Summary
Este protocolo descreve o modelo do rato cefoperazona de infecção por Clostridium difficile (CDI), utilizando uma estirpe clinicamente relevante e geneticamente-tratável, R20291. Ênfase na monitorização clínica da doença, C. difficile enumeração bacteriana, a citotoxicidade de toxinas, e alterações histopatológicas em todo CDI em um modelo de rato estão detalhadas no protocolo.
Introduction
Clostridium difficile é um anaeróbio,, bacilo formador de esporos gram-positivo que causa diarreia com risco de vida 1. Infecção por C. difficile (CDI) está associada com aumento da morbidade e mortalidade humana e resulta em mais de US $ 4,8 bilhões em custos de saúde por ano 1-4. Em 2013, os Centros de Controle e Prevenção de Doenças categorizados C. difficile como um risco de resistência a antibióticos urgente, indicando que ele representa uma ameaça urgente de saúde pública 1. Atualmente, o tratamento antibiótico com vancomicina e metronidazol são considerados o padrão de cuidado para CDI 5. Infelizmente, a recorrência de CDI após o sucesso do tratamento com antibióticos é elevada, ocorrendo em 20 - 30% dos pacientes 2,5-7. Portanto, a descoberta de novas terapias contra este agente patogénico entérico é necessário. Para avaliar terapêuticas contra a C. difficile, um modelo animal de uma aproximação da doença humana em ACestirpe linically relevante é necessária.
Inicialmente, os postulados de Koch foram estabelecidos para C. difficile em 1977 usando um modelo de hamster sírio tratados com clindamicina 8. Este modelo ainda é utilizado hoje para investigar os efeitos de toxinas C. difficile na patogênese 9,10. No entanto, CDI no modelo de hamster resulta em altas taxas de mortalidade e não harmoniza as manifestações de doenças crónicas insidiosas que pode ser visto em humanos com CDI 10,11. Com base na acessibilidade e reagente disponibilidade de plataformas de murino em pesquisa, um modelo de mouse CDI é relevante.
Em 2008, um modelo de ratinho robusta de CDI foi estabelecida tratando ratos com um cocktail de antibióticos em água potável (canamicina, a gentamicina, a colistina, metronidazol e a vancomicina) durante 3 dias, seguido de uma injecção intraperitoneal de 12 de clindamicina. Este ratos rendido suscetíveis a colite CDI e grave. Dependerdendo da dose de inoculo administrada, uma gama de sinais clínicos e letalidade pode ser observada usando este modelo. Desde essa altura, vários regimes de antibióticos que têm sido investigados alterar a microbiota intestinal murino, diminuindo a resistência à colonização ponto em que o C. difficile pode colonizar o tracto gastrointestinal (revisto em Best et al. E Lawley & Young) 13,14.
Mais recentemente, um amplo espectro de cefalosporina, cefoperazona, dada na água de beber durante 5 ou 10 dias reprodutível torna camundongos suscetíveis ao CDI 15. Uma vez que a administração de cefalosporinas de terceira geração estão associados com um risco aumentado de CDI em seres humanos, o uso do modelo de cefoperazona reflecte com mais precisão da doença 16 de ocorrência natural. Ratinhos susceptíveis a C. difficile tratados com cefoperazona foram desafiados com ambos os esporos de C. difficile e células vegetativas de uma variedade de estirpes que varia em clínicarelevância e virulência 17. Apesar de alguns dos estudos originais utilizando C. difficile células vegetativas como a forma infecciosa, esporos de C. difficile são considerados o principal modo de transmissão 18.
Na última década, C. difficile R20291, um NAP1 / BI / 027 tensão, surgiu, causando epidemias de CDI 19,20. Procurou-se determinar o curso clínico da doença quando os ratos tratados com cefoperazona foram desafiados com a estirpe de C. difficile clinicamente relevante e geneticamente-tratável, R20291. Este protocolo detalha o curso clínico, incluindo perda de peso, a colonização bacteriana, toxina da citotoxicidade, e alterações histopatológicas no tracto gastrointestinal dos ratinhos infectados com esporos de C. difficile R20291. Em geral, este modelo de rato revela-se uma plataforma experimental para o CDI aproximação doença humana. Este modelo de ratinho caracterizado pode assim ser utilizada para avaliar os efeitosde novas terapêuticas no melhoramento da doença clínica e no restabelecimento da colonização da resistência contra a C. difficile.
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Protocol
Declaração de ética:
O Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) na North Carolina State University College de Medicina Veterinária (NCSU) aprovou este estudo. O Animal Care NCSU e Usar política se aplica normas e diretrizes estabelecidas no Animal Welfare Act e Extensão Health Research Act de 1985. instalações para animais de laboratório na NCSU aderir às diretrizes estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Estados de saúde dos animais foram avaliados diariamente, e os animais moribundos eram humanamente eutanasiados por asfixia com CO2 seguido por medidas secundárias. Treinados técnicos de animais ou um veterinário realizada criação de animais em uma instalação AAALAC credenciados durante este estudo.
1. Administração do antibiótico Cefoperazone na água potável para alcançar Suscetibilidade a C. difficile Colonização e Doença
NOTAS: de 5 a 8 semanas de idade C57BL / 6 WT (fêmeas e machos)foram adquiridos e mantidos em quarentena durante uma semana antes de se iniciar a administração do antibiótico água. Após a quarentena, os ratos foram alojados com alimentos autoclavados, roupa de cama, e água. mudanças gaiola foram realizadas semanalmente por pessoal de laboratório em uma capela de fluxo laminar.
