Summary
Dit protocol beschrijft de cefoperazon muismodel van Clostridium difficile infectie (CDI) met een klinisch relevante en genetisch handelbaar stam, R20291. Nadruk op klinische ziekte monitoring, C. difficile bacteriële opsomming, toxine cytotoxiciteit en histopathologische veranderingen in heel CDI in een muismodel worden beschreven in het protocol.
Introduction
Clostridium difficile is een anaërobe, grampositieve, sporenvormende bacil die levensbedreigende diarree 1 veroorzaakt. C. difficile infectie (CDI) is geassocieerd met een verhoogde menselijke morbiditeit en mortaliteit en resulteert in meer dan $ 4800000000 in de kosten van de gezondheidszorg per jaar 1-4. In 2013, de Centers for Disease Control and Prevention gecategoriseerd C. difficile als een dringende antibioticaresistentie risico, wat aangeeft dat het een dringende bedreiging voor de volksgezondheid 1 vormt. Op dit moment, antibiotische behandeling met vancomycine en metronidazol worden beschouwd als de standaard van zorg voor CDI 5. Helaas, herhaling van CDI na een succesvolle behandeling met antibiotica is hoog, optreedt in 20-30% van de patiënten 2,5-7. Daarom is de ontdekking van nieuwe therapieën tegen deze darmpathogeen noodzakelijk. Om therapieën te onderzoeken tegen C. difficile, een diermodel benadert de ziekte bij de mens in aclinically relevante stam nodig is.
Aanvankelijk werden postulaten vastgesteld voor C. difficile in 1977 met een clindamycine behandeld Syrische hamster model 8. Dit model wordt nog steeds gebruikt om de effecten van C. difficile toxinen onderzoeken naar pathogenese 9,10. Echter, CDI in het hamstermodel resulteert in hoge sterfte en niet nader chronische sluipende ziektemanifestaties die kunnen worden gezien bij mensen met CDI 10,11. Gebaseerd op de toegankelijkheid en reagens beschikbaarheid van murine platforms in onderzoek, een muismodel van CDI relevant.
In 2008, een robuust muismodel van CDI werd opgericht door de behandeling van muizen met een antibioticum cocktail in drinkwater (kanamycine, gentamicine, colistine, metronidazol en vancomycine) gedurende 3 dagen, gevolgd door een intraperitoneale injectie van clindamycine 12. Dit teruggegeven muizen gevoelig voor CDI en ernstige colitis. afhangening op de entstof dosis toegediend, kan een reeks klinische symptomen en sterfte worden geobserveerd met behulp van dit model. Sindsdien zijn diverse antibiotische regimes onderzocht dat de murine darmflora verandert, aflopend kolonisatieweerstand tot het punt waar C. difficile het maagdarmkanaal kan koloniseren (beschreven door Best et al. En Lawley & Young) 13,14.
Meer recent is een breed spectrum cefalosporine, cefoperazon, gezien in het drinkwater gedurende 5 of 10 dagen maakt reproduceerbaar muizen gevoelig voor CDI 15. Aangezien toediening van de derde generatie cefalosporinen geassocieerd met een verhoogd risico van CDI bij mensen gebruik van de cefoperazon model beter weergeeft nature voorkomende ziekte 16. -Cefoperazone behandelde muizen gevoelig voor C. difficile werden uitgedaagd met zowel C. difficile sporen en vegetatieve cellen van verschillende stammen variërend in klinischerelevantie en virulentie 17. Ondanks dat een aantal van de oorspronkelijke studies gebruik te maken van C. difficile vegetatieve cellen als de besmettelijke vorm, C. difficile sporen beschouwd als de belangrijkste wijze van overdracht 18.
In het laatste decennium, C. difficile R20291, een NAP1 / BI / 027 stam, is ontstaan, waardoor epidemieën van CDI 19,20. Wij hebben geprobeerd om het klinisch beloop van de ziekte te bepalen wanneer-cefoperazon behandelde muizen werden uitgedaagd met de klinisch relevante en genetisch handelbaar C. difficile stam, R20291. Dit protocol geeft de klinisch verloop, zoals gewichtsverlies, bacteriële kolonisatie, toxine cytotoxiciteit en histopathologische veranderingen in het maagdarmkanaal van muizen geprikkeld met C. difficile R20291 sporen. Kortom, dit muismodel blijkt een waardevolle experimenteel platform voor CDI benaderen van ziekten bij de mens zijn. Dit kenmerk muismodel kan dus worden gebruikt om de effecten te evaluerenvan nieuwe therapieën voor de verbetering van de klinische ziekte en het herstel van kolonisatieweerstand tegen C. difficile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische verklaring:
De Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) goedgekeurd deze studie. De NCSU Animal Care en gebruik beleid geldt normen en richtlijnen uiteengezet in de Animal Welfare Act en Health Research Extension Act van 1985. proefdierfaciliteiten bij NCSU voldoen aan richtlijnen uiteengezet in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. De dieren 'gezondheidsstatus werden dagelijks geëvalueerd en stervende dieren werden op humane wijze gedood door CO 2 stikken, gevolgd door secundaire maatregelen. Opgeleide technici dier of een dierenarts uitgevoerd veehouderij in een AAALAC-geaccrediteerde faciliteit tijdens deze studie.
1. Beheer van het antibioticum Cefoperazone in drinkwater aan Gevoeligheid bereiken C. difficile kolonisatie en Ziektepreventie
OPMERKINGEN: 5- tot 8 weken oude C57BL / 6 WT-muizen (vrouwtjes en mannetjes)werden gekocht en in quarantaine geplaatst gedurende 1 week vóór het begin van het antibioticum water administratie. Na quarantaine werden de muizen ondergebracht bij geautoclaveerd voedsel, beddengoed en water. Cage veranderingen werden uitgevoerd wekelijks door laboratorium personeel in een laminaire stroming kap.
