre præcis og hurtig gentagelse dosering mellem mus. Sikre, at gavagenål er fyldt med den opvarmede sporedannelse inokulum før anvendelse.
BEMÆRK: En ny steril gavagenål for hver mus er ikke påkrævet. Men hvis forskellige doser af C. difficile sporer administreres, anbefales til hver dosis, en ny gavagenål.
BEMÆRK: C. difficile sporer er meget modstandsdygtige over traditionelle desinfektionsmidler. Derfor er brugen af en sporedræbende desinfektionsmiddel, såsom # 62 Perisept Sporicidal Desinfektionsmiddel, er nødvendig. Producenten anbefaler en 2-minutters kontakttid for at ødelægge C. difficile sporer. - Sondeernæring hver mus med 25 pi sporen inokulum. Begrænse hver mus forsigtigt ved at gribe dyret ved den løse hud af halsen og tilbage for at immobilisere hovedet. Brug af pegefingeren yderligere immobilisere dyrets hoved oglangstrakt spiserøret. Sørg for, at dyret ikke vocalize eller vise andre tegn på lidelse under tilbageholdenhed.
BEMÆRK: Det samlede rumfang givet til mus med sonde bør ikke overstige 10 ml / kg legemsvægt (0,1 ml / 10 g). - Oprethold musen i en opretstående, lodret position og passere forsigtigt gavagenål ind i siden af munden. Ret gavagenål langs ganen og langsomt fremføre gavagenål i spiserøret.
BEMÆRK: Hvis der findes nogen modstand, den sonde nål kan komme ind i luftrøret og derfor bør IKKE avanceret, men snarere fjernes og flyttes straks. - Efter gavagenål er omtrent halvvejs ind i spiserøret, injicere 25 pi den opvarmede sporedannelse inokulum og forsigtigt trække gavagenål fra spiserøret.
BEMÆRK: En konsekvent fremføring af gavagenål kan føre til brud af spiserøret eller maven. Derfor, hvis modstand ved fremføring af gavagenål, Er det bedst at straks at fjerne og flytte sonde nål. - Retur dyret til sit bur og observere det for enhver hoste eller tegn på åndedrætsbesvær, da dette kan indikere utilsigtet trakeal administration eller aspiration af den opvarmede spore inokulum.
BEMÆRK: Mus er ekstremt modtagelige for C. difficile efter antibiotisk behandling; derfor, at forholdsregler undgå krydskontaminering mellem bure er afgørende. Dette er især vigtigt ved behandlingen antibiotika-behandlede men ubestridte mus som kontroller. - Efter podning alle mus, skal du placere den resterende opvarmede spore inokulum i en steril mikrocentrifugerør og videregive det til det anaerobe kammer til spore tælling.
- Til tælling af det opvarmede sporesuspension inokulum (fra trin 2.4) og den resterende tvangsfodret opvarmet sporedannelse inokulum, gøre 1:10 seriefortyndinger af hver inokulum i 1x PBS. Det anbefales at foretage og pladen 4 - 5 fortyndinger (dvs. 10 -1 til10 -5).
- Under anvendelse af aseptisk teknik overføre 100 ul af hver seriefortynding på en individuel TCCFA plade.
- Ved hjælp af en steril L-formet spreder, ligeligt fordelt fortyndingen anvendes til mediet hen over pladen. Jævn spredning af den fortyndede podestof er afgørende for nøjagtig tælling af sporer.
- Pladerne inkuberes anaerobt i 24 timer ved 37 ° C. Efter 24 timer, kan C. difficile kolonidannende enheder (CFU'er) opregnes for at opnå den infektive dosis administreret til mus i de 25 pi (0,025 ml) volumen (se supplerende fil "eksempel Beregninger"). C. difficile kolonier er flade og lysegule og har uregelmæssige kanter og en matteret glas udseende 24.
BEMÆRK: Detektionsgrænsen for bakteriel tælling er 10 2 CFU.
3. Overvågning Mouse Vægttab og kliniske tegn på sygdom i hele C. difficile infektion
- afvejes ennimals før og efter 5 dages cefoperazon antibiotikabehandling, efter 2-dages restitutionsperiode off af antibiotika (dag 0), og derefter under hele forsøget.
BEMÆRK: Få vægte på en konsekvent tidspunkt hver dag. Vægte opnåede dagen for udfordringen (dag 0) bør anvendes som det indledende basisniveau-vægt til sammenligning hele C. difficile infektion. - Placer en digital skala i et biosikkerhed skab. Anbring en steril plastbæger på vægten og tarere vægten af plastbæger. Derefter forsigtigt afhente musen ved haleroden og placere den ind i plastbæger.
