Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי Published: December 10, 2016 doi: 10.3791/54850
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר את מודל עכבר cefoperazone של זיהום difficile Clostridium (CDI) באמצעות זן קליני רלוונטי וגנטי-צייתן, R20291. דגש על ניטור מחלה קליני, פקידת חיידקי C. difficile, cytotoxicity רעלן, ושינויי histopathological ברחבי CDI במודל של עכברים מפורטים בפרוטוקול.

Introduction

Clostridium difficile הינו אנאירובי, חיובי-גרם, חיידק יוצרי נבגים שגורמת מסכני חיים שלשולים 1. C. difficile זיהום (CDI) קשור לתחלואה אנושית מוגדלת ותמותה ותוצאות בלמעלה מ -4.8 מיליארדים $ בעלויות בריאות בשנה 1-4. בשנת 2013, המרכז לבקרת מחלות ומניעתן מסווג difficile ג כסיכון עמידות לאנטיביוטיקה דחוף, המציין כי זה מהווה איום דחוף בריאות הציבור 1. נכון לעכשיו, טיפול אנטיביוטי עם vancomycin ו metronidazole נחשבים רמת הטיפול CDI 5. למרבה הצער, ישנות CDI לאחר טיפול מוצלח באנטיביוטיקה הן גבוהות, המתרחשות 20 - 30% מהחולים 2,5-7. לכן, הגילוי רפוי רומן נגד הפתוגן מעיים זה הכרחי. כדי להעריך רפויים נגד C. difficile, במודל חית מתקרבות מחל אדם aclinically רלוונטי זן הוא זקוק.

בתחילה, העיקרים של קוך הוקמו difficile ג בשנת 1977 תוך שימוש במודל אוגר סורי שטופלו קלינדמיצין 8. מודל זה עדיין משמש כיום כדי לחקור את ההשפעות של רעלים C. difficile על בפתוגנזה 9,10. עם זאת, CDI במודל אוגר תוצאת שיעורי תמותה גבוהים ואינו להיות קרוב ככל האפשר גילויי מחלה הפנימיים הכרוניים שניתן הנצפים באנשים לוקים 10,11 CDI. בהתבסס על הזמינות והנגישות מגיבה של פלטפורמות murine במחקר, במודל של עכברים של CDI רלוונטי.

בשנת 2008, במודל של עכברים חזק של CDI הוקם על ידי טיפול בעכברים עם קוקטייל אנטיביוטי במי שתייה (kanamycin, גנטמיצין, colistin, metronidazole, ו ונקומיצין) במשך 3 ימים ואחריו זריקת intraperitoneal של קלינדמיצין 12. עכברים שניתנו זה רגיש קוליטיס CDI והחמור. לִסְמוֹךing על מינון הבידוד מנוהל, מגוון של שלטים קטלניים קליניים ניתן לצפות באמצעות מודל זה. מאז הפעם, משטרי אנטיביוטיקה שונים נחקרו המשנים את החיידקים במעיים בעכברים, הפחתת התנגדות קולוניזציה עד לנקודה שבה C. difficile יכול ליישב את מערכת העיכול (הנסקרת ב Best et al. ו Lawley אנד יאנג) 13,14.

לאחרונה, צפלוספורין קשת רחבה, cefoperazone, בהתחשב במי השתייה במשך ימים 5 או 10 הופך reproducibly עכברים רגישים 15 CDI. מאז ממשל של צפלוספורינים מהדור השלישי קשורים עם סיכון מוגבר של CDI בבני אדם, השימוש במודל cefoperazone משקף באופן מדויק יותר טבעיים המתחוללים המחלה 16. Cefoperazone שטופל עכברים רגישים difficile ג כבר אתגר בשני נבגי C. difficile ותאי וגטטיבי של מגוון רחב של זנים החל קליניהרלוונטיות ארסיות 17. למרות חלק מהמחקרים המקוריים ניצול תאי צמח C. difficile כצורה זיהומיות, נבגי difficile ג נחשבים במצב העיקרי להעברת מחלה 18.