- Bereid cefoperazon (0,5 mg / ml) in steriel gedestilleerd water 7 dagen voor de dag van gerichte challenge (figuur 1).
- Vul geautoclaveerd water flessen met cefoperazon water (0,5 mg / ml) en plaats ze in elke muis kooi.
LET OP: Vers bereide cefoperazon water moet worden gemaakt en veranderde uit elke 2 dagen gedurende een periode van 5 dagen, zoals aangegeven in de stappen 1.1 en 1.2. Een goede afvoer van water cefoperazon volgende institutionele milieu en gezondheid en veiligheid richtlijnen wordt aanbevolen. - Na 5 dagen op cefoperazon water, de plaats van de flessen met geautoclaveerd water flessen gevuld met steriel gedestilleerd water. Geef muizen moet drinkwater voor de duur van het experiment.
2. Voorbereiding van de C. difficile Spore Inoculum en de orale sondevoeding van de Muizen
LET OP: Voordat u begint, ervoor te zorgen dat de volgende items in de anaërobe kamer worden geplaatst voor ten minste 24 uur: 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, zie Materials), taurocholaat cycloserine cefoxitine fructose agar (TCCFA) platen (zie Materialen en de aanvullende bestand ) en een steriele L-vormige spreader.
LET OP: De muizen uitgedaagd met C. difficile sporen moeten worden ondergebracht in een Biosafety Level 2 dier faciliteit.
- Verkrijgen van een C. difficile spore stock van de gewenste rek (in casu R20291) dat eerder was bereid en bewaard bij 4 ° C in steriel water 21,22. Bepaal de opsomming van de spore voorraad vóór gebruik.
- Gebaseerd op de bekende concentratie (sporen / ml) van de spore beelden, berekent de gewenste verdunning tot 10 5 sporen verkrijgen per 25 ul. Verzekeren het inoculum volume voldoende om alle entenmuizen in het experiment (25 pi per muis), de opsomming van het inoculum (ongeveer 30 ui) uitvoeren, en die rekening pipetteerfout.
- Vortex de originele C. difficile spore voorraad. Dan, resuspendeer de berekende volume (uit stap 2.2) van de oorspronkelijke C. difficile spore voorraad in steriel water binnen een schroef bedekte microcentrifugebuis. Voer deze aëroob in een laminaire stroming kap. Identificeer deze verdunde mengsel als de "spore inoculum."
- Plaats de spore entstof in een 65 ° C waterbad en verwarm het voor 20 min.
LET OP: Deze stap zal ervoor zorgen dat alleen actief C. difficile sporen achterblijven na de warmtebehandeling. - Binnen de laminaire stroming kap, nemen 50 pl van verhitte spore entstof, plaats het in een steriele microcentrifugebuis, en geef het in de anaerobe kamer 23. Gebruik dit monster voor spore opsomming.
- Binnen de laminaire stroming kap, laadt de resterende verwarmde spore entstof intoa 1-ml spuit bevestigd aan een steriele-lamp getipt maag maagsonde naald. Maken gebruik van een handmatige injectiespuit stepper om ervoor te zorgen accurate en snelle herhaling doseren tussen muizen. Controleer of de sondenaald gevuld met de verwarmde spore inoculum voor gebruik.
OPMERKING: Een nieuwe steriele sondenaald voor elke muis is niet vereist. Indien verscheidene doses C. difficile sporen worden toegediend, een nieuwe maagsonde naald wordt aanbevolen voor elke dosis.
OPMERKING: C. difficile sporen zijn zeer resistent tegen traditionele ontsmettingsmiddelen. Daarom is het gebruik van een sporicidal desinfectiemiddel, zoals # 62 Perisept Sporicide ontsmettingsmiddel, noodzakelijk. De fabrikant adviseert een 2-min contacttijd van C. difficile sporen te vernietigen. - Gavage elke muis met 25 ul van de spore inoculum. Beperken elke muis voorzichtig door grijpen het dier door de losse huid van de nek en rug teneinde het hoofd te immobiliseren. Met de wijsvinger verdere immobiliseren hoofd van het dier enlangwerpige de slokdarm. Zorg ervoor dat het dier niet hardop of vertonen andere tekenen van nood tijdens de terughoudendheid.
Opmerking: Het totale volume aan muizen door gavage niet meer dan 10 ml / kg lichaamsgewicht (0,1 ml / 10 g). - Handhaving van de muis in een rechtopstaande, verticale positie en voorzichtig langs de maagsonde naald in de zijkant van de mond. Richt de maagsonde naald langs het dak van de mond en langzaam vooruit de maagsonde naald in de slokdarm.
LET OP: Als er weerstand wordt ondervonden, de maagsonde naald kan het aangaan van de luchtpijp en dus moeten niet worden gevorderd, maar eerder verwijderd en onmiddellijk verplaatst. - Na de sondenaald ongeveer halverwege de slokdarm Injecteer 25 pi van de verwarmde spore inoculum en zachtjes trekken de maagsonde naald uit de slokdarm.
OPMERKING: Krachtig bevorderen van de maagsonde naald kan leiden tot het scheuren van de slokdarm of maag. Daarom, als weerstand wordt ondervonden bij het bevorderen van de maagsonde naald, Is het het beste om onmiddellijk te verwijderen en de positie van de maagsonde naald. - Breng het dier naar zijn kooi en acht het voor elke hoesten of tekenen van ademnood, omdat dit onbedoelde tracheale toediening of aspiratie van de verwarmde spore entstof kunnen wijzen.
OPMERKING: Muizen zijn zeer gevoelig voor C. difficile na antibiotische behandeling; daarom voorzorgsmaatregelen om kruisbesmetting te voorkomen tussen de kooien is essentieel. Dit is vooral belangrijk bij het beheren antibiotica behandelde maar onbetwiste muizen als controles. - Na het inenten van alle muizen, plaatst u de resterende verwarmde spore entstof in een steriele microcentrifugebuis en doorgeven in de anaerobe kamer voor spore opsomming.