- Prepare cefoperazona (0,5 mg / ml) em água destilada estéril, 7 dias antes do dia do desafio alvo (Figura 1).
- Encher garrafas de água autoclavada com água cefoperazona (0,5 mg / ml) e colocá-los em cada gaiola mouse.
NOTA: água cefoperazona Recém-preparado deve ser feita e trocado a cada 2 dias, durante um período de 5 dias, conforme indicado nos passos 1.1 e 1.2. descarte adequado de água cefoperazona seguindo orientações de saúde e segurança ambiental institucionais é recomendado. - Após 5 dias na água cefoperazona, substituir as garrafas com garrafas de água autoclavada cheios de água destilada estéril. Dê ratos essa água para beber a duração da experiência.
2. Preparação do Inoculo esporo de C. difficile e a gavagem oral do Ratos
NOTA: Antes de começar, certifique-se de que os seguintes itens são colocados na câmara de anaerobiose durante pelo menos 24 horas: 1x tampão fosfato (PBS; veja Materiais), cycloserine taurocolato cefoxitina frutose agar (TCCFA) placas (ver Materiais e o arquivo suplementar ), e um difusor em forma de L estéril.
NOTA: Os ratos desafiados com esporos de C. difficile devem ser alojados em uma instalação de Nível de Biossegurança Animal 2.
- Obter um estoque de esporos de C. difficile a tensão desejada (neste caso, R20291), que foi preparado anteriormente e armazenadas a 4 ° C, em água estéril 21,22. Determinar a enumeração deste estoque de esporos antes do uso.
- Com base na concentração conhecida (esporos / ml) do banco de esporos, calcular a diluição desejada para se obter 10 5 esporos por 25 ul. Verifique se o volume de inóculo é suficiente para inocular todosratinhos na experiência (25 ul por rato), para realizar a contagem do inoculo (aproximadamente 30 ul), e para ter em conta erros de pipetagem.
- Vortex estoque original de esporos C. difficile. Em seguida, ressuspender o volume calculado (a partir do passo 2.2) do estoque original de esporos C. difficile em água estéril dentro de um tubo de microcentrífuga com tampa de rosca. Executar esta aerobicamente em uma capela de fluxo laminar. Identificar esta mistura diluída como o "inoculo de esporos."
- Colocar o inoculo de esporos em um banho de água a 65 ° C e aquecer durante 20 min.
NOTA: Este passo irá assegurar que os esporos de C. difficile única activos permanecem após o tratamento térmico. - Dentro da câmara de fluxo laminar, tomar 50 ul de inoculo de esporos aquecida, introduzi-la num tubo de microcentrífuga estéril, e passá-lo para a câmara anaeróbia 23. Utilize essa amostra para contagem de esporos.
- Dentro da capela de fluxo laminar, coloque o restante inóculo int esporos aquecidaoa seringa de 1 ml ligado a uma agulha gavage gástrica com ponta de lâmpada estéril. Utilizar um passo seringa manual para garantir repetição exata e rápida de dosagem entre camundongos. Certifique-se de que a agulha de gavagem é preenchido com o inoculo de esporos aquecida antes da sua utilização.
NOTA: Uma nova agulha de gavagem estéril para cada rato não é necessária. No entanto, se várias doses de esporos de C. difficile são administrados, uma nova agulha de gavagem é recomendado para cada dose.
NOTA: esporos de C. difficile são altamente resistentes a desinfetantes tradicionais. Portanto, a utilização de um desinfectante esporicida, tal como # 62 Perisept Esporicida desinfectante, é necessária. O fabricante recomenda um tempo de contacto de 2 min para destruir esporos de C. difficile. - Gavagem cada murganho com 25 uL do inoculo de esporos. Contenha cada rato com cuidado, segurando o animal pela pele solta do pescoço e nas costas, a fim de imobilizar a cabeça. Usando o dedo indicador imobilizar ainda mais a cabeça do animal ealongar o esôfago. Certifique-se que o animal não vocalizar ou mostrar outros sinais de sofrimento durante a imobilização.
NOTA: O volume total dado aos ratos por sonda não deve ser superior a 10 ml / kg de peso corporal (0,1 mL / 10 g). - Manter o rato numa posição vertical, vertical e suavemente passar a agulha de gavagem para o lado da boca. Direcionar a agulha gavage ao longo do céu da boca e lentamente avançar a agulha gavage para o esôfago.
NOTA: Se qualquer resistência é encontrada, a agulha gavage pode estar entrando na traquéia e, portanto, não deve ser avançado, mas sim removidos e reposicionados imediatamente. - Depois de a agulha de gavagem é aproximadamente a meio caminho para o esófago, injectar 25 ul do inoculo de esporos aquecida suavemente e retirar a agulha de gavagem a partir do esófago.
NOTA: avanço Forceful da agulha gavage pode levar à ruptura do esófago ou estômago. Portanto, se resistência ao avanço da agulha gavage, É melhor para remover e reposicionar a agulha gavage imediatamente. - Devolver o animal para sua gaiola e observá-lo para qualquer tosse ou sinais de desconforto respiratório, pois isso pode indicar administração traqueal acidental ou aspiração do inoculo de esporos aquecida.