בעשור האחרון, C. difficile R20291, זן NAP1 / BI / 027, התפתח, גרימת מגיפות של 19,20 CDI. אנחנו בקשנו לקבוע את המסלול הקליני של מחלה, כאשר עכברים שטופל cefoperazone הותקפו עם הזן קליני הרלוונטי וגנטי-צייתן C. difficile, R20291. פרוטוקול זה מפרט את המהלך הקליני, כולל ירידה במשקל, קולוניזציה חיידקית, cytotoxicity רעלן, ושינויים histopathological במערכת העיכול של עכברים תיגר עם נבגים R20291 C. difficile. בסך הכל, מודל העכבר הזה מוכיח להיות פלטפורמה ניסיונית ערך עבור CDI המתקרבות מחלות אנושיות. ולכן יכול להיות מנוצל במודל עכבר מאופיין זה, לאמוד את השפעתושל הרפוי רומן על השיפור של מחלה קלינית ועל השיקום של התנגדות קולוניזציה נגד difficile ג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרה אתית:
הטיפול בבעלי החיים המוסדי ועדת השימוש (IACUC) במכללת צפון קרוליינה סטייט לרפואת וטרינרית (NCSU) אשרה את המחקר הזה. טיפול בבעלי חיים NCSU ושימוש מדיניות חל תקנים והנחיות שנקבעו הרחבה מחקר חוק צער בעלי-חיים ובריאות משנת 1985. מתקנים בעלי חיים במעבדות בעמותת NCSU פועלים על פי ההנחיות שנקבעו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. סטטוסי בריאות החיה הוערכו יומי, ובעלי חיים גוססים היו מורדמים אנושיים בחנק CO 2 ואחריו אמצעים משניים. טכנאי חיה מאומנים או וטרינר בצעו בעלי חיים במתקן AAALAC-מוכר במסגרת מחקר זה.

מנהל 1. של Cefoperazone האנטיביוטי במי שתייה כדי להשיג רגישות C. difficile קולוניזציה מחלות

הערות: 5 עד 8 שבועות בן C57BL / 6 עכברים WT (נשים וגברים)נרכשו בהסגר במשך 1 שבוע לפני תחילת ממשל מים לאנטיביוטיקה. בעקבות הסגר, העכברים שוכנו עם מזון autoclaved, מצעים, ומים. שינויי קייג בוצעו שבועיים על ידי צוות המעבדה במנדף זרימה למינרית.

  1. כן cefoperazone (0.5 מ"ג / מיליליטר) במים מזוקקים סטריליים 7 ימים לפני היום הממוקד של אתגר (איור 1).
  2. מלאו בקבוקי מים autoclaved במים cefoperazone (0.5 מ"ג / מ"ל) ומניחים אותם בכלוב אחד העכבר.
    הערה: טריויות מי cefoperazone צריכים להיעשות ושינו את כל 2 ימים במהלך תקופה של 5 ימים, כפי מסומן בצעדים 1.1 ו -1.2. לסילוק נאות של מי cefoperazone העמידים בהנחיות בריאות הסביבה ובטיחות מוסדיות מומלץ.
  3. לאחר 5 ימים על מי cefoperazone, להחליף את הבקבוקים עם בקבוקי מי autoclaved מלאי מים מזוקקים סטריליים. תן עכברים מי שתייה זה עבור כל תקופת הניסוי.

2. הכנת בידוד C. difficile Spore ואת Gavage האוראלי של העכברים

הערה: לפני תחילת, להבטיח כי הפריטים הבאים ממוקמים בתא אנאירובי במשך שעה 24 לפחות: פוספט שנאגרו 1x מלוחים (PBS; ראה חומרים), אגר cefoxitin פרוקטוז taurocholate cycloserine (TCCFA) צלחות (ראה חומרים והקובץ משלימה ), ו מפזר בצורה סטרילי.

הערה: עכברים תיגר עם נבגים C. difficile צריך להיות שוכנו במתקן חיה בטיחות ביולוגית רמה 2.