- Anbring bægerglasset tilbage på skalaen. Hold markøren en hånd over toppen af bægeret for at sikre, at musen ikke undslippe. Det kan tage 2 - 3 i sek at opnå en stabil vægt. Derefter forsigtigt placere musen tilbage i sit bur. Optag denne vægt og gentag processen for hver mus i det bur.
BEMÆRK: Det er bydende nødvendigt, at der træffes forholdsregler for at undgå cross-kontamination mellem bure når at få vægte. Hvert bur af mus bør have sin egen plastbæger til vejning. De plast bægerglas skal desinficeres med en sporedræbende middel mellem hver brug og dækket med sterilt alufolie.
- Anbring bægerglasset tilbage på skalaen. Hold markøren en hånd over toppen af bægeret for at sikre, at musen ikke undslippe. Det kan tage 2 - 3 i sek at opnå en stabil vægt. Derefter forsigtigt placere musen tilbage i sit bur. Optag denne vægt og gentag processen for hver mus i det bur.
- Overvåg udfordrede dyr to gange dagligt (på et minimum) for tegn på klinisk-alvorlig C. difficile infektion, herunder sløvhed, tab af appetit, diarré, og foroverbøjet stilling.
- Humant aflive dyr, der mister 20% af deres oprindelige baseline kropsvægt og / eller udvikler alvorlige kliniske tegn på C. difficile infektion (anført i trin 3.3).
BEMÆRK: Mus, der viser kliniske tegn på C. difficile infektion bør vejes efter behov under forsøget på at sikre, at de ikke har mistet 20% af deres oprindelige baseline kropsvægt. Under tidlige tidspunkter i forsøget, dette kan betyde to gange daglige målinger.
4. Bakteriel Tælling af C. difficilefra musen feces og coecumindhold
BEMÆRK: Inden du begynder, skal du sikre, at følgende dele er placeret i det anaerobe kammer i mindst 24 timer: 1x PBS (se Materialer), TCCFA plader (se Materialer), en steril L-formet spreder, og sterile mikrocentrifugerør og / eller PCR-plader for fortyndinger.
- Indhentning Prøver for C. difficile Tælling
BEMÆRK: Før opnå afføring eller coecumindhold, vejer sterile mikrocentrifugerør på et analytisk skala. Optage røret vægt på den side af røret, afrunding til fire decimaler (f.eks 0,9864 g). Betegne denne vægt som "rør vægt." Hver udtagne prøve skal placeres i en steril, vejet mikrocentrifugerør.- Steril samling af musen feces
- begrænse forsigtigt hver mus ved at tage fat dyret ved den løse hud på halsen og tilbage for at immobilisere hovedet. Brug pinky finger til forsigtigt begrænse dyrets hale, thus eksponere anus. Sørg for, at dyret ikke vocalize eller vise andre tegn på lidelse under tilbageholdenhed.
- Hold en steril, vejet mikrocentrifugerør direkte under dyrets anus. Det er bydende nødvendigt, at røret ikke kommer i direkte kontakt med musen.
- Som dyret defecates, indsamle det fækale pellet ind i røret. Hold røret ved stuetemperatur, indtil alle fækale prøver opsamles. Det kan tage flere minutter for en mus til at defecate, hvilket nødvendiggør gentagne forsøg på at indsamle afføring.
- Afvej rørene indeholdende feces på analytiske skala. Optag røret vægt, afrunding til fire decimaler (f.eks 1,0021 g). Betegne den opnåede vægt som den "endelige rør vægt."
- Pass de fækale prøver i det anaerobe kammer for bakteriel tælling direkte efter afføring kollektion.
- Steril samling af muse coecumindhold på tidspunktet for obduktion
- Efter human dødshjælp af CO 2 kvælning efterfulgt af sekundære foranstaltninger, udføre en obduktion for at få coecum 25. Coecum er den store, komma-formet sektion af mavetarmkanalen.
- Placer coecum på en steril plastik petriskål. Brug en engangs, steril no. 10 skalpelblad at skære coecum åben fra den blinde ende af posen for at blotlægge de coecumindhold.
- Forsigtigt udpakke coecumindhold ved at anvende et let tryk med skalpelblad og fejer indholdet mod den indridset del af coecum.
BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for ikke at forstyrre den cecal væv, som vil blive forelagt til histopatologisk undersøgelse.
- Forsigtigt udpakke coecumindhold ved at anvende et let tryk med skalpelblad og fejer indholdet mod den indridset del af coecum.
- Placer coecumindhold i en steril, vejet mikrocentrifugerør umiddelbart efter indsamlingen. Kun omkring 10 mg coecumindhold er påkrævet for bakteriel tælling.
- Afveje rør indeholdende coecumindhold på den analytiske scale. Optag røret vægt, afrunding til fire decimaler (f.eks 1,0021 g). Betegne den opnåede vægt som den "endelige rør vægt."
- Passere coecumindhold prøver til det anaerobe kammer for bakteriel tælling.
- Steril samling af musen feces
- Bakteriel Tælling af C. difficile
- Beregn slutvægt indholdet (afføring eller cecale), som vil blive opregnet for C. difficile. Udføres dette ved at trække den "endelige rør vægt" fra "røret vægt."
- Beregne en 1:10 fortynding af indholdet i 1X PBS og resuspenderes i overensstemmelse hermed. For fækalpellets, bruge spidsen af pipetten til forsigtigt forstyrre pillen i opløsning (se supplerende fil "eksempel Beregninger").
- Anaerobt inkubere disse resuspenderede prøver ved stuetemperatur i 30 minutter, lader indholdet bundfælde.
- Foretag serielle fortyndinger for hver prøve i 1x PBS til enumbejde af CFU pr g indhold (afføring eller cecal). Udfør denne anaerobt.
- Under anvendelse af aseptisk teknik overføre 100 ul af hver seriefortynding til TCCFA plader. Ved hjælp af en steril L-formet spreder, sprede fortyndingen anvendes til medierne til fordel den jævnt hen over pladen. Jævn spredning af fortyndingen er afgørende for nøjagtig tælling af kolonier.
- Pladerne inkuberes anaerobt i 24 timer ved 37 ° C. På dette tidspunkt, optælle C. difficile kolonier til opnåelse af CFU pr g indhold (fæces eller caecale). C. difficile kolonier er flade og lysegule og har uregelmæssige kanter og en matteret glas udseende 24.
BEMÆRK: Denne protokol kan bruges til at optælle C. difficile fra andre murine GI indhold, herunder ileum og colon indhold. PCR-plader kan anvendes til fremstilling af seriefortyndinger.
5. Vero cellecytotoksicitetsassay at kvantificere C. difficile Toxin Cytotoxiby
BEMÆRK: Det anbefales, at dette assay udføres efter færdiggørelsen af musemodel på prøver indsamlet ved obduktion og opbevaret ved -80 ° C. Aseptiske celledyrkningsteknikker er afgørende for at forhindre forurening af Vero-celler i løbet af denne assay. Denne protokol tager 2 dage at udføre. Alle afføring og tarmindhold anvendt i dette assay, skal opbevares i en afvejet, sterilt mikrocentrifugerør (betegnet med "rør vægt," se afsnit ovenfor). Den endelige rør vægt (herunder indholdet) måles via en analytisk skala til nærmeste fire decimaler (se afsnittet ovenfor). Anvendelse af en multi-kanal pipette anbefales til dette assay.
BEMÆRK: Inden du begynder, sikre, at følgende elementer er tilgængelige: Vero-celler, Dulbeccos modifikation af Eagle medium (DMEM) 1x med 10% varme-inaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin medier (betegnet som "DMEM 1x medier "se Materialer og den supplerende fil), 0,25%Trypsin-EDTA, 1 x PBS, 0,4% trypanblåt, en 96-brønds cellekultur fladbundet plade, en 96-brønds filterplade, Clostridium difficile toksin A (aliquot i 3 pi ved 1 pg / pl i ultrarent vand og opbevares ved -80 ° C), Clostridium difficile antitoxin, et regneark (for beregninger og plade kort, se supplerende filer).
Bør der udvises forsigtighed ved denne analyse for personale eksponering for C. difficile og dets toksin: BEMÆRK.
- Opdeling af Vero-celler (dag 1)
- Forvarm DMEM 1x medier, 0,25% trypsin-EDTA og 1 x PBS i et 37 ° C vandbad.
- Opnå en kolbe af Vero-celler fra cellekulturen inkubator (37 ° C og 5% CO2) og placere den i den sterile cellekultur laminar flow hætte. Brug 70% ethanol til at tørre ned hætten og udstyr før brug. Ved hjælp af en serologisk pipette, aspireres medierne fra vævskultur kolbe for at fjerne det fra Vero-celler og smid det ind i et spild container.