- Voor telling van de verwarmde spore inoculum (uit stap 2.4) en de resterende gavaged verwarmd spore inoculum maken 01:10 seriële verdunningen van elk inoculum in 1x PBS. Het wordt aanbevolen om de plaat en 4-5 verdunningen (bijvoorbeeld 10 tot -110 -5).
- Met behulp van aseptische techniek, overdracht 100 pi van elke seriële verdunning op een individuele TCCFA plaat.
- Met behulp van een steriele L-vormige spreader, gelijkmatig verspreid de op het medium over de plaat verdund. Gelijkmatige verspreiding van het verdunde inoculum is essentieel voor een nauwkeurige telling van sporen.
- Incubeer de platen anaëroob gedurende 24 uur bij 37 ° C. Na 24 uur, kan C. difficile-kolonievormende eenheden (CFU's) worden genoemd als het infectieuze dosis toegediend aan muizen in de 25 pl (0,025 ml) volume (zie aanvullend bestand "Voorbeeld Berekeningen") te verkrijgen. C. difficile kolonies zijn plat en lichtgeel en hebben onregelmatige randen en een geslepen glas uiterlijk 24.
NB: De detectiegrens voor bacteriële opsomming 10 2 CFU.
3. Toezicht Mouse Weight Loss en klinische symptomen van de ziekte in heel C. difficile infectie
- Weeg eennimals vóór en na 5 dagen cefoperazon antibiotische behandeling, na 2 dagen herstel off antibiotica (dag 0) en vervolgens gedurende de duur van het experiment.
OPMERKING: Zorg gewichten op een consistente tijd elke dag. Gewichten verkregen de dag uitdaging (dag 0) worden gebruikt als de initiële basislijn gewicht voor vergelijking hele C. difficile infectie. - Plaats een digitale weegschaal in een bioveiligheid kast. Plaats een steriele plastic beker op de weegschaal en tarra gewicht van de kunststof beker. Dan voorzichtig pak de muis door de basis van de staart en plaats deze in de plastic beker.
- Plaats de beker terug op de schaal. Zweven hand over de bovenkant van de beker dat de muis niet ontsnapt. 3 sec om een stabiel gewicht te krijgen - het kan 2 duren. Vervolgens plaats voorzichtig de muis terug in de kooi. Noteer dit gewicht en herhaal het proces voor elke muis in die kooi.
LET OP: Het is noodzakelijk dat maatregelen worden genomen om cross-verontreinigingen te voorkomentie tussen de kooien bij het verkrijgen van gewichten. Elke kooi van muizen moet haar eigen plastic beker voor het wegen te hebben. De plastic bekers moeten worden ontsmet met een sporicide middel tussen elk gebruik en bedekt met steriele aluminiumfolie.
- Plaats de beker terug op de schaal. Zweven hand over de bovenkant van de beker dat de muis niet ontsnapt. 3 sec om een stabiel gewicht te krijgen - het kan 2 duren. Vervolgens plaats voorzichtig de muis terug in de kooi. Noteer dit gewicht en herhaal het proces voor elke muis in die kooi.
- Bewaak de gewraakte dieren tweemaal daags (minimaal) op tekenen van klinisch ernstige C. difficile infectie, met inbegrip van lethargie, verlies van eetlust, diarree, en gebogen houding.
- Humaan euthanaseren dieren die 20% van hun aanvankelijke basislijn lichaamsgewicht verliezen en / of ontwikkelen ernstige klinische symptomen van C. difficile infectie (in stap 3,3 opgesomd).
OPMERKING: Muizen die klinische symptomen van C. difficile infectie duiden dient te worden afgewogen indien nodig tijdens het experiment te verzekeren dat zij niet verloren 20% van hun aanvankelijke basislijn lichaamsgewicht. Tijdens de vroege tijdstippen in het experiment, zou dit betekenen tweemaal daags metingen.
4. Bacteriële opsomming van C. difficilevan Mouse Uitwerpselen en cecal Content
LET OP: Voordat u begint, ervoor te zorgen dat de volgende items in de anaerobe kamer worden geplaatst voor ten minste 24 uur: 1x PBS (zie Materials), TCCFA platen (zie Materials), een steriele L-vormige spreader en steriele microcentrifugebuizen en / of PCR platen voor verdunningen.
- Het verkrijgen van monsters voor C. difficile opsomming
NB: Voorafgaand aan het verkrijgen van feces of blindedarm inhoud, wegen steriele microcentrifugebuizen op een analytische schaal. Neem de buis gewicht op de zijkant van de buis, afgerond op vier decimalen (bijvoorbeeld 0,9864 g). Duiden dit gewicht als de "tube gewicht." Elk verzameld monster moet in een steriele, gewogen microcentrifugebuis geplaatst.- Steriele collectie van de muis uitwerpselen
- Voorzichtig beperken elke muis door grijpen het dier door de losse huid van de nek en rug teneinde het hoofd te immobiliseren. Gebruik de pink om voorzichtig te beperken de staart van het dier, thus blootstellen van de anus. Zorg ervoor dat het dier niet hardop of vertonen andere tekenen van nood tijdens de terughoudendheid.
- Houd een steriele, gewogen microcentrifugebuis direct onder de anus van het dier. Het is noodzakelijk dat de buis niet in direct contact met de muis komt.
- Als het dier ontlasting, het verzamelen van de fecale pellet in de buis. Houd de buis bij kamertemperatuur totdat alle fecale monsters verzameld. Het kan enkele minuten duren voordat een muis om te poepen, dus noodzakelijk herhaal pogingen om uitwerpselen te verzamelen.