  1. השג מלאה נבג C. difficile של המתח הרצוי (במקרה זה, R20291) שהוכן קודם לכן ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במים סטריליים 21,22. קבע את הספירה של מלאי נבג זה לפני השימוש.
  2. בהתבסס על הריכוז הידוע (מיליליטר / נבגים) של מניית הנבג, לחשב את הדילול הרצוי כדי להשיג 10 5 נבגים לכל 25 μl. ודא נפח הבידוד מספיק כדי לחסן את כלעכברים בניסוי (25 μl לכל עכבר), לבצע ספירה של הבידוד (כ 30 μl), ולפצות על שגיאה pipetting.
  3. וורטקס מניות C. difficile הנבג המקורי. לאחר מכן, resuspend הנפח המחושב (משלב 2.2) של מניית C. difficile הנבג המקורית במים סטריליים בתוך צינור microcentrifuge בורג הכתיר. בצע זה אירובי במנדף זרימה למינרית. זהה תערובת מדוללת זה כמו "בידוד הנבג."
  4. מניחים את הבידוד נבג לתוך אמבט מים 65 ° C ומחממים אותו במשך 20 דקות.
    הערה: צעד זה יבטיח כי רק נבגים פעילים C. difficile להישאר לאחר הטיפול בחום.
  5. בתוך מכסה מנוע הזרימה למינרית, לקחת 50 μl של בידוד נבג מחומם, למקם אותו צינור microcentrifuge סטרילי, ולהעביר אותו לתוך תא אנאירובי 23. השתמש מדגם זה עבור ספירת נבג.
  6. בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית, לטעון את int הבידוד מחוממת נבג הנותריםOA 1 מ"ל מזרק מצורף מחט gavage קיבה סטרילי שקצהו הנורה. לנצל צעד מזרק ידני על מנת להבטיח חוזרים מדויקים ומהירים מינון בין עכברים. ודא כי מחט gavage מתמלאת בידוד הנבג המחומם לפני השימוש.
    הערה: מחט gavage סטרילי חדש עבור כל עכבר אינו נדרש. עם זאת, אם במינונים שונים של נבגי difficile ג מנוהלים, מחט gavage חדשה מומלצת עבור כל מנה.
    הערה: נבגי difficile ג עמידות מאוד בפני חומרי חיטוי מסורתיים. לכן, השימוש חיטוי sporicidal, כגון # 62 Perisept Sporicidal חיטוי, הוא הכרחי. היצרן ממליץ זמן מגע 2-דקות להרוס נבגי difficile ג.
  7. Gavage כל עכבר עם 25 μl של בידוד הנבג. לרסן כל עכבר בעדינות ידי אחיזת החיה על ידי העור הרפוי של בצוואר ובגב כדי לשתק את הראש. באמצעות האצבע נוספת לשתק את הראש של החיה וכדילהאריך את הוושט. להבטיח כי בעל החיים לא לנקד או להראות סימנים אחרים של מצוקה במהלך איפוק.
    הערה: הנפח הכולל ניתנה לעכברים ידי gavage לא יעלה על 10 מ"ל / ק"ג משקל גוף (0.1 מ"ל / 10 ז).
  8. לשמור על העכבר בתנוחה זקופה, אנכית בעדינות להעביר את מחט gavage לתוך הצד של הפה. כוונו את המחט gavage לאורך הגג של הפה לקדם את המחט gavage לאט לתוך הוושט.
    הערה: אם כל התנגדות הוא נתקל, מחט gavage ניתן להיכנס לתוך קנה הנשימה וכך לא צריך להיות מתקדמת, אלא מוסר מיקומו מייד.
  9. לאחר מחט gavage היא בערך באמצע הדרך אל הוושט, להזריק 25 μl של בידוד הנבג המחומם לשלוף את מחט gavage בעדינות מן הוושט.
    הערה: קידום תקיף של המחט gavage עלול להוביל לקרע של הוושט או הקיבה. לכן, אם ההתנגדות הוא נתקל כאשר קידום המחט gavage, עדיף להסיר לאלתר למקם את המחט gavage.
  10. מחזיר את החיה לכלוב שלה ולבחון בו לכל שיעול או סימני מצוקה נשימתית, כמו זה עשוי להצביע על ממשל קנה נשימה בשוגג או שאיפה של בידוד הנבג המחומם.
    הערה: עכברים רגישים מאוד difficile ג בעקבות טיפול אנטיביוטי; ולכן, אמצעי זהירות כדי למנוע זיהום צולב בין הכלובים חיוניים. זה חשוב במיוחד בעת ניהול עכברים אנטיביוטיים שטופל אך ללא עוררין כקבוצת ביקורת.
  11. לאחר ייחס כל העכברים, למקם את בידוד הנבג המחומם הנותר לתוך צינור microcentrifuge סטרילי ולהעביר אותו לתוך התא אנאירובי עבור ספירת נבג.
  12. עבור ספירה של בידוד הנבג המחומם (משלב 2.4) ואת בידוד הנבג המחומם נותרי gavaged, לעשות דילולי 1:10 סידוריים של כל בידוד ב 1x PBS. מומלץ לעשות צלחת 4 - 5 דילולים (כלומר, 10 -1 דרך10 -5).
  13. באמצעות טכניקה האספטי, להעביר 100 μl של כל דילול סדר לצלחת TCCFA פרט.
  14. באמצעות מפזר בצורה סטרילי, שווה להפיץ את הדילול להחיל את המדיום על פני הצלחת. גם הפצת הבידוד בדילול חיונית הספירה המדויקת של נבגים.
  15. דגירת הצלחות אנארובי למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, יחידות המושבה יוצרי difficile ג (CFUs) אפשר למנות להשיג את המינון זיהומיות מנוהל על עכברים ב -25 μl (0.025 מ"ל) נפח (ראה קובץ משלים "חישובים דוגמה"). מושבות difficile ג הן שטוחות צהובות בהירות, יש קצוות לא סדירים מראה זכוכית גרוסה 24.
    הערה: המגבלה של זיהוי עבור ספירת חיידקים היא 10 2 CFU.