- Skylles Vero-celler med 5 ml 1 x PBS (forvarmet) i vævskultur kolbe. Aspirer PBS og smid den i en affaldsbeholder.
- Der tilsættes 5 ml 0,25% trypsin-EDTA til vævsdyrkningskolben. Tillad en kontakt tid af 2 - 3 min. I dette tidsrum observere cellerne begynder at komme ud kolben overflade. Vip forsigtigt vævskulturkolbe side til side for at løsne Vero-celler.
- Efter kontakttid med trypsin-EDTA, straks tilsættes 5 ml DMEM 1x medier i vævskulturkolbe. Dette vil neutralisere trypsin-EDTA. Brug denne løsning til forsigtigt at vaske eventuelle ikke-fastgjorte Vero-celler fra bagsiden af kolben. Brug derefter en serologisk pipette til at overføre denne blanding i en 15 ml konisk rør.
- Centrifuger Vero-celler i den koniske rør i 5 minutter ved 180 xg og 25 ° C. Sørg for, at centrifugen er korrekt afbalanceret. Efter centrifugering observere en synlig pellet af Vero-celler i bunden af den koniske rør. Pas på ikke at DISRUPT denne pellet. Aspirer off supernatanten fra konisk rør og kassér den.
- Resuspender Vero-celler i 3 ml DMEM 1x medier.
- Tælle Vero-celler
- Tilsættes 100 pi af Vero cellesuspensionen (fremstillet i trin 5.1.7) til 100 pi af 0,4% trypanblåt. Bland forsigtigt ved pipettering af opløsningen op og ned.
- Tilsæt 10 pi af denne blanding til hvert kammer i et hæmocytometer.
- Tæl antallet af levedygtige celler i de fire kvadranter af hæmocytometeret. Døde Vero-celler vil tage op Trypan blå og dermed vil blive farvet blå (disse celler bør ikke medregnes). Optag disse numre i "Vero Cell Arbejdsark," forudsat.
- Sum det samlede antal af levedygtige Vero-celler i alle fire kvadranter, og beregne gennemsnittet. Multiplicer med fortyndingsfaktoren, som er 2 siden 100 pi celler er i alt 200 pi væske.
- Multiplicer med korrektionsfaktoren for at give "; antal celler / ml "Når du bruger en hæmocytometer, korrektionsfaktoren er altid 10 4 Multiplicer med det samlede volumen for at give." samlet antal celler "..
- Bestemmelse af antallet af Wells kræves for hver Experiment
BEMÆRK: En enkelt prøve (enten afføring eller tarmindhold) kræver 24 separate brønde, der skal udføres i to eksemplarer. En koncentration på 10 5 Vero-celler per brønd (samlet volumen på 90 pi) er påkrævet.
BEMÆRK: Hvis man ønsker at inkubere Vero celle plader med 96 brønde natten over ved 37 ° C, en koncentration på 10 3 Vero-celler per brønd anbefales at tage højde for den forlængede inkubationstid. Beregninger i Vero Cell arbejdsark ville skulle justeres for at tage højde for denne ændring.- Bestem antallet af brønde, som kan udnyttes på grundlag af mængden af Vero-celler til rådighed (fra trin 5.2, bruge Vero Cell Arbejdsark, forudsat).
- Bestem mængden afVero cellesuspension kræves for at udfylde det antal ønskede brønde (baseret på antallet af prøver, der afprøves). Sørg for, at der tilsættes yderligere volumen på at tage højde for pipettering fejl (brug forudsat Vero Cell Arbejdsark).
- Fortynd Vero cellesuspension (opnået i trin 5.1.7) i DMEM 1x medier for at opnå den nødvendige volumen til eksperimentet.
- Seeding Vero celler i en 96-brønds celledyrkningsplade
- Brug af Vero celle resuspension fra trin 5.3.2, bruge en multikanals pipette til at tilføje 90 pi af Vero cellesuspension til hver brønd i en 96-brønds cellekultur fladbundet plade.
- Inkubér pladen med Vero-celler i en cellekultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 4 timer før tilsætning toksin (prøver) til brøndene. Denne inkubationstid vil give de Vero-celler til at adhærere til bunden af hver brønd.