- Weeg de buisjes met uitwerpselen op de analytische schaal. Noteer de buis gewicht, afronden tot op vier decimalen (bijvoorbeeld 1,0021 g). Duiden de verkregen gewicht als de "laatste tube gewicht."
- Passeer de fecal samples in de anaerobe kamer voor bacteriële telling direct na de ontlasting collectie.
- Steriele verzameling muizen blindedarm inhoud ten tijde van de necropsie
- Na humane euthanasie door CO 2 stikken, gevolgd door secundaire maatregelen, het uitvoeren van een autopsie om de blindedarm 25 te verkrijgen. De blindedarm is de grote, komma-vormig deel van het maagdarmkanaal.
- Plaats de blindedarm naar een steriele plastic petrischaal. Gebruik een disposable, steriel nee. 10 scalpel aan de blindedarm opengesneden uit de blinde einde van het zakje aan de blindedarm inhoud bloot te leggen.
- Voorzichtig pak de blindedarm inhoud door het toepassen van lichte druk met de scalpel en het vegen van de inhoud naar het ingesneden deel van de blindedarm.
OPMERKING: Men dient de blindedarm weefsel, dat voor histopathologisch onderzoek wordt voorgelegd niet verstoren.
- Voorzichtig pak de blindedarm inhoud door het toepassen van lichte druk met de scalpel en het vegen van de inhoud naar het ingesneden deel van de blindedarm.
- Plaats de blindedarm inhoud in een steriele, woog microcentrifugebuis onmiddellijk na collectie. Slechts ongeveer 10 mg blindedarm inhoud vereist voor bacteriële telling.
- Weeg de buisjes met blindedarm inhoud op de analytische scale. Noteer de buis gewicht, afronden tot op vier decimalen (bijvoorbeeld 1,0021 g). Duiden de verkregen gewicht als de "laatste tube gewicht."
- Passeer de blindedarm inhoud samples in de anaerobe kamer voor bacteriële opsomming.
- Steriele collectie van de muis uitwerpselen
- Bacteriële opsomming van C. difficile
- Bereken het eindgewicht van de inhoud (faeces of blindedarm) die worden opgesomd voor C. difficile. Voerde dit door het aftrekken van de "laatste tube gewicht" van de "tube gewicht."
- Bereken een 1:10 verdunning van de inhoud in 1X PBS en dienovereenkomstig te resuspenderen. Voor fecale pellets, gebruikt u de punt van de pipet om voorzichtig te verstoren de pellet in de oplossing (zie de aanvullende bestand "Voorbeeld Berekeningen").
- Anaëroob geïncubeerd deze geresuspendeerd monsters bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, waarvan de inhoud bezinken.
- Maak seriële verdunningen voor elk monster in 1x PBS voor enumking van de CFU per g inhoud (feces of blindedarm). Voer deze anaëroob.
- Met behulp van aseptische techniek, overdracht 100 ul van elke seriële verdunning tot TCCFA platen. Met behulp van een steriele L-vormige spreader, verspreid het op de media verdunning gelijkmatig verspreiden over de plaat. Gelijkmatige verspreiding van de verdunning is essentieel voor een nauwkeurige telling van de kolonies.
- Incubeer de platen anaëroob gedurende 24 uur bij 37 ° C. Momenteel sommen C. difficile kolonies op de CFU per g inhoud (faeces of blindedarm) te verkrijgen. C. difficile kolonies zijn plat en lichtgeel en hebben onregelmatige randen en een geslepen glas uiterlijk 24.
Opmerking: Dit protocol kan worden gebruikt voor C. difficile opsommen van andere murine GI inhoud, waaronder ileum en colon inhoud. PCR platen kunnen worden gebruikt voor het maken van seriële verdunningen.
5. Vero cel cytotoxiciteit Assay te kwantificeren C. difficile Toxine Cytotoxistad
OPMERKING: Aanbevolen wordt deze test worden uitgevoerd na afloop van het muismodel monsters bij autopsie verzameld en bewaard bij -80 ° C. Aseptische celcultuur zijn essentieel voor het voorkomen van besmetting van Vero-cellen in deze assay. Dit protocol duurt 2 dagen uit te voeren. Alle uitwerpselen en intestinale inhoud gebruikt in deze test moet worden opgeslagen in een gewogen, steriele microcentrifugebuis (aangeduid met de "tube gewicht," zie sectie hierboven). De uiteindelijke buis gewicht (inclusief de inhoud) wordt gemeten via een analytische schaal naar de dichtstbijzijnde vier cijfers na de komma (zie bovenstaande paragraaf). Gebruik van een multi-channel pipet wordt aanbevolen voor deze test.
LET OP: Voordat u begint, ervoor te zorgen dat de volgende items zijn beschikbaar: Vero Cells, wijziging Dulbecco's van Eagle medium (DMEM) 1x met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine media (aangeduid als "DMEM 1x media; "zie Materialen en de aanvullende-bestand), 0,25%Trypsine-EDTA, 1 x PBS, 0,4% trypan blauw, een 96-well celcultuur platte bodemplaat, een 96-well filterplaat, Clostridium difficile toxine A (aliquot in 3 pl van 1 ug / ul in ultrazuiver water en Bewaren bij -80 ° C), Clostridium difficile Antitoxin, een werkblad (voor berekeningen en plaat kaarten, zie aanvullende bestanden).
LET OP: Voorzichtigheid moet worden genomen tijdens deze test voor het personeel blootstelling aan C. difficile en zijn toxine.
- Het splitsen van de Vero-cellen (dag 1)
- Verwarm de DMEM 1x media, 0,25% trypsine-EDTA en 1x PBS in een 37 ° C waterbad.
- Het verkrijgen van een kolf van Vero-cellen uit de celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) en plaats deze in de steriele celkweek laminaire stroming kap. Gebruik 70% ethanol vegen van de kap en apparatuur voor gebruik. Met behulp van een serologische pipet, zuigen de media uit de weefselkweek kolf om hem van de Vero-cellen te verwijderen en gooi het in een verspilling container.