3. ניטור עכבר הרזיה וסימנים קליניים של מחלה ברחבי C. difficile זיהום

  1. שוקלnimals לפני ואחרי הטיפול האנטיביוטי 5 הימים cefoperazone, לאחר התאוששות 2-יום החופש של אנטיביוטיקה (היום 0), ולאחר מכן עבור כל תקופת הניסוי.
    הערה: קבל משקולות בכל פעם עקבית בכל יום. משקולות השיגו את יום האתגר (יום 0) אמור לשמש כמשקל הבסיס הראשוני להשוואת ברחבי זיהום C. difficile.
  2. מניחים משקל דיגיטלי לתוך ארון בטיחות ביולוגית. מניחים כוס פלסטיק סטרילי על המשקל הטרה המשקל של כוס פלסטיק. ואז, בעדינות להרים את העכבר על ידי בבסיס הזנב ולמקם אותו לתוך כוס פלסטיק.
    1. מניחים את הכוס בחזרה על הסקאלה. רחף יד על החלק העליון של הכוס על מנת להבטיח כי העכבר לא לברוח. זה עלול לקחת 2 - 3 שניות כדי לקבל משקל יציב. ואז, בעדינות למקם את העכבר חזרה לכלוב שלה. קלט משקל זה וחזור על התהליך עבור כל עכבר בישיבה בכלוב.
      הערה: זה הכרחי כי ננקטים אמצעי זהירות כדי למנוע צולבות contamination בין הכלובים בעת קבלת משקולות. כל כלוב של עכברים צריך כוס הפלסטיק משלו לשקילה. כוסות הפלסטיק יש לחטא עם סוכן sporicidal בין כל שימוש ו מכוסות בנייר אלומיניום סטרילי.
  3. צג החיות תיגר פעמיים ביום (לכל הפחות) סימנים של זיהום קליני חמור C. difficile, כולל עייפות, אובדן תיאבון, שלשול, יציבה כפופה.
  4. ברוב אנושי להרדים חיות לאבד 20% ממשקל גוף הבסיס הראשוני שלהם ו / או לפתח סימנים קליניים חמורים של זיהום C. difficile (המפורטים בשלב 3.3).
    הערה: עכברים המציגים סימנים קליניים של זיהום C. difficile צריך להישקל לפי הצורך במהלך הניסוי על מנת להבטיח כי הם לא איבדו 20% ממשקל הגוף הבסיס הראשוני שלהם. במהלך מועדים לפי שעון בתחילת הניסוי, זה אולי אומר מדידות פעמים ביום.

4. ספירת חיידקים של difficile גמעכבר צואה ותוכן Cecal

הערה: לפני התחילה, להבטיח כי הפריטים הבאים ממוקמים ההחדרה אנאירובי לפחות 24 שעות: 1x PBS (ראה חומרים), צלחות TCCFA (ראה חומרים), מפזר בצורת סטרילי, וצינורות microcentrifuge סטרילי ו / או צלחות PCR עבור דילולים.