NOTA: Os ratos são extremamente suscetíveis a C. difficile após o tratamento antibiótico; Portanto, precauções para evitar a contaminação cruzada entre as gaiolas é essencial. Isto é especialmente importante na gestão de camundongos tratados com antibióticos, mas não impugnadas como controles. - Depois de inocular todos os murganhos, colocar o restante inoculo de esporos aquecida em um tubo de microcentrífuga estéril e passá-lo para a câmara anaeróbica para a enumeração de esporos.
- Para enumeração de inoculo de esporos aquecida (a partir do passo 2.4) e os restantes inoculo de esporos aquecida tratadas por gavage, faça 1:10 diluições em série de cada inóculo em 1x PBS. Recomenda-se fazer e placa 4 - 5 diluições (ou seja, 10 -1 a10 -5).
- Utilizando uma técnica asséptica, transferir 100 ul de cada diluição em série numa placa de TCCFA indivíduo.
- Usando um espalhador estéril em forma de L, uniformemente distribuídos à diluição aplicada ao meio ao longo da placa. Mesmo espalhamento do inoculo diluiu é essencial para a contagem exacta de esporos.
- Incubar as placas anaerobicamente durante 24 h a 37 ° C. Após 24 h, C. unidades formadoras de colónias (CFUs) difficile podem ser enumerados para se obter a dose infecciosa administrado a ratinhos nos 25 ul (0,025 ml de volume) (ver o ficheiro suplementar "Exemplo Cálculos"). C. difficile colônias são planas e amarelo pálido e têm bordas irregulares e aspecto de vidro de 24.
NOTA: O limite de detecção para a enumeração bacteriana é de 10 2 UFC.
3. Monitoramento da perda do rato de peso e sinais clínicos de doença em todo C. difficile infecção
- pesar umanimals antes e após o tratamento com antibióticos de 5 dias cefoperazona, após a recuperação de 2 dias fora de antibióticos (dia 0), e, em seguida, para a duração da experiência.
NOTA: obter pesos de cada vez consistente a cada dia. Pesos obtido no dia de desafio (dia 0) deve ser usado como o peso de linha de base inicial para a comparação em toda a infecção por C. difficile. - Coloque uma balança digital em uma cabine de segurança biológica. Coloque um copo de plástico estéril para a balança e tarar o peso do copo de plástico. Em seguida, pegar suavemente o rato pela base da cauda e colocá-lo no copo de plástico.
- Colocar o copo de volta na escala. Passe a mão sobre a parte superior do recipiente para garantir que o mouse não escapa. Pode levar 2-3 segundos para se obter um peso estável. Em seguida, coloque delicadamente o mouse de volta para sua gaiola. Grave este peso e repita o processo para cada rato nessa jaula.
NOTA: É imperativo que sejam tomadas precauções para evitar cross-contaminação entre gaiolas quando a obtenção de pesos. Cada gaiola de ratos deve ter o seu próprio copo de plástico para a pesagem. Os copos de plástico devem ser desinfectados com um agente esporicida entre cada uso e coberto com papel de alumínio esterilizado.
- Colocar o copo de volta na escala. Passe a mão sobre a parte superior do recipiente para garantir que o mouse não escapa. Pode levar 2-3 segundos para se obter um peso estável. Em seguida, coloque delicadamente o mouse de volta para sua gaiola. Grave este peso e repita o processo para cada rato nessa jaula.
- Monitorizar os animais desafiados duas vezes por dia (no mínimo) para sinais de infecção por C. difficile clinicamente grave, incluindo letargia, perda de apetite, diarreia, e postura arqueada.
- Humanamente euthanize animais que perdem 20% do seu peso corporal inicial básica e / ou desenvolver sinais clínicos graves de infecção por C. difficile (listada no passo 3.3).
NOTA: os ratos que exibem sinais clínicos de infecção por C. difficile deve ser pesado conforme necessário durante a experiência para assegurar que eles não tenham perdido 20% do seu peso de linha de base inicial. Durante os momentos iniciais do experimento, isso pode significar medições duas vezes por dia.
4. Contagem Bacteriana de C. difficiledo mouse fezes e Conteúdo Cecal
NOTA: Antes de começar, certifique-se de que os seguintes itens são colocados na câmara de anaerobiose durante pelo menos 24 horas: 1x PBS (veja Materiais), placas TCCFA (veja Materiais), um espalhador estéril em forma de L, e microtubos estéreis e / ou placas PCR para diluições.
- Obtenção de amostras de C. difficile enumeração
NOTA: Antes de obter fezes ou conteúdo cecal, pesar microtubos estéreis em escala analítica. Registar o peso do tubo no lado do tubo, o arredondamento para quatro casas decimais (por exemplo, 0,9864 g). Denotar este peso como o "peso tubo." Cada uma das amostras colhidas deve ser colocado num tubo de microcentrífuga pesado estéril.- recolha estéril de fezes de rato
- Gentilmente conter cada rato, segurando o animal pela pele solta do pescoço e nas costas, a fim de imobilizar a cabeça. Use o dedo mindinho para conter delicadamente a cauda do animal, thus expondo o ânus. Certifique-se que o animal não vocalizar ou mostrar outros sinais de sofrimento durante a imobilização.
- Segurar, um tubo de microcentrífuga estéril pesado directamente sob ânus do animal. É imperativo que o tubo não entra em contato direto com o mouse.
- Como o animal defeca, recolher o sedimento fecal no interior do tubo. Manter o tubo à temperatura ambiente até que todas as amostras de fezes são recolhidas. Pode demorar alguns minutos para um mouse para defecar, necessitando, portanto, tentativas de repetição para recolher fezes.