- Oprettelse Stock Solutions fra prøverne (Afføring ellerIntestinal indhold)
BEMÆRK: Alle prøver bør have "rør vægt" og "endelig rør vægt" målt via en analytisk skala. Brug Vero Cell Arbejdsark til beregninger.- Beregn vægten af indholdet. Konvertere g til mg, derefter mg til pi. Beregn det endelige samlede antal pi opløsning nødvendige for at gøre en 1:10 fortynding i 1x PBS. Beregn den samlede 1x PBS til at føje til prøven.
- Tilsæt samlede volumen af 1x PBS (beregnet ovenfor) til prøven. Udfør denne aerobt, og ved hjælp af aseptisk teknik. For fækalpellets, bruge spidsen af pipetten til forsigtigt forstyrre pillen ind i løsningen.
- Vortex prøverne centrifugeres dem på 3.522 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Sørg for, at centrifugen er korrekt afbalanceret. Pas på ikke at forstyrre bundfaldet og resuspender prøven i opløsning.
BEMÆRK: Under trin 5.5.3, hvis kun nogle få prøver der behandles, indhold kan steriliseres vedat lade dem passere gennem en enkelt 0,22-um filter i stedet for anvendelse af en 96-brønds filterplade. Nogle prøver kan kræve flere filtre til at sterilisere hele mængden indhold ved hjælp af denne teknik. - Sterilisere prøven / PBS-blanding ved at tage 150 pi supernatant og anbringe det i separate brønde på en 96-brønds filterplade. Placer filterpladen sikkert på toppen af en 96-brønds cellekultur fladbundet plade, så indholdet filtrerer ind i denne plade.
- Centrifugeres filterpladen / cellekultur pladestabelen ved 431 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Sørg for, at centrifugen er korrekt afbalanceret og at filteret plade / celle kultur plade stack stramt er rettet ind, og vil ikke skifte under centrifugering.
BEMÆRK: Disse filtrerede indholdet er det 10 -1 bestand, der vil blive udnyttet i udvanding plader. - Placer plade med filtrerede prøver på is.
- Oprettelse Fortynding Plate # 1
BEMÆRK: Fortynding Plate # 1 (DP # 1) vil kræve 6 brønde pr prøve, herunder positive (C. difficile toksin A) og negative (1x PBS) kontrol (se DP # 1 layout på Vero Cell arbejdsark).- Til fremstilling af positive kontrol (C. difficile toksin A) til dette assay, hvilket gav 3-pi alikvoter (1 pg / pl) fra -80 ° C og tilsæt 297 ul ultrarent vand, hvilket gav en slutkoncentration på 0,01 pg / pl. Placer på is.
- Mærk brøndene med deres fortyndinger (10 -1 til 10 -6) for hver prøve, og angiver de positive og negative kontroller (se DP # 1 layout).
- Tilføj passende mængder af 1x PBS til hver brønd. I de 10 -1 brønde, tilføjer INGEN PBS. For de 10 -2 til 10 -6 brønde tilsættes 90 pi 1x PBS.
- Tilføj passende mængder af prøverne til hver brønd. I de 10 -1 brønde, tilsættes 100 pi af 10 -1 lager til hver prøve (se trin 5.5.7 fra filteret plate). For 10 -2 til 10 -6 brønde, gør seriefortyndinger; starte med at tage 10 pi fra 10 -1 godt og tilføje det til 10 -2 godt. Fortsæt de serielle fortyndinger ud til 10 -6 fortynding.
- Dæk DP # 1 plade med en klar plast selvklæbende forsegling og placere den på is.
- Oprettelse Fortynding Plate # 2
BEMÆRK: fortyndingsplade (DP # 2) vil kræve 2 baner med 6 brønde for hver prøve, herunder positive og negative kontroller (se DP # 2 layout på Vero Cell arbejdsark).- Mærk brøndene med deres fortyndinger (10 -1 til 10 -6) for hver prøve, og angive de positive og negative kontroller (se DP # 2 layout). Mærk brøndene med prøven navn (betegnet som "prøvebrønde") eller prøve navn med antitoksin (betegnet som "antitoxin brønde").
- Beregne mængden af antitoksin kræves til dette assay. BEMÆRK: antitoksin er en 25x lageropløsning, der skal fortyndes 1:25 i 1X PBS. Placer forberedt antitoksin 1x løsning på is.
- For "prøvebrønde," tilføj 20 ul 1x PBS til hver brønd for alle fortyndinger (10 -1 til 10 -6) af denne prøve. For "antitoxin brønde," tilsættes 20 pi 1x antitoxin til hver brønd i alle fortyndinger (10 -1 til 10 6), i nævnte prøve.