  1. קבלת דוגמאות עבור ספירת C. difficile
    הערה: לפני קבלת צואה או תוכן cecal, לשקול צינורות microcentrifuge סטרילי בקנה מידה אנליטי. רשום את משקל הצינור בצד של הצינור, עיגול עד ארבע ספרות אחרי נקודה עשרונית (למשל, 0.9864 גרם). כן על משקל זה כמו "משקל הצינור." כל המדגם נאספו צריך להיות ממוקם בתוך צינור microcentrifuge סטרילי, שקל.
    1. אוסף סטרילי של צואת עכבר
      1. בעדינות לרסן כל עכבר ידי אחיזת החיה על ידי העור הרפוי של בצוואר ובגב כדי לשתק את הראש. השתמש אצבע הזרת לרסן את הזנב של החיה בעדינות, tהוס חשיפת פי הטבעת. להבטיח כי בעל החיים לא לנקד או להראות סימנים אחרים של מצוקה במהלך איפוק.
      2. חזק צינור microcentrifuge סטרילי, ש'ישירות תחת פי הטבעת של החיה. זה הכרחי כי הצינור לא יבוא במגע ישיר עם העכבר.
        1. כמו החיה עושה את הצורך, לאסוף את גלולת הצואה לתוך הצינור. שמור את הצינור בטמפרטורת חדר עד שכל דגימות הצואה נאספות. זה יכול לקחת כמה דקות עבור עכבר לעשות את צרכיו, דבר שיחייב ניסיונות חוזרים לאסוף צואה.
      3. לשקול את הצינורות המכילים צואה על סולם אנליטית. רשום את משקל הצינור, עיגול עד ארבע ספרות אחרי נקודה עשרונית (למשל, 1.0021 גרם). כן על המשקל שהושג כמו "משקל הצינור הסופי."
      4. להעביר את דגימות צואה לתוך התא אנאירובי עבור ספירת חיידקים לאחר איסוף צואה ישירות.
    2. אוסף סטרילי של תוכן cecal העכבר בזמן של necropsy
      1. לאחר המתת חסד הומנית בחנק CO 2 ואחריו אמצעים משניים, לבצע necropsy להשיג את cecum 25. את cecum הוא גדול, סעיף בצורת פסיק של מערכת העיכול.
      2. מניחים את cecum על צלחת פטרי פלסטיק סטרילית. השתמש לא חד פעמי, סטרילי. להב 10 אזמל לחתוך את cecum פתוח המסוף העיוור של הכיס לחשוף את תוכן cecal.
        1. בעדינות לחלץ את תוכן cecal על ידי הפעלת לחץ קל עם להב סקלפל גורף את התוכן כלפי החלק החרות של cecum.
          הערה: יש להקפיד לא לשבש את רקמת cecal, אשר תוגש לבדיקת histopathological.
      3. מניחים את תוכן cecal לתוך צינור microcentrifuge סטרילי, שקל מיד לאחר איסוף. רק כ 10 מ"ג של תוכן cecal נדרש עבור ספירת חיידקים.
      4. לשקול את צינורות המכילים תוכן cecal על scal אנליטייםדואר. רשום את משקל הצינור, עיגול עד ארבע ספרות אחרי נקודה עשרונית (למשל, 1.0021 גרם). כן על המשקל שהושג כמו "משקל הצינור הסופי."
      5. להעביר את דגימות תוכן cecal לתוך התא אנאירובי עבור ספירת חיידקים.
  2. ספירת חיידקים של difficile ג
    1. חשב את המשקל הסופי של תכנים (צואה או cecal) כי יהיה המנויים עבור difficile ג. הנערך על ידי הפחתת "משקל הצינור הסופי" מן "משקל הצינור."
    2. חישוב 1:10 דילול של תוכן לתוך 1X PBS ו resuspend בהתאם. עבור כדורי צואה, להשתמש קצה פיפטה כדי לשבש את הגלולה בעדינות לתוך פתרון (ראה קובץ המשלים "חישובי דוגמא").
    3. אנארובי דגירה דגימות resuspended אלה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מה שמאפשר את התוכן להתיישב.
    4. הפוך את דילולים סדרתי עבור כל דגימה ב 1x PBS עבור enumeration של CFU לכל גרם של תוכן (צואה או cecal). בצע זה אנארובי.
    5. באמצעות טכניקה האספטי, להעביר 100 μl של כל דילול סדרתי צלחות TCCFA. באמצעות מפזר בצורה סטרילי, להפיץ את הדילול להחיל את התקשורת כדי להפיץ אותו באופן שווה על פני הצלחת. גם הפצת הדילול היא חיונית עבור ספירה מדויקת של מושבות.
    6. דגירת הצלחות אנארובי למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. בשלב זה, למנות מושבות difficile ג להשיג את CFU לכל גרם של תוכן (צואה או cecal). מושבות difficile ג הן שטוחות צהובות בהירות, יש קצוות לא סדירים מראה זכוכית גרוסה 24.
      הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש כדי למנות C. difficile מתוכן GI בעכברים אחר, כולל ileal ותוכן גס. צלחות PCR יכול לשמש להכנת דילולים סדרתי.

5. Vero Cell Assay Cytotoxicity לכמת רעלן C. difficile Cytotoxiעִיר

הערה: מומלץ כי assay זה להתבצע לאחר השלמת מודל העכבר על דגימות שנאספו necropsy ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס. טכניקות תרבית תאי אספטי חיוניות למניעת זיהום של תאי Vero במהלך assay זה. פרוטוקול זה לוקח 2 ימים כדי לבצע. כל תוכן הצואה במעיים מנוצל assay זה חייב להיות מאוחסן בתוך שפופרת microcentrifuge שקל, סטרילי (מסומנים עם "משקל הצינור," ראה סעיף לעיל). משקל הצינור הסופי (כולל התוכן) נמדד באמצעות סולם אנליטית למקומות העשרוניים ארבעה הקרובים (ראה סעיף לעיל). שימוש פיפטה רב ערוצית מומלץ עבור assay זה.

הערה: לפני תחילת, להבטיח כי הפריטים הבאים זמינים: תאים Vero, שינוי של Dulbecco בינוני Eagle (DMEM) 1x עם 10% חום מומת העובר בסרום שור (FBS) ו -1% פניצילין / מדיה סטרפטומיצין (מסומן כמו "DMEM 1x תקשורת; "ראה חומרים וקובץ המשלימה), 0.25%טריפסין- EDTA, PBS 1x, 0.4% Trypan כחול, תרבית תאים 96-גם שטוח התחתונה צלחת, צלחת מסנן 96-היטב, Clostridium רעלן difficile (aliquot ב 3 μl 1 מיקרוגרם / μl במים אולטרה-טהור חנות ב -80 מעלות צלזיוס), Clostridium difficile אנטיטוקסין, גיליון עבודה (לחישובים ומפות צלחת; לראות קבצים משלימים).