- Pesar os tubos contendo as fezes na escala analítica. Grave o peso do tubo, o arredondamento para quatro casas decimais (por exemplo, 1,0021 g). Denotam o peso obtido como o "peso do tubo final."
- Passe as amostras fecais para a câmara anaeróbia para a enumeração de bactérias diretamente após a coleta de fezes.
- coleção estéril de conteúdo cecal do mouse no momento da necropsia
- Após a eutanásia humana por asfixia com CO 2, seguida por medidas secundárias, realizar uma necropsia obter o ceco 25. O ceco é a grande secção, em forma de vírgula do tracto gastrointestinal.
- Colocar o ceco para um prato Petri de plástico estéril. Use um não descartável, esterilizada. 10 lâmina de bisturi para cortar o ceco aberto a partir da extremidade cega da bolsa para expor o conteúdo cecal.
- Suavemente extrair os conteúdos cecais com uma ligeira pressão, com a lâmina de bisturi e varrer o conteúdo em direcção à porção de incisão no ceco.
NOTA: É preciso ter cuidado para não perturbar o tecido cecal, que será apresentado para exame histopatológico.
- Suavemente extrair os conteúdos cecais com uma ligeira pressão, com a lâmina de bisturi e varrer o conteúdo em direcção à porção de incisão no ceco.
- Coloque o conteúdo cecal em um tubo de microcentrífuga estéril, pesados imediatamente após a colheita. Apenas cerca de 10 mg de conteúdo cecal é necessária para a enumeração de bactérias.
- Pesar os tubos contendo conteúdo cecal na scal analíticae. Grave o peso do tubo, o arredondamento para quatro casas decimais (por exemplo, 1,0021 g). Denotam o peso obtido como o "peso do tubo final."
- Passar as amostras de conteúdo cecal na câmara anaeróbia para enumeração bacteriana.
- recolha estéril de fezes de rato
- Enumeração de bactérias de C. difficile
- Calcule o peso final dos conteúdos cecais fezes ou () que vai ser enumerados por C. difficile. Interpretada isso subtraindo o "peso do tubo final" do "peso do tubo."
- Calcular uma diluição dos conteúdos em 1X PBS 01:10 e ressuspender em conformidade. Para sedimentos fecais, utilizar a ponta da pipeta para interromper suavemente o sedimento em solução (ver o ficheiro suplementar "Exemplo Cálculos").
- Anaerobicamente incubar estas amostras suspensas de novo a temperatura ambiente durante 30 min, permitindo que o conteúdo de resolver.
- Faça diluições em série para cada amostra em 1x PBS para enumperação da CFU por g de conteúdo (fezes ou ceco). Executar esta via anaeróbia.
- Utilizando uma técnica asséptica, transferir 100 ul de cada diluição em série de placas TCCFA. Usando um espalhador estéril em forma de L, espalhar a diluição aplicada aos meios de comunicação para espalhar uniformemente ao longo da placa. Mesmo a diluição de espalhamento é essencial para a enumeração exacta das colónias.
- Incubar as placas anaerobicamente durante 24 h a 37 ° C. Neste momento, enumerar colónias de C. difficile para obter o CFU por grama de conteúdo cecal (ou fezes). C. difficile colônias são planas e amarelo pálido e têm bordas irregulares e aspecto de vidro de 24.
NOTA: Este protocolo pode ser utilizado para enumerar C. difficile de outros conteúdos GI murino, incluindo ileal e o conteúdo do cólon. placas de PCR pode ser usado para fazer diluições em série.
5. Vero celular Ensaio de citotoxicidade para quantificar C. difficile Toxina Cytotoxicidade
NOTA: Recomenda-se que este teste seja realizado após a conclusão do modelo de ratinho em amostras recolhidas na necropsia e armazenados a -80 ° C. As técnicas de cultura de células assépticas são essenciais para a prevenção de contaminação de células Vero durante este ensaio. Este protocolo demora 2 dias a executar. Todas as fezes e conteúdo intestinal utilizada neste ensaio devem ser armazenados em, um tubo de microcentrífuga estéril pesados (denotado com o "peso tubo", ver a secção acima). O peso do tubo final (incluindo o conteúdo) é medido por meio de uma balança analítica para as quatro casas decimais mais próximas (ver secção acima). A utilização de uma pipeta multi-canal é recomendado para este ensaio.
NOTA: Antes de começar, certifique-se de que os seguintes itens estão disponíveis: As células Vero, modificação de Dulbecco do meio de Eagle (DMEM) 1x com 10% de soro inativado pelo calor fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina media / estreptomicina (denotado como "DMEM 1x meios de comunicação; "ver Materiais e o arquivo suplementar), 0,25%Tripsina-EDTA, 1 x PBS, 0,4% de Azul de Tripano, uma cultura de células placa de fundo plano de 96 poços, uma placa de filtro de 96 poços, Clostridium difficile Toxina A (alíquota em 3 ul de 1 mg / mL em água ultra-pura e armazenar a -80 ° C), Clostridium difficile Antitoxin, uma planilha (para cálculos e mapas placa, ver arquivos suplementares).
NOTA: O cuidado deve ser tomado durante este ensaio para a exposição pessoal para C. difficile e sua toxina.
- Dividindo as células Vero (Dia 1)
- Pré-aqueça o meio DMEM 1x, 0,25% de tripsina-EDTA, e 1x PBS num banho de água a 37 ° C.