- Spoel de Vero cellen met 5 ml 1x PBS (voorverwarmd) in weefselkweek kolf. Zuig het PBS en gooi het in een afvalbak.
- Voeg 5 ml 0,25% trypsine-EDTA op de weefselkweek kolf. Laat een contacttijd van 2-3 min. Gedurende deze tijd, moeten de cellen beginnen te komen uit de kolf oppervlak. Schud de weefselkweek kolf links naar rechts om de Vero-cellen los te maken.
- Na contact tijd met trypsine-EDTA, direct 5 ml DMEM 1x media toe te voegen in de weefselkweek kolf. Hierdoor wordt de trypsine-EDTA neutraliseren. Gebruik deze oplossing voor een losse Vero-cellen voorzichtig te wassen van de achterkant van de kolf. Gebruik vervolgens een serologische pipet aan dit mengsel over in een 15-ml conische buis.
- Centrifugeer de Vero-cellen in de conische buis gedurende 5 minuten bij 180 xg en 25 ° C. Zorg ervoor dat de centrifuge is goed uitgebalanceerd. Na centrifugeren observeren zichtbare pellet van Vero-cellen op de bodem van de conische buis. Zorg ervoor dat u DISRupt deze pellet. Aspireren uit de bovenstaande vloeistof uit de conische buis en gooi deze weg.
- Resuspendeer de Vero-cellen in 3 ml DMEM 1x media.
- Het tellen van de Vero-cellen
- Voeg 100 ul van de celsuspensie Vero (gemaakt in stap 5.1.7) aan 100 ui 0,4% trypan blauw. Meng door pipetteren de oplossing op en neer.
- Voeg 10 ul van dit mengsel aan elke kamer van een hemocytometer.
- Tel het aantal levensvatbare cellen in de vier kwadranten van de hemocytometer. Dode Vero cellen zullen nemen van de trypan Blue en dus zullen worden gekleurd blauw (deze cellen mag niet worden meegeteld). Noteer deze nummers in de "Vero Cell werkblad," voorzien.
- Som het totale aantal levensvatbare Vero-cellen in alle vier kwadranten en bereken het gemiddelde. Vermenigvuldigen van de verdunningsfactor die sinds 2 100 gl cellen in een totaal van 200 pl vloeistof.
- Vermenigvuldigen met de correctiefactor om de te geven ", het aantal cellen / ml "Bij gebruik van een hemocytometer, de correctiefactor altijd 10 4 Vermenigvuldig het totale volume aan de geven. 'totaal aantal cellen"..
- Het bepalen van het aantal putten voor elke Experiment
LET OP: Een enkel monster (ofwel feces of darminhoud) vergt 24 afzonderlijke bronnen moeten worden uitgevoerd in tweevoud. Een concentratie van 10 5 Vero cellen per putje (totaal volume van 90 gl) vereist.
OPMERKING: Indien men wenst de Vero cellen 96 putjes incubeer overnacht bij 37 ° C, een concentratie van 10 3 Vero cellen per well aanbevolen overeenkomt met het verlengde incubatietijd. Berekeningen in de Vero Cell werkblad zou moeten worden aangepast om rekening te houden met deze verandering.- Bepaal het aantal putten die gebruikt kunnen worden gebaseerd op de hoeveelheid Vero cellen aanwezig (in stap 5,2, gebruiken de Vero cel werkblad, voorzien).
- Bepaal de hoeveelheidVero celsuspensie nodig om het gewenste aantal putten te vullen (gebaseerd op het aantal monsters getest). Zorg ervoor dat eventuele extra volume wordt toegevoegd om rekening te houden voor het pipetteren fout (gebruik de meegeleverde Vero Cell-werkblad).
- Verdun de suspensie Vero cellen (verkregen in stap 5.1.7) in DMEM 1x media om het gebruikte volume van het experiment te verkrijgen.
- Zaaien Vero cellen in een 96 putjes celkweekplaat
- Met de Vero cel resuspensie uit stap 5.3.2, gebruikt een multi-channel pipet 90 ul van de Vero celsuspensie aan elke well van een 96-well celcultuur platte bodemplaat.
- Incubeer de plaat met de Vero-cellen in een celkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 4 uur voor het toevoegen van toxine (monsters) aan de putjes. Deze incubatietijd zal de Vero cellen hechten aan de bodem van elk putje.
- Het creëren Stock oplossingen van de monsters (faeces ofIntestinal Content)
LET OP: Alle monsters moeten de "tube gewicht 'en' final tube gewicht" gemeten via een analytische schaal te hebben. Gebruik Vero Cell werkblad voor berekeningen.- Bereken het gewicht van de inhoud. Converteren g tot mg, vervolgens mg tot ul. Bereken het uiteindelijke totale aantal pi-oplossing nodig is om een 1:10 verdunning in 1x PBS te maken. Bereken de totale hoeveelheid 1x PBS toe te voegen aan het monster.
- Voeg de totale 1x PBS (hierboven berekend) aan het monster. Voer deze aëroob, en het gebruik van aseptische techniek. Fecale pellets, met de punt van de pipet zachtjes verstoren de pellet in de oplossing.
- Vortex de monsters en centrifugeer ze op 3522 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de centrifuge is goed uitgebalanceerd. Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren en resuspendeer de sample in de oplossing.
OPMERKING: Tijdens stap 5.5.3, al was het maar een paar voorbeelden worden verwerkt, de inhoud kan worden gesteriliseerd doorpasseren ze door een 0,22 urn filter in plaats van een 96-well filterplaat. Sommige monsters kunnen meerdere filters verplicht de gehele volumegehalte met deze techniek steriliseren. - Steriliseer het monster / PBS mengsel door middel van 150 pi supernatant en te plaatsen in afzonderlijke putjes op 96-well filterplaat. Plaats de filterschijf stevig op een 96-well celcultuur vlakke bodem aangebracht, zodat de inhoud ervan filter in deze plaat.