הערה: יש לנקוט זהירות במהלך assay זה לחשיפת אנשים ל C. difficile ורעלנים שלה.

  1. פיצול תאי Vero (יום 1)
    1. מחממים את התקשורת 1x DMEM, 0.25% טריפסין- EDTA, ו 1x PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    2. השג בקבוקון של תאים Vero מן החממה תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) ולמקם אותו למכסה המנוע זרימה למינרית תרבית תאים סטריליים. השתמש 70% אתנול לנגב את מכסה המנוע וציוד לפני השימוש. בעזרת פיפטה סרולוגית, לשאוב תקשורת מהבקבוק בתרבית הרקמה להסירו מתאי Vero וזורק אותו לתוך ג פסולontainer.
    3. שוטפים את התאים Vero עם 5 מ"ל של 1x PBS (שחומם מראש) בבקבוק בתרבית רקמה. לשאוב PBS וזורק אותו לתוך מיכל פסולת.
    4. הוסף 5 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA אל הבקבוק בתרבית רקמה. אפשר זמן מגע של 2 - 3 דקות. במהלך תקופה זו, ולבחון את התאים מתחילים לרדת לפני השטח הבקבוק. נער בעדינות את צד בקבוק בתרבית הרקמה לצד כדי לשחרר את תאי Vero.
    5. לאחר זמן מגע עם טריפסין-EDTA, ומיד להוסיף 5 מ"ל של DMEM התקשורת 1x לתוך הבקבוק בתרבית רקמה. זה יהיה לנטרל את טריפסין-EDTA. השתמש בפתרון זה כדי לשטוף את כל תאי Vero פנויים בעדינות את החלק האחורי של הבקבוק. לאחר מכן, השתמש פיפטה סרולוגיות להעביר את התערובת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
    6. צנטריפוגה תאי Vero בצינור החרוטים במשך 5 דקות ב 180 XG ו -25 מעלות צלזיוס. ודאו צנטריפוגות מאוזנים כראוי. לאחר צנטריפוגה, להתבונן גלולה גלויה של תאי Vero בתחתית צינור החרוטים. היזהר שלא disrupt גלולה זו. לשאוב את supernatant מצינור החרוטים וזורקים אותו.
    7. Resuspend התאים Vero ב 3 מ"ל של התקשורת 1x DMEM.
  2. ספירת תאי Vero
    1. הוספת 100 μl של השעית תא Vero (תוצרת שלב 5.1.7) עד 100 μl של 0.4% Trypan הכחולים. לערבב בעדינות על ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה.
    2. הוסף 10 μl של תערובת זו לכל לשכת hemocytometer.
    3. ספירת תאים קיימא בתוך ארבעת הרביעים של hemocytometer. תאים מתים Vero ייקחו את כחול Trypan וכך יהיה מוכתם כחול (תאים אלה לא צריכים לספור). מספרי שיא של אלה "גיליון התא Vero," ספק.
    4. לסכם את המספר הכולל של תאי קיימא Vero בכל ארבעת הרביעים ולחשב את הממוצע. הכפל על ידי גורם לדילול, המהווה 2 מאז 100 μl של התאים נמצאים סך של 200 μl של נוזל.
    5. כפל על ידי גורם התיקון כדי לתת "; מספר תאים / מ"ל "כאשר באמצעות hemocytometer, גורם התיקון הוא תמיד 10 4 להכפיל את הנפח הכולל עד לתת." המספר הכולל של תאים "..
  3. קביעת מספר Required וולס עבור כל ניסוי
    הערה: מדגם יחיד (או צואה או תוכן מעי) דורשת 24 בארות נפרדות להתבצע בשני עותקים. ריכוז של 10 5 תאי Vero לכל טוב (נפח כולל של 90 μl) נדרש.
    הערה: אם אחד רצונות כדי לדגור תא Vero 96-גם צלחות הלילה בשעת 37 ° C, בריכוז של 10 3 תאי Vero לכל טוב מומלץ לתת דין וחשבון על זמן הדגירה הממושך. חישובים בתוך גיליון העבודה Cell Vero היה צריך להיות מותאם לתת דין וחשבון על השינוי הזה.
    1. לקבוע את מספר בארות שניתן לנצלם על בסיס הסכום של תאי Vero זמינים (מ שלב 5.2; להשתמש גיליון תא Vero, מסופק).
    2. לקבוע את עוצמת הקול שלהשעית תא Vero צורך למלא את מספר הבארות הרצויות (מבוססות על מספר דוגמאות נבדקת). ודא שכל נפח נוסף מתווסף לחשבון pipetting שגיאה (השתמש גליון תא Vero מסופק).