- Obter um frasco de células Vero a partir do incubador de cultura de células (37 ° C e 5% de CO 2) e colocá-la na cultura celular câmara de fluxo laminar estéril. Use 70% de etanol para limpar o capô e equipamentos antes do uso. Usando uma pipeta sorológica, aspirar a mídia a partir do balão de cultura de tecidos para removê-lo a partir de células Vero e descartá-lo em um desperdício container.
- Lavar as células Vero com 5 ml de PBS 1x (pré-aquecido) no frasco de cultura de tecidos. Aspirar o PBS e descartá-lo em um recipiente de resíduos.
- Adicionar 5 ml de 0,25% de tripsina-EDTA para o frasco de cultura de tecido. Permitir um tempo de contacto de 2-3 minutos. Durante este tempo, observar as células começam a sair da superfície do frasco. Agite suavemente lado garrafa de cultura do tecido a lado para soltar as células Vero.
- Após o tempo de contacto com tripsina-EDTA, imediatamente adicionar 5 ml de meio DMEM 1x para o balão de cultura de tecidos. Isto irá neutralizar a tripsina-EDTA. Utilizar esta solução para lavar suavemente as células Vero não acopladas fora da parte traseira do frasco. Em seguida, utilizar uma pipeta serológica para transferir esta mistura para um tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar as células Vero no tubo cónico durante 5 min a 180 xg e 25 ° C. Certifique-se de que a centrífuga está devidamente equilibrada. Após a centrifugação, observar um sedimento visível de células Vero, na parte inferior do tubo cónico. Tenha cuidado para não DISRUPT este pellet. Aspirar o sobrenadante do tubo cônico e descartá-lo.
- Ressuspender as células Vero em 3 ml de meio DMEM 1x.
- Contar as células Vero
- Adicionar 100 ul da suspensão de células Vero (feita no Passo 5.1.7) a 100 uL de 0,4% de Azul de Tripano. Misture suavemente pipetando a solução cima e para baixo.
- Adicionar 10 ul desta mistura para cada uma das câmaras de um hemocitómetro.
- Contar o número de células viáveis dentro dos quatro quadrantes do hemocitómetro. células Vero mortas vai ocupar o azul Trypan e, portanto, será manchada azul (estas células não deve ser contado). Registre estes números na "célula de planilha Vero," fornecido.
- Soma o número total de células viáveis Vero em todos os quatro quadrantes, e calcular a média. Multiplicar pelo factor de diluição, que é desde 2 a 100 ul de células estão em um total de 200 mL de líquido.
- Multiplicar pelo fator de correção para dar a "; número de células / ml "Quando se utiliza um hemocitómetro, o factor de correcção é sempre 10 4 multiplicar pelo volume total para se obter o." o número total de células. ".
- Determinar o número de poços necessários para cada experimento
NOTA: Uma única amostra (fezes ou conteúdo intestinal) requer 24 poços separados para serem realizadas em duplicado. Uma concentração de 10 5 células Vero por poço (volume total de 90 ul) é necessária.
NOTA: Se se deseja-se incubar as células Vero placas de 96 poços durante a noite a 37 ° C, numa concentração de 10 células Vero três por poço é recomendado para ter em conta o tempo de incubação prolongado. Cálculos dentro da célula de planilha Vero precisaria ser ajustado para ter em conta esta alteração.- Determinar o número de poços que podem ser utilizados com base na quantidade de células Vero disponíveis (do Passo 5.2; utilizar a folha de células Vero, fornecida).
- Determinar o volume desuspensão de células Vero necessário para encher o número de poços desejados (com base no número de amostras a serem testadas). Assegurar que qualquer volume adicional é adicionado à conta para a pipetagem de erro (use o Vero célula de planilha fornecida).
- Dilui-se a suspensão de células Vero (obtidas no passo 5.1.7) em meio DMEM 1x obter o volume requerido para a experiência.
- Células Vero em Sementeira de 96 poços de placa de cultura celular
- Usando a ressuspensão de células Vero a partir do passo 5.3.2, utilizar uma pipeta multi-canal para adicionar 90 uL da suspensão de células Vero a cada poço de uma placa de cultura de células de fundo plano de 96 poços.
- Incubar a placa com as células Vero num incubador de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante um período mínimo de 4 horas antes da adição de toxina (amostras) aos poços. Este tempo de incubação irá permitir que as células Vero a aderir ao fundo de cada poço.
- Criação de soluções de Stock das amostras (fezes ouConteúdo intestinal)
NOTA: Todas as amostras devem ter o "peso tubo" e "peso tubo final" medido através de uma balança analítica. Use Vero Planilha celular para os cálculos.- Calcule o peso do conteúdo. Converter g de Mg, então mg a ul. Calcular o número total final de ul de solução necessária para obter uma diluição de 1:10 em PBS 1x. Calcula-se a quantidade total de 1x PBS para adicionar à amostra.
- Adicionar o volume total de 1x PBS (calculado acima) para a amostra. Executar esta aerobicamente, e usando uma técnica asséptica. Para sedimentos fecais, utilizar a ponta da pipeta para perturbar o sedimento suavemente para dentro da solução.
- Agitar as amostras e em seguida, centrifuga-los a 3522 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Certifique-se de que a centrífuga está devidamente equilibrada. Tenha cuidado para não perturbar o pellet e ressuspender a amostra em solução.