- Centrifugeer de filter plaat / celcultuur plaat stack bij 431 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de centrifuge is goed uitgebalanceerd is en dat de filter plaat / celcultuur plaat stapel strak uitgelijnd en zal niet verschuiven tijdens het centrifugeren.
LET OP: Deze gefilterd inhoud zijn de 10 -1 voorraad die zullen worden gebruikt in de verdunning platen. - Plaats de plaat met gefilterde monsters op ijs.
- Het creëren van Verwatering Plate # 1
LET OP: Verwatering Plate # 1 (DP # 1) zal 6 wells per monster, met inbegrip van positieve (C. difficile toxine A) en negatieve (1x PBS) controles (zie de DP # 1 lay-out op de Vero Cell-werkblad) vereisen.- De positieve controle (C. difficile toxine A) voor deze test te bereiden, te vinden 3-ul aliquots (1 ug / ul) van -80 ° C en voeg 297 ul ultrazuiver water, waarbij een uiteindelijke concentratie van 0,01 pg / pl. Leg ze op ijs.
- Label de wells met hun verdunningen (10 -1 10 tot -6) voor elk monster en geven de positieve en negatieve controles (zie DP # 1 layout).
- Voeg geschikte hoeveelheden 1x PBS aan elk putje. In de 10 -1 putjes, voeg NO PBS. Voor de 10 -2 tot -6 10 putjes, voeg 90 pl 1x PBS.
- Voeg geschikte hoeveelheden van de monsters aan elk putje. In de 10 -1 putten, voeg 100 ul van de 10 -1 voorraad voor elk monster (zie stap 5.5.7 uit het filter plate). Voor de 10 -2 tot -6 10 putjes, maken seriële verdunningen; beginnen door 10 pl van de 10 -1 goed en toe te voegen aan de 10 -2 goed. Ga door met de seriële verdunningen naar de 10 -6 verdunning.
- Bedek de DP # 1 plaat met een doorzichtige plastic kleefband en plaats het op ijs.
- Het creëren van Verwatering Plate # 2
LET OP: Verwatering Plate (DP # 2) zal vereisen 2 rijstroken van 6 putjes voor elk monster, met inbegrip van positieve en negatieve controles (zie de DP # 2 lay-out op de Vero Cell-werkblad).- Label de wells met hun verdunningen (10 -1 10 tot -6) voor elk monster en geven de positieve en negatieve controles (zie DP # 2 layout). Label de putjes met het monster naam (aangeduid als "monsterputjes") of monsteromschrijving met antitoxine (aangeduid als "antitoxine putjes").
- Bereken de hoeveelheid antitoxine vereist voor deze assay. NB: Het tegengif is een 25x voorraadoplossing die moet worden verdund 1:25 in 1 x PBS. Plaats de voorbereide tegengif 1x oplossing op het ijs.
- Voor "monsterputjes," voeg 20 pl 1x PBS aan elk putje voor alle verdunningen (10 -1 tot 10 -6) in dit monster. Voor "antitoxine putten," voeg 20 pl 1x Antitoxin aan elk putje voor alle verdunningen (10 -1 tot 10 6) in dit monster.
- Overdracht 20 pi van het verdunde monster in putjes van DP # 1 in de aangegeven putjes op DP # 2 rijen 1-6 en rijen 7-12 (zie de DP # 2 lay-out op de Vero Cell-werkblad). Meng de oplossing voorzichtig door en neer te pipetteren.
- Bedek DP # 2 met een doorzichtige plastic kleefband en laat 40 minuten incubatie bij kamertemperatuur. Deze incubatie is om de antitoxine te binden en daardoor inactiveren en neutraliseren van de C. difficile toxine.
- Na de incubatie, voeg 10 ul van het mengsel van DP # 2 aan de juiste putjes Vero cel (zie Vero cel plaatindeling de Vero Cell-werkblad). Voorzichtig de oplossing en neer te pipetteren, en zorg dat niet verstoren Vero cellen die zijn gehecht aan het onderoppervlak van de putjes te mengen.
- Incubeer de Vero cel plaat 's nachts in een celkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Beoordelen van Vero-cellen voor het afronden van het gebruik van een lichtmicroscoop (dag 2)
NB: Bedenk dat de verdunningsfactor veranderingen met een factor 10 bij het toevoegen van het monster mengsels naar de Vero cel plaat (bijvoorbeeld 10 -3 is nu 10 -4). Wells dat antitoxin moment hebben moeten hebben weinig tot geen Vero cel afronding opgemerkt. Vero cel afronding (cytotoxiciteit) zal worden opgemerkt in monsters die C. difficile toxine bevatten. Als de cytotoxische activiteit wordt geneutraliseerd in concentraties die het monster en de antitoxine, is de aanwezigheid van C. difficile toxine resulteert in Vero cel cytotoxiciteit bevestigd.- Onderzoek voor Vero cel afronding met behulp van een light microscoop bij 200X vergroting. Voor monsterputjes (met inbegrip van de positieve controle), registreren de verdunning van de put die de laatste 80% Vero celronding hebben opgemerkt.
- Bereken de cytotoxische titer, die wordt gedefinieerd als de reciproke van de hoogste verdunning die 80% Vero celronding per gram monster geproduceerd. Bijvoorbeeld, als de hoogste verdunning 10 -5, dan zou de verdunningsfactor 10 -6 voor dit monster. Zo is de log [uiteindelijke verdunning factor] / g van het monster zou worden log [10 6], die een wederzijdse titer van 6 oplevert.