    3. לדלל את השעית תא Vero (שהושגה בשלב 5.1.7) בתקשורת DMEM 1x להשיג את הנפח הנדרש לצורך הניסוי.
  4. תאי מתזמן Vero לתוך צלחת תרבית תאי 96-היטב
    1. שימוש resuspension תא Vero משלב 5.3.2, להשתמש פיפטה רב ערוצי להוסיף 90 μl של ההשעיה תא Vero היטב בכל צלחת שטוח התחתונה תרבית תאים 96-היטב.
    2. דגירה את הצלחת עם תאים Vero חממה תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך תקופה מינימלית של 4 שעות לפני הוספת רעלן (דגימות) על בארות. זמן דגירה זה יאפשר תאי Vero לדבוק בתחתית כל טוב.
  5. יצירת פתרונות מניות מן הדוגמות (צואה אותוכן מעי)
    הערה: כל הדגימות צריכות להיות בעלי "משקל הצינור" ו "משקל צינור סופי" נמדד באמצעות סולם אנליטית. השתמש גיליון תא Vero לחישובים.
    1. חשב את משקל התכולה. המרת g כדי מ"ג, אז מ"ג ל μl. חשב את המספר הכולל הסופי של μl של הפתרון הנדרש כדי לבצע דילול 1:10 ב 1x PBS. לחשב את הסכום הכולל של PBS 1x להוסיף המדגם.
    2. מוסיפים את הנפח הכולל של PBS 1x (מחושב לעיל) המדגם. בצע זה אירובי, ושימוש בטכניקה מזוהמת. עבור כדורי צואה, להשתמש קצה פיפטה כדי לשבש את הגלולה בעדינות לתוך התמיסה.
    3. וורטקס דגימות ואז צנטריפוגות אותם 3,522 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ודאו צנטריפוגות מאוזנים כראוי. היזהר שלא לשבש את הגלולה ו resuspend המדגם לתוך פתרון.
      הערה: במהלך שלב 5.5.3, אם רק כמה דוגמאות הן בטיפול, תוכן ניתן לעקר על ידימעביר אותן דרך פילטר 0.22 מיקרומטר יחיד במקום להשתמש צלחת מסנן 96-היטב. כמה דוגמאות עשויות לדרוש מסננים מרובים לעקר את התוכן כל הנפח באמצעות טכניקה זו.
    4. לעקר את תערובת המדגם / PBS על ידי לקיחת 150 μl של supernatant ו הצבתו לתוך בארות נפרדות בצלחת מסנן 96-היטב. מניח את צלחת המסנן באופן מאובטח על גבי צלחת תחתית שטוחה-תרבית תאי 96-גם כך שהתוכן יסנן לתוך צלחת זו.
    5. צנטריפוגה מחסנית מסנן צלחת / תא צלחת התרבות ב 431 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ודא צנטריפוגות הם כראוי מאוזן שערמת צלחת תרבות צלחת מסנן / תא מיושר בחוזקה ולא להעביר במהלך צנטריפוגה.
      הערה: תכנים מסוננים אלו הם מלאים 10 -1 כי ישמשו את צלחות הדילול.
    6. מניח צלחת עם דגימות מסוננות על קרח.
  6. פלייט דילול יצירת # 1
    הערה: דילול Plate # 1 (DP # 1) ידרוש 6 בארות לדגימה, כולל חיובי (רעלן C. difficile) והשלילי (1x PBS) שולטת (לראות את פריסת העקורים # 1 בדף העבודה Cell Vero).
    1. כדי להכין את השליטה חיובי (רעלן C. difficile) עבור assay זו יש לקבל aliquots 3-μl (1 מיקרוגרם / μl) מ -80 ° C ולהוסיף 297 μl של מים ultrapure, מניב לריכוז סופי של 0.01 מיקרוגרם / μl. מניחים על קרח.
    2. לייבל בארות עם דילולים שלהם (10 -1 עד 10 -6) עבור כל דגימה ומצביעות על בקרות חיוביות ושליליות (לראות את פריסת # 1 העקורים).
    3. להוסיף כמויות מתאימות של 1x PBS היטב כל אחד. בשנות ה 10 -1 בארות, להוסיף NO PBS. במשך 10 -2 עד 10 -6 בארות, להוסיף 90 μl של 1x PBS.
    4. להוסיף כמויות מתאימות של דגימות היטב כל אחד. בשנות ה 10 -1 בארות, להוסיף 100 μl של 10 -1 המניות עבור כל דגימה (ראה שלב 5.5.7 מן plat מסנןה). במשך 10 -2 עד 10 -6 בארות, לעשות דילולים סדרתי; להתחיל על ידי לקיחת 10 μl מן 10 -1 היטב הוספתו 10 -2 היטב. המשך הדילולים סדרו מתוך 10 הדילול -6.