NOTA: Durante o Passo 5.5.3, se apenas algumas amostras estão sendo processados, o conteúdo pode ser esterilizado porpassando-os através de um único filtro de 0,22 uM em vez de usar uma placa de filtro de 96 poços. Algumas amostras podem exigir vários filtros para esterilizar todo o conteúdo do volume usando esta técnica. - Esterilizar a mistura amostra / PBS por tratamento com 150 ul de sobrenadante e colocando-o em poços separados de uma placa de filtro de 96 poços. Colocar a placa de filtro de forma segura em cima de uma placa de cultura de células de fundo plano de 96 poços de modo a que o seu conteúdo seja filtrar para esta placa.
- Centrifugar a pilha de cultura em placa de filtro de placa / célula a 431 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Certifique-se de que a centrífuga está devidamente equilibrada e que o / célula pilha de cultura em placa de placa de filtro estão fortemente alinhados e não vai mudar durante a centrifugação.
NOTA: Estes conteúdos filtrados são o estoque 10 -1 que irá ser utilizado nas placas de diluição. - Coloque placa com amostras filtradas em gelo.
- Criação de diluição em placa de # 1
NOTA: A diluição Plate # 1 (DP # 1) exigirá 6 poços por amostra, incluindo positivo (C. difficile Toxina A) e controles negativos (1x PBS) (ver a DP # 1 layout na célula de planilha Vero).- Para preparar o controlo positivo (C. difficile Toxina A) para este ensaio, obter-se alíquotas de 3 ul (1 ug / uL) de -80 ° C e adicionar 297 ul de água ultrapura, dando origem a uma concentração final de 0,01 ug / uL. Coloque no gelo.
- Rotular os poços com as diluições (10 -1 a 10 -6) para cada amostra e indicam os controlos positivos e negativos (ver o esquema 1 # DP).
- Adicionar quantidades apropriadas de 1x PBS a cada poço. Nos 10 -1 poços, adicione NO PBS. Para os 10 -2 a -6 10 poços, adicionar 90 ul de 1x PBS.
- Adicionar quantidades apropriadas de amostras para cada cavidade. Nos 10 -1 poços, adicionar 100 ul do estoque 10 -1 para cada amostra (ver Passo 5.5.7 do plat filtroe). Para os 10 -2 a -6 10 poços, fazer diluições em série; começar por dar 10 uL da 10 -1 bem e adicionando-a a 10 -2 bem. Continuar as diluições em série para a diluição de 10 -6.
- Cubra o DP # 1 prato com um selo adesivo plástico transparente e colocá-lo em gelo.
- Criação de diluição em placa de # 2
NOTA: Placa de Diluição (DP # 2) exigirá 2 pistas de 6 poços para cada amostra, incluindo os controlos positivos e negativos (ver o layout DP # 2 na célula de planilha Vero).- Rotular os poços com as diluições (10 -1 a 10 -6) para cada amostra e indicam os controlos positivos e negativos (ver o esquema DP # 2). Rotular os poços com o nome da amostra (indicado como "poços de amostra") ou o nome da amostra com antitoxina (indicado como "poços") antitoxina.
- Calcula-se a quantidade de anti-toxina necessária para este ensaio. NOTA: A antitoxina é um estoque de 25xsolução que tem de ser diluído 1:25 em PBS 1x. Coloque a solução de antitoxina 1x preparada no gelo.
- Para os "poços de amostra", adicionar 20 ul de 1x PBS a cada poço para todas as diluições (10 -1 a 10 -6) da referida amostra. Para os "poços de antitoxina", adicionar 20 ul de 1x antitoxina a cada poço para todas as diluições (10 -1 6 a 10) da referida amostra.
- Transferir 20 ml da amostra diluída em poços de DP # 1 nos poços designados na DP # 2 para as linhas 1 - 6 e linhas 7 - 12 (ver o layout DP # 2 na célula de planilha Vero). Misturar a solução suavemente pipetando cima e para baixo.
- Cubra DP # 2 com um selo adesivo plástico transparente e permitir 40 min de incubação à temperatura ambiente. Esta incubação é permitir a antitoxina para se ligar e assim inactivar e neutralizar a toxina de C. difficile.
- Após a incubação, adicionar 10 ul de mistura de DP # 2 aos poços apropriados de células vero (ver o esquema da placa celular Vero na Vero Planilha celular). Misturar suavemente a solução pipetando para cima e para baixo, tendo o cuidado de não perturbar as células Vero que estão aderidos à superfície de fundo dos poços.
- Incubar a placa de células Vero durante a noite numa incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Avaliar células Vero para o arredondamento usando um microscópio de luz (dia 2)
NOTA: Recorde-se que o factor de diluição alterações por um factor de 10 quando a adição das misturas de amostra para a placa de células Vero (por exemplo, 10 -3 10 -4 é agora). Wells que têm antitoxina presente deve ter pouco ou nenhum arredondamento de células Vero observou. Arredondamento de células Vero (citotoxicidade) será anotado em amostras que contêm C. toxina difficile. Se a actividade citotóxica é neutralizado numa diluição que contém a amostra e a antitoxina, a presença da toxina C. difficile resultando em citotoxicidade de células Vero é confirmada.- Examine para arredondamento de células Vero usando um light microscópio a uma ampliação de 200X. Para poços de amostras (incluindo o controlo positivo), gravar a diluição do poço que é o último a ter 80% de arredondamento celular Vero observado.
- Calcula-se a título de citotóxico, que é definido como o recíproco da diluição mais elevada que produziu 80% de células Vero arredondamento por g de amostra. Por exemplo, se a diluição mais elevada é 10 -5, em seguida, o factor de diluição, pelo menos, 10 -6 para esta amostra. Assim, o log [factor de diluição final] / g de amostra seria log [6 10], o que produz um título recíproco de 6.