OPMERKING: - 4 passages en niet meer dan 30 passages vóór het gebruik bij deze proef 26 Vero cellen moeten minstens 3 hebben ondergaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gedurende een representatieve studie werden 5 weken oude C57BL / 6-muizen voorbehandeld met WT cefoperazon in hun drinkwater (0,5 mg / ml) gedurende 5 dagen en men liet 2 dagen spoelen regelmatig drinkwater. Muizen werden geprikkeld met 10 5 sporen van C. difficile R20291 via orale sondevoeding op dag 0 (Figuur 1A). De muizen werden gevolgd voor gewichtsverlies en klinische symptomen (lusteloosheid, gebrek aan eetlust, diarree en gebogen houding) van CDI gedurende 14 dagen. De uitdaging van de C57BL / 6 WT muizen met C. difficile R20291 sporen geleid tot diarree binnen 24 uur en significant gewichtsverlies binnen 48 uur na challenge (Figuur 1B). Hoewel niet in dit experiment waargenomen, kunnen muizen geprikkeld met een hogere dosis van C. difficile R20291 ernstig ziek of hebben meer dan 20% gewichtsverlies van 48-72 uur na challenge, waardoor humane euthanasie noodzakelijk. Daarom muizen vereisen een minimum van twee maal daagsbewaking na challenge met C. difficile sporen.
In deze representatieve studie werden een significante mate van gewichtsverlies en klinische ziektesymptomen in muizen ook waargenomen op dag 2-7 na prikkeling (Figuur 1B). Op 7 dagen na challenge, muizen begon om gewicht te winnen, en de klinische symptomen van de ziekte verdwenen. De laatste week van de proef, de muizen bleek klinisch normaal, zonder bewijs van de klinische symptomen van CDI, waaronder diarree.
Fecale pellets werden verzameld voorafgaand aan de challenge met C. difficile sporen en om de 48 uur na challenge (figuur 1C). Vóór de behandeling met antibiotica, werden muizen niet gekoloniseerd met C. difficile. Binnen 24 uur na uitdaging met C. difficile sporen werden muizen gekoloniseerd met 10 7 CFU's van C. difficile per gram feces (figuur 1C </ Strong>). Muizen bleef aanhoudend gekoloniseerd met C. difficile gedurende het experiment, ondanks dat er geen bewijs van gewichtsverlies of klinische verschijnselen van CDI voor de laatste 7 dagen van het experiment.
Figuur 1: Cefoperazone behandelde muizen Uitgedaagd met C. difficile R20291 Exhibit Weight Loss en gekoloniseerd met C. difficile. A) 5 weken oude C57BL / 6 WT JAX muizen (n = 3 M / 3F per groep) werden voorbehandeld met cefoperazon in hun drinkwater (0,5 mg / ml) gedurende 5 dagen en toegelaten 2 dagen spoelen regelmatig drinken water. De muizen werden uitgedaagd met 10 5 sporen van C. difficile R20291 via orale sondevoeding op dag 0. De muizen werden gevolgd voor gewichtsverlies en klinische symptomen (lusteloosheid, gebrek aan eetlust, diarree en gebogen houding) van CDI gedurende 14 dagen. Ontlasting werd opgevangen en gebruikt voor bacteriële telling voor het begin cefoperazon, onmiddellijk after afwerking het antibioticum en op dag 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13 en 14 gedurende infectie. Necropsie werd uitgevoerd op dagen 0, 2, 4, 7, en 14 B) De muizen na uitdaging met C. difficile R20291 een groot gedeelte van de uitgangswaarde afgevallen. Het gemiddelde lichaamsgewicht van muizen werd dagelijks gemeten vanaf dag 0. significant gewichtsverlies werd waargenomen op dagen 2 tot 7 ten opzichte van dag 0, de basislijn gewicht. C) C. difficile R20291 bacteriële verontreiniging in de ontlasting na de uitdaging. Binnen 24 uur na de prikkeling met C. difficile sporen werden alle muizen gekoloniseerd met 10 7 CFU (kolonievormende eenheden) per gram faeces. Geen significante verschillen in deze parameters werden gezien tussen vrouwen en mannen. Significantie werd bepaald door de niet-parametrische Kruskal-Wallis ANOVA gevolgd door testen nameting Dunn (*, p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001; ****, p Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vier muizen (2 reuen en 2 teven) werden humaan gedood en voorbereid voor autopsie op dag 0 voorafgaand aan infectie, als niet-geïnfecteerde controles te dienen. Bovendien werd één muis van elke kooi humane wijze gedood en voorbereid voor necropsie op dag 2, 4, 7 en 14 na prikkeling (Figuur 1A). Opsomming van C. difficile in de blindedarm inhoud werd uitgevoerd bij elke autopsie. In overeenstemming met fecale opsomming werd geen C. difficile gedetecteerd in de blindedarm inhoud van muizen voorafgaand aan de uitdaging met C. difficile. Na 48 uur na uitdaging werden muizen gekoloniseerd met ongeveer 10 8 CFU's van C. difficile per g cecal inhoud (figuur2A). Alle muizen bleef aanhoudend gekoloniseerd gedurende het experiment.
Blindedarm inhoud werd eveneens beoordeeld tijdens de infectie de aanwezigheid van C. difficile toxine behulp Vero cel cytotoxiciteit assay. Geen bewijs van C. difficile toxine cytotoxiciteit werd waargenomen in blindedarm inhoud voorafgaand aan de challenge (figuur 2B). C. difficile cytotoxiciteit werd waargenomen 2 dagen na de prikkeling met C. difficile sporen en bleef gedurende de infectie. Ondanks tamelijk uniform kolonisatie met C. difficile, verschillen in de hoogte van C. difficile cytotoxische activiteit is duidelijk in individuele muizen (Figuur 2B).