- Overfør 20 pi af den fortyndede prøve i brønde fra DP # 1 i de udpegede brønde på DP # 2 for rækkerne 1 - 6 og rækker 7 - 12 (se DP # 2 layout på Vero Cell arbejdsark). Bland opløsningen forsigtigt ved pipettering op og ned.
- Cover DP # 2 med en klar plast selvklæbende forsegling og tillade 40 minutters inkubation ved stuetemperatur. Denne inkubation er at tillade antitoksin at binde og derved inaktivere og neutralisere C. difficile toksin.
- Efter inkubationen tilsættes 10 pi blandingen fra DP # 2 til de passende Vero celle brønde (se Vero Cell Plate layout på Vero Cell Arbejdsark). Forsigtigt blande opløsningen ved pipettering op og ned, idet man ikke forstyrre de Vero-celler, der er klæbet til bundoverfladen af brøndene.
- Inkubér Vero celle plade natten over i en cellekultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Vurdere Vero Celler til Afrunding ved hjælp af et lysmikroskop (dag 2)
BEMÆRK: Husk på, at fortyndingsfaktoren ændringer ved en faktor 10, når der tilføjes prøven blandinger til Vero-celle plade (f.eks 10 -3 er nu 10 -4). Brønde, der har antitoksin stede skulle have lidt at ingen Vero-celle afrunding noteret. Vero celleafrunding (cytotoksicitet) vil bemærkes i prøver, der indeholder C. difficile toksin. Hvis den cytotoksiske aktivitet neutraliseres i en fortynding indeholdende prøven og antitoksin, er tilstedeværelsen af C. difficile toksin resulterer i Vero-celle cytotoksicitet bekræftet.- Undersøg for Vero-celle afrunding ved hjælp af en light mikroskop ved 200X forstørrelse. For prøvebrønde (herunder positiv kontrol), registrering fortyndingen af brønden, som er den sidste til at have 80% Vero celleafrunding noteret.
- Beregn den cytotoksiske titer, der er defineret som den reciprokke værdi af den højeste fortynding, der producerede 80% Vero celleafrunding pr g prøve. For eksempel, hvis den højeste fortynding er 10 -5, så fortyndingsfaktoren ville være 10 -6 for denne prøve. Således log [endelige fortyndingsfaktor] / g prøve ville være log [10 6], som giver en gensidig titer på 6.
BEMÆRK: Vero-celler har brug for at have undergået mindst 3 - 4 passager og ikke mere end 30 passager forud for deres anvendelse i denne analyse 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en repræsentativ undersøgelse blev 5 uger gamle C57BL / 6 vægt-mus forbehandlet med cefoperazon i deres drikkevand (0,5 mg / ml) i 5 dage og tilladt en 2-dages udvaskning med regelmæssig drikkevand. Mus blev udfordret med 10 5 sporer af C. difficile R20291 via oral sondeernæring på dag 0 (figur 1A). Mus blev overvåget for vægttab og kliniske tegn (sløvhed, appetitløshed, diarré og krum stilling) CDI i 14 dage. Udfordringen i C57BL / 6 WT mus med C. difficile R20291 sporer resulterede i diarré inden for 24 timer og betydelige tab vægt inden 48 timer efter udfordring (figur 1B). Selvom det ikke er observeret i dette forsøg, kan mus udfordret med en højere dosis af C. difficile R20291 blive alvorligt syg eller større end 20% vægttab med 48 - 72 hr efter udfordring, hvilket nødvendiggør human eutanasi. Derfor mus kræver et minimum af to gange dagligtovervågning efter provokation med C. difficile sporer.
I dette repræsentative undersøgelse blev en betydelig mængde af vægttab og kliniske tegn på sygdom i mus også observeret på dag 2 - 7 efter udfordring (figur 1B). Ved 7 dage efter belastning, begyndte mus at tage på, og kliniske tegn på sygdom aftaget. Ved den sidste uge af eksperimentet musene optrådte klinisk normale, uden tegn på de kliniske tegn på CDI, herunder diarré.
Fækale pellets blev indsamlet før udfordringen med C. difficile sporer og hver 48 timer post-udfordring (figur 1C). Forud for antibiotisk behandling blev mus ikke koloniseret med C. difficile. Inden 24 timer efter udfordring med C. difficile sporer blev mus koloniseret med 10 7 CFU'er af C. difficile pr g af afføring (Figur 1C </ Strong>). Mus forblev vedvarende koloniseret med C. difficile hele forsøget, trods ingen tegn på vægttab eller kliniske tegn på CDI for de sidste 7 dage af eksperimentet.