NOTA: As células Vero precisa ter sofrido, pelo menos, 3 - 4 passagens e não mais do que 30 passagens antes da sua utilização neste ensaio de 26.
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Representative Results
Durante um estudo representativo, com 5 semanas de idade C57BL / 6 murganhos WT foram pré-tratados com cefoperazona na sua água de beber (0,5 mg / ml) durante 5 dias e deixados a 2 dias lavar com água de beber. Os ratinhos foram desafiados com 10 5 esporos de C. difficile R20291 através de sonda oral no dia 0 (Figura 1A). Os ratinhos foram monitorizados para a perda de peso e sinais clínicos (letargia, inapetência, diarréia e postura arqueada) do CDI durante 14 dias. O desafio de ratinhos C57BL / 6 WT com esporos de C. difficile R20291 resultou em diarreia no período de 24 h e a perda de peso significativa dentro de 48 horas pós-desafio (Figura 1B). Apesar de não ser observada nesta experiência, os ratinhos desafiados com uma dose mais elevada de C. difficile R20291 pode tornar-se gravemente doentes ou que tenham mais do que 20% de perda de peso por 48-72 h pós-desafio, necessitando assim a eutanásia humana. Portanto, os ratinhos requerem um mínimo de duas vezes por diaacompanhamento após o desafio com esporos de C. difficile.
Neste estudo representativo, uma quantidade significativa de perda de peso e sinais clínicos de doença em ratos também foi observada nos dias 2-7 após o desafio (Figura 1B). Aos 7 dias após o desafio, os ratos começaram a ganhar peso e sinais clínicos da doença diminuiu. Na última semana do experimento, os ratos pareciam clinicamente normal, sem evidência de sinais clínicos de CDI, incluindo diarreia.
Pastilhas fecais foram recolhidas antes do desafio com esporos de C. difficile e todas as 48 h pós-desafio (Figura 1C). Antes do tratamento com antibióticos, os ratos não foram colonizados com C. difficile. Dentro de 24 horas após o desafio com esporos de C. difficile, os ratos foram colonizadas com 10 7 UFC de C. difficile por grama de fezes (Figura 1C </ Strong>). Os ratos permaneceram persistentemente colonizados com C. difficile ao longo da experiência, apesar de não haver evidência de perda de peso ou sinais clínicos de CDI para os últimos 7 dias da experiência.
Figura 1: cefoperazona ratinhos tratados desafiados com C. difficile R20291 Perda de exposições de peso e são colonizados com C. difficile. A) 5-semanas de idade C57BL / 6 murganhos WT JAX (n = 3M / 3F por grupo) foram pré-tratados com cefoperazona na sua água de beber (0,5 mg / ml) durante 5 dias e permitidos a 2 dias lavar com a ingestão regular água. Os ratinhos foram desafiados com 10 5 esporos de C. difficile R20291 através de sonda oral no dia 0. Os ratinhos foram monitorizados quanto a perda de peso e sinais clínicos (letargia, inapetência, diarreia, e postura arqueada) de CDI durante 14 dias. As fezes foram recolhidos e utilizados para a enumeração de bactérias antes de se iniciar cefoperazona, imediatamente after terminar o antibiótico, e nos dias 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13 e 14 ao longo de infecção. A necropsia foi realizada nos dias 0, 2, 4, 7 e 14. B) Os ratos perderam uma quantidade significativa do seu peso inicial após desafio com C. difficile R20291. O peso corporal médio dos murganhos foi medido diariamente desde o dia 0. perda de peso significativa foi observada nos dias 2 a 7, quando comparado com dia 0, o peso de base. A carga bacteriana C) de C. difficile R20291 nas fezes após o desafio. Dentro de 24 horas após o desafio com esporos de C. difficile, todos os ratinhos foram colonizadas com 10 7 CFU (unidades formadoras de colónias) por grama de fezes. Não foram observadas diferenças significativas nestes parâmetros entre fêmeas e machos. A significância foi determinada pelo one-way ANOVA de Kruskal-Wallis não paramétrica seguida por pós-teste de Dunn (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001; ****, p Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quatro ratinhos (2 machos e 2 fêmeas) foram sacrificados humanamente e preparado para necropsia no dia 0, antes da infecção, para servir como controlos não infectados. Além disso, um rato de cada gaiola foi humanamente eutanasiados e preparado para necropsia nos dias 2, 4, 7 e 14 pós-desafio (Figura 1A). Enumeração de C. difficile no conteúdo cecal foi realizada em cada necropsia. Em concordância com a enumeração fecal, não de C. difficile foi detectado no conteúdo cecal de ratinhos antes do desafio com C. difficile. Em 48 horas após o desafio, os ratos foram colonizados com aproximadamente 10 8 UFC de C. difficile por grama de conteúdo cecal (Figura2A). Todos os ratos permaneceram persistentemente colonizado durante todo o experimento.
Conteúdo cecal foi também avaliada em toda a infecção para a presença da toxina do C. difficile utilizando o ensaio de citotoxicidade de células Vero. Não há provas de citotoxicidade C. difficile toxina foi detectada em conteúdos cecais, antes do desafio (Figura 2B). C. difficile citotoxicidade foi detectado 2 dias após o desafio com esporos de C. difficile e persistiram ao longo da infecção. Apesar de colonização relativamente uniforme com C. difficile, variação nos níveis de C. difficile actividade citotóxica é evidente em ratinhos individuais (Figura 2B).