De meerderheid van de muis cecal inhoud geneutraliseerd met C. difficile antitoxin tijdens de Vero cel cytotoxiciteit assay en had geen bewijs van cytotoxiciteit (Vero cell afronding) in de verdunningen uitgevoerd. Echter, enkele individuele muizen, ondanks herkeuring, vertoonden tekenen van 50 - 100% cytotoxiciteit in de 10 -1 verdunning (verdunning waarbij het monster meest geconcentreerde), met geen bewijs van Vero cel afronding in de verdunning. Het antitoxine gebruikt in deze test is een neutraliserend polyklonaal antilichaam tegen C. difficile toxine, bereid in geiten 27. Daarom kan dit niet antitoxine C. difficile binaire toxine dat wordt geproduceerd door stam R20291 neutraliseren. Echter, de C. difficile toxine binaire niet cytotoxisch beschouwd 10 worden. Overmatige C. difficile toxine niet worden geneutraliseerd door de antitoxine of de aanwezigheid van een ander component dan C. difficile toxine kan bijdragen aan deze bevinding cytotoxisch middel. Deze waarneming heeft geen invloed op de bepaling van de cytotoxiciteit bepaling voor deze monsters, aangezien elk monster laatste verdunning met de 80% Vero celronding hadgeen bewijs van cytotoxiciteit in combinatie met de anti-toxine op de aangegeven verdunning.
Figuur 2: Kolonisatie van de blindedarm en cytotoxiciteit tijdens infectie met C. difficile R20291. A) Muizen CECA bleef aanhoudend gekoloniseerd met C. difficile gedurende het experiment, ondanks de resolutie van de klinische symptomen en de waargenomen gewichtstoename. Alle muizen werden gekoloniseerd met meer dan 10 8 CFU's per gram blindedarm inhoud wanneer beoordeeld op 2 dagen na challenge. B) Vero cel cytotoxiciteit assay van blindedarm inhoud gedurende infectie met C. difficile R20291. Na de challenge met C. difficile sporen, muizen hadden significante cytotoxiciteit, gemeten in log 10 reciproke verdunning van toxine per gram cecal inhoud op dagen 2, 4 en 7 na prikkeling vergeleken met dag 0 (mediaan Représented Door de lijn). Significantie werd bepaald door de niet-parametrische Kruskal-Wallis ANOVA gevolgd door testen nameting Dunn (*, p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001 ). Foutbalken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het wordt aanbevolen dat histologische evaluatie wordt uitgevoerd door een raad-gecertificeerde veterinaire patholoog in een geblindeerde wijze. Voor weefsel scoren, moet een 0-4 numeriek scoring systeem worden gebruikt om afzonderlijk oedeem, infiltratie van ontstekingscellen en epitheliale cellen schade op te nemen in de dunne darm, blindedarm, en de dikke darm op basis van een eerder gepubliceerd scoren regeling 17.
Bij verblind histopathologische examenzoek van het muizen ileum, caecum, colon en na prikkeling met C. difficile R20291 werden de belangrijkste pathologische veranderingen opgemerkt in de blindedarm (figuur 3). De totale blindedarmkeutels histologische scores waren significant verschillend tussen dag 0 en dag 2 en 4 post-challenge. Geen significante lesies werden waargenomen in de ileum gehele infectie (Figuur 3). Milder laesies opgemerkt in de dikke darm. De totale colon histologische scores waren significant verschillend tussen dag 0 en dag 2 en 7 na de prikkeling (figuur 3).
Representatieve H & E secties van het ileum, caecum en colon gedurende infectie in figuur 4. Elk beeld heeft het betrokken totale histologische score en individuele punten epitheliale beschadiging, ontsteking en oedeem, zoals bepaald door een geblindeerde-board gecertificeerde diergeneeskundige patholoog ( SAM).
Figuur 3: Histologische Scoring van het Muizen Ileum, blindedarm, en de dikke darm tijdens infectie met C. difficile R20291. Totaal histologische scores werden berekend door alle drie scores van de parameters beoordeeld: epitheliale beschadiging, ontsteking en oedeem. Geen significante histopathologische veranderingen werden waargenomen in het ileum gedurende infectie. Cecal weefsel bevatte de belangrijkste histologische lesies tijdens CDI. De totale blindedarmkeutels histologische scores waren significant verschillend van dag 0 op dag 2 en 4 post-challenge. Milder laesies opgemerkt in de dikke darm. De totale colon histologische scores waren significant verschillend van dag 0 op dag 2 en 7 post-challenge. Significantie werd bepaald door de niet-parametrische Kruskal-Wallis ANOVA gevolgd door testen nameting Dunn (*, p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01; *** p804; 0,001; ****, P ≤ 0,0001). Foutbalken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histopathologie tijdens infectie met C. difficile R20291. Dit paneel bevat representatief H & E secties van de dunne darm, blindedarm, en de dikke darm gedurende infectie met C. difficile R20291. De totale histologische scores tussen haakjes () voor de overeenkomstige dag en weefsel vermeld: het ileum dag 0 (0), dag 2 (1), dag 4 (0), dag 7 (0), en dag 14 (0) ; de blindedarm dag 0 (0), dag 2 (5), dag 4 (4), dag 7 (3), en dag 14 (3); en in de colon dag 0 (0), dag 2 (4), dag 4 (1), dag 7 (4), en dag 14 (2). Microfoto's werden verkregen op een lichte microscope met een 5 megapixel digitale camera en de bijbehorende software (de schaal balk geeft 200 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
| 0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 1 ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
| 96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
| 96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
| Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
| Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
| Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
| D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Distilled Water | Gibco | 15230 | |
| DMEM 1x Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
| NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
| PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
| Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
| Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
| Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
| Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5 - 8 weeks of age |
| Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
| DP27 camera | Olympus Life Science | ||
| cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
References
- Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
- Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
- Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
- Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
- Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
- Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
- Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
- Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
- Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
- Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
- Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
- Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
- He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787 (2013).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).
- Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).
- Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
- Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
- Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
- Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
- Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
- Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).