Figur 1: cefoperazon behandlede mus udfordret med C. difficile R20291 Exhibit Vægttab og koloniseret med C. difficile. A) 5 uger gamle C57BL / 6-WT JAX mus (n = 3M / 3F pr gruppe) blev forbehandlet med cefoperazon i deres drikkevand (0,5 mg / ml) i 5 dage og tilladt en 2-dages udvaskning med regelmæssig drikke vand. Mus blev udfordret med 10 5 sporer af C. difficile R20291 via oral sondeernæring på dag 0. Mus blev overvåget for vægttab og kliniske tegn (sløvhed, appetitløshed, diarré og krum stilling) CDI i 14 dage. Fæces blev indsamlet og anvendt til bakteriel tælling før du starter cefoperazon, straks after efterbehandling antibiotikummet, og på dag 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, og 14 i hele infektion. Nekropsi blev udført på dag 0, 2, 4, 7, og 14 B) Musene mistede en betydelig mængde af deres baseline vægt efter challenge med C. difficile R20291. Den gennemsnitlige legemsvægt af mus blev målt dagligt fra dag 0. Signifikant vægttab blev set på dag 2 til 7 i forhold til dag 0, den basisniveau-vægt. C) C. difficile R20291 bakterier i fæces efter udfordringen. Inden 24 timer efter challenge med C. difficile sporer, blev alle mus koloniseret med 10 7 CFU'er (kolonidannende enheder) per g af afføring. Ingen signifikante forskelle i disse parametre blev set mellem kvinder og mænd. Signifikans blev bestemt ved ikke-parametrisk Kruskal-Wallis envejs ANOVA-test efterfulgt af Dunns posttest (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001; ****, s Klik her for at se en større version af dette tal.
Fire mus (2 hanner og 2 hunner) blev humant aflivet og forberedt til obduktion på dag 0, før infektion, for at tjene som ikke-inficerede kontroller. Desuden blev en mus fra hvert bur humant aflivet og forberedt til obduktion på dag 2, 4, 7 og 14 efter udfordring (figur 1A). Tælling af C. difficile i coecumindhold blev udført ved hver obduktion. I konkordans med fækal opregning, blev der ikke C. difficile påvist i coecumindhold af mus forud for udfordringen med C. difficile. Ved 48 timer efter udfordring blev musene koloniseret med cirka 10 8 CFU'er af C. difficile pr g coecumindhold (figur2A). Alle mus forblev vedvarende koloniseret hele forsøget.
Coecumindhold blev også vurderet i hele infektionen for tilstedeværelsen af C. difficile-toksin ved anvendelse af Vero-celle cytotoksicitet assay. Blev ikke fundet bevis for C. difficile toksin cytotoksicitet i coecumindhold Inden provokationen (figur 2B). C. difficile cytotoksicitet blev detekteret 2 dage efter challenge med C. difficile-sporer og bestod under infektionen. Trods ret ensartet kolonisering med C. difficile, variation i niveauerne af C. difficile cytotoksisk aktivitet er tydelig i individuelle mus (figur 2B).
Størstedelen af muse coecumindhold neutraliseret med C. difficile antitoksin under Vero cellecytotoksicitetsassay og havde ingen tegn på cytotoksicitet (Vero cell afrunding) i fortyndinger udføres. Men et par individuelle mus, trods genprøvning, havde tegn på 50 - 100% cytotoksicitet i 10 -1 fortynding (fortynding hvor prøven er mest koncentreret), uden tegn på Vero celle afrunding i de andre fortyndinger. Den anvendes i dette assay antitoksin er et neutraliserende polyklonalt antistof mod C. difficile toksin, fremstillet i geder 27. Derfor muligvis antitoksin ikke neutralisere C. difficile binære toksin, der produceres af stamme R20291. Imidlertid er C. difficile binære toksin ikke for at være cytotoksisk 10. Overdreven C. difficile toksin stand til at blive neutraliseret ved antitoksin eller tilstedeværelsen af en anden, bortset C. difficile toksin kunne bidrage til dette fund cytotoksisk middel. Denne observation påvirkede ikke bestemmelse af cytotoksicitet titeren for disse prøver, idet hver prøve sidste fortynding med 80% Vero celleafrunding havdeingen tegn på cytotoksicitet når det kombineres med antitoksin på den angivne fortynding.