A maior parte do conteúdo cecal rato neutralizado com C. difficile antitoxina durante o ensaio de citotoxicidade de células Vero e não tinha nenhuma evidência de citotoxicidade (Vero cell arredondamento) nas diluições executadas. No entanto, alguns ratinhos individuais, apesar de um novo ensaio, tinham evidência de 50 - 100% de citotoxicidade no 10 -1 de diluição (de diluição em que a amostra é mais concentrado), com nenhuma evidência de células Vero arredondamento nas outras diluições. A antitoxina utilizada neste ensaio é um anticorpo policlonal neutralizante de toxina de C. difficile, preparado em cabras 27. Portanto, este anti-toxina não pode neutralizar a toxina binária C. difficile que é produzido pela estirpe R20291. No entanto, a toxina de C. difficile binário não é considerada citotóxica 10. Excesso de toxina de C. difficile incapaz de ser neutralizado pela antitoxina ou a presença de um outro agente citotóxico que não seja C. toxina difficile pode estar a contribuir para esta descoberta. Esta observação não afecta a determinação do título de citotoxicidade para estas amostras, desde a última diluição de cada amostra com o arredondamento celular Vero 80% tinhanenhuma evidência de citotoxicidade quando combinado com a antitoxina na diluição especificado.
Figura 2: Colonização do ceco e citotoxicidade durante a infecção com C. difficile R20291. A) ceca ratos permaneceu persistentemente colonizados com C. difficile durante todo o experimento, não obstante a resolução dos sinais clínicos e ganho de peso observado. Todos os ratinhos foram colonizados com maior do que 10 8 CFU por grama de conteúdo cecal quando avaliada em 2 dias pós-desafio. B) ensaio de citotoxicidade de células Vero a partir do conteúdo cecal em toda a infecção com C. difficile R20291. Após o desafio com esporos de C. difficile, ratinhos tinha níveis significativos de citotoxicidade, tal como medidos no registo 10 de diluição recíproca da toxina por g do conteúdo cecal nos dias 2, 4, e 7 pós-desafio em relação ao dia 0 (medianas Représented pela linha). A significância foi determinada pelo one-way ANOVA de Kruskal-Wallis não paramétrica seguida por pós-teste de Dunn (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001 ). As barras de erro representam os desvios padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Recomenda-se que a avaliação histológica é conduzida por um patologista veterinário credenciado de forma cega. Para marcar o tecido, um sistema de pontuação numérica 0-4 devem ser empregues separadamente para avaliar o edema, infiltração de células inflamatórias, e danos em células epiteliais no íleo, ceco e cólon com base em um esquema de pontuação previamente publicado em 17.
Ao exame histopatológico cegominação do íleo, ceco e cólon após desafio com C. difficile murino R20291, as mais significativas foram notadas alterações patológicas no ceco (Figura 3). As pontuações histológicas cecais total foi significativamente diferente entre o dia 0 e nos dias 2 e 4 pós-desafio. Sem lesões significativas foram notadas no íleo ao longo infecção (Figura 3). lesões leves foram observadas no cólon. As pontuações histológicas do cólon totais foram significativamente diferentes entre dia 0 e nos dias 2 e 7 após o desafio (Figura 3).
Seções representante H & E do íleo, ceco e cólon em todo infecção estão disponíveis na Figura 4. Cada imagem tem sua respectiva pontuação histológica total e pontuações individuais para dano epitelial, inflamação e edema, conforme determinado por um patologista veterinário credenciado cego ( SAM).
Figura 3: A pontuação histológica da Murino íleo, ceco e cólon durante a infecção com C. difficile R20291. pontuações histológicas totais foram calculados através da adição de todos os três pontuações dos parâmetros avaliados: epitelial dano, inflamação, e edema. Não ocorreram alterações histopatológicas significativas foram notadas no íleo ao longo da infecção. tecido Cecal continha as lesões histológicas mais significativas durante o CDI. Os escores histológicos cecais totais foram significativamente diferentes do dia 0 nos dias 2 e 4 pós-desafio. lesões leves foram observadas no cólon. As pontuações histológicas do cólon totais foram significativamente diferentes do dia 0 nos dias 2 e 7 após o desafio. A significância foi determinada pelo one-way ANOVA de Kruskal-Wallis não paramétrica seguida por pós-teste de Dunn (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p804; 0,001; ****, P ≤ 0,0001). As barras de erro representam os desvios padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Histopatologia durante a infecção com C. difficile R20291. Este painel contém secções representativas H & E de íleo, ceco e cólon em toda a infecção com C. difficile R20291. Os escores histológicos totais estão em parênteses () para o dia e tecidos listados correspondente: para o dia íleo 0 (0), dia 2 (1), dia 4 (0), dia 7 (0), e no dia 14 (0) ; ceco para o dia 0 (0), dia 2 (5), quatro dias (4), no dia 7 (3), e no dia 14 (3); e para o cólon dia 0 (0), dia 2 (4), Dia 4 (1), no dia 7 (4), e no dia 14 (2). Microfotografias foram obtidas em um microscop luze com uma câmera digital de 5 megapixels e seu software de acompanhamento (a barra de escala representa 200 mm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
| 0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 1 ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
| 96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
| 96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
| Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
| Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
| Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
| D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Distilled Water | Gibco | 15230 | |
| DMEM 1x Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
| NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
| PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
| Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
| Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
| Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
| Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5 - 8 weeks of age |
| Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
| DP27 camera | Olympus Life Science | ||
| cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
References
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