Figur 2: Kolonisering af coecum og cytotoksicitet under infektion med C. difficile R20291. A) Mus CECA forblev vedvarende koloniseret med C. difficile hele forsøget, trods ophør af kliniske symptomer og observerede vægtstigning. Alle mus blev koloniseret med mere end 10 8 CFU'er per g coecumindhold når de vurderes ved 2 dage efter belastning. B) Vero cellecytotoksicitetsassay fra coecumindhold hele infektion med C. difficile R20291. Efter udfordringen med C. difficile sporer, mus havde signifikante niveauer af cytotoksicitet, som målt i log 10 reciprok fortynding af toksin per g coecumindhold på dag 2, 4, og 7 post-udfordring i forhold til dag 0 (medianer represented af linjen). Signifikans blev bestemt ved ikke-parametrisk Kruskal-Wallis envejs ANOVA-test efterfulgt af Dunns posttest (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001 ). Fejl søjler repræsenterer standardafvigelserne fra middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Det anbefales, at histologisk evaluering gennemføres af et bord-certificeret veterinær patolog på en blindet måde. For væv scoring, bør en 0-4 numerisk scoringssystem anvendes til separat vurdere ødem, inflammatorisk celle infiltration, og epitelcelleskade i ileum, coecum, colon og baseret på en tidligere publiceret scorings skema 17.
Ved blindet histopatologisk eksamengennemgang af den murine ileum, coecum, colon og efter udfordring med C. difficile R20291, blev de væsentligste patologiske ændringer noteres i coecum (figur 3). De samlede cecale histologiske scoringer var signifikant forskellig mellem dag 0 og dag 2 og 4 efter infektion. Ingen signifikante læsioner blev noteret i ileum hele infektion (figur 3). Mildere læsioner blev noteret i tyktarmen. De samlede colon histologiske scoringer var signifikant forskellig mellem dag 0 og dag 2 og 7 efter udfordring (figur 3).
Repræsentativ H & E sektioner af ileum, coecum, og colon hele infektion findes i figur 4. Hvert billede har sin respektive samlede histologisk score og individuelle scorer for epitelbeskadigelse, inflammation og ødem, som bestemt ved en blindet bord-certificeret veterinær patolog ( SAM).
Figur 3: Histologisk Scoring af den murine ileum, coecum, og Colon under infektion med C. difficile R20291. Total histologiske scoringer blev beregnet ved at lægge alle tre scoringer fra parametrene vurderet: epitelbeskadigelse, inflammation og ødem. Ingen signifikante histopatologiske ændringer blev noteret i ileum hele infektionen. Cecal væv indeholdt de væsentligste histologiske læsioner under CDI. De samlede cecale histologiske scoringer var signifikant forskellige fra dag 0 på dag 2 og 4 efter infektion. Mildere læsioner blev noteret i tyktarmen. De samlede colon histologiske scoringer var signifikant forskellige fra dag 0 på dag 2 og 7 efter udfordring. Signifikans blev bestemt ved ikke-parametrisk Kruskal-Wallis envejs ANOVA-test efterfulgt af Dunns posttest (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p804; 0,001; ****, P ≤ 0,0001). Fejl søjler repræsenterer standardafvigelserne fra middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Histopatologi under infektion med C. difficile R20291. Dette panel indeholder repræsentative H & E dele af ileum, coecum, og kolon hele infektion med C. difficile R20291. De samlede histologiske score er i parentes () i samme dag og væv er angivet: for ileum dag 0 (0), dag 2 (1), dag 4 (0), dag 7 (0) og dag 14 (0) ; for coecum dag 0 (0), dag 2 (5), dag 4 (4), dag 7 (3), og dag 14 (3); og for colon dag 0 (0), dag 2 (4), dag 4 (1), dag 7 (4), og dag 14 (2). Mikrofotografier blev opnået på et lys mikroskopete med en 5 megapixel digitalkamera og den medfølgende software (skalaen bar repræsenterer 200 um). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
| 0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 1 ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
| 96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
| 96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
| Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
| Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
| Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
| D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Distilled Water | Gibco | 15230 | |
| DMEM 1x Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
| NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
| PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
| Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
| Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
| Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
| Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5 - 8 weeks of age |
| Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
| DP27 camera | Olympus Life Science | ||
| cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
References
- Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
- Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
- Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
- Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
- Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
- Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
- Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
- Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
- Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
- Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
- Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
- Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
- He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787 (2013).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).
- Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).
- Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
- Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
- Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
- Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
- Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
- Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).