    5. מכסה את הצלחת העקורה # 1 עם חותם דבק פלסטיק שקוף ומניח אותו על קרח.
  7. פלייט דילול יצירת # 2
    הערה: צלחת דילול (DP # 2) ידרוש 2 נתיבים של 6 בארות עבור כל דגימה, כולל בקרות חיוביות ושליליות (לראות את פריסת העקורים # 2 בדף העבודה Cell Vero).
    1. לייבל בארות עם דילולים שלהם (10 -1 עד 10 -6) עבור כל דגימה ומצביעות על בקרות חיוביות ושליליות (לראות את פריסת # 2 DP). לייבל בארות עם שם המדגם (המסומן כמו "בארות מדגם") או את שם המדגם עם נסיוב (המסומן כמו "בארות antitoxin").
    2. לחשב את הסכום של חיסון נדרש עבור assay זה. הערה: antitoxin היא מניה 25xפתרון זה צריך להיות מדולל 1:25 ב 1x PBS. מניחים את הפתרון antitoxin 1x מוכן על הקרח.
    3. לקבלת "בארות מדגם," להוסיף 20 μl של 1x PBS היטב כל לכל דילולים (10 -1 עד 10 -6) של מדגם זה. לקבלת "בארות antitoxin," להוסיף 20 μl של 1x אנטיטוקסין היטב כל לכל דילולים (10 -1 עד 10 6) של מדגם זה.
    4. העברת 20 μl של המדגם מדולל בארות מן העקורים # 1 לתוך בארות המיועד על העקורים # 2 עבור שורות 1 - 6 ושורות 7 - 12 (לראות את פריסת העקורים # 2 בדף העבודה Cell Vero). מערבבים בעדינות את הפתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    5. מכסים עקורים # 2 עם חותם דבק פלסטיק שקוף ולאפשר 40 דקות של דגירה בטמפרטורת חדר. הדגירה זה היא לאפשר antitoxin להיקשר ובכך להשבית ולנטרל את הרעלן C. difficile.
    6. לאחר הדגירה, להוסיף 10 μl של תערובת מן העקורים # 2 על בארות התא המתאימות Vero (לראות את פריסת צלחת תא Vero על Vגליון Cell ero). לערבב בעדינות את הפתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה, נזהר שלא לשבש את תאי Vero כי הם דבקו אל פני השטח התחתונים של הבארות.
    7. דגירה את צלחת תא Vero לילה חממת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  8. להעריך תאי Vero עבור עיגול באמצעות מיקרוסקופ אור (יום 2)
    הערה: תזכיר כי שינויים גורמים לדילול בפקטור של 10 בעת הוספת התערובות המדגמות לצלחת תא Vero (למשל, 10 -3 הם עכשיו 10 -4). וולס כי יש antitoxin הנוכחי צריך לא מעט על מנת עיגול התא Vero ציין. עיגול תא Vero (cytotoxicity) יצוין בדגימות המכילות difficile toxin ג. אם הפעילות ציטוטוקסיות מנוטרלת בדילול המכיל המדגם antitoxin, בנוכחות רעלן C. difficile וכתוצאה מכך cytotoxicity תא Vero הוא אישר.
    1. בדוק עבור עיגול תא Vero באמצעות תאורהמיקרוסקופ t בהגדלת 200X. עבור בארות מדגם (כולל הבקרה החיובית), להקליט את הדילול של הבאר, זה הדבר האחרון שיש עיגול תא 80% Vero ציין.
    2. חשבתי את כייל ציטוטוקסיות, מוגדרת ההופכי של הדילול הגבוה ביותר שייצר 80% עיגול תא Vero לכל גרם של מדגם. לדוגמא, אם הדילול הגבוה ביותר הוא 10 -5, אזי גורמים לדילול יהיה 10 -6 למדגם זה. לפיכך, ביומן [גורם לדילול הסופי] / g של המדגם יהיה להיכנס [10 6], אשר מניב כייל גומלין של 6.
      הערה: תאים Vero צריך עברו לפחות 3 - 4 קטעים ולא יותר מ -30 קטעים לפני השימוש בהם assay זה 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במהלך מחקר נציג, 5 שבועות בן C57BL / 6 עכברים WT טופלו קודם cefoperazone במי השתייה שלהם (0.5 מ"ג / מ"ל) במשך 5 ימים, מותר 2-יום לשטוף עם מי שתייה רגילים. עכברים היו תיגר עם 10 5 נבגים של C. difficile R20291 gavage דרך הפה ביום 0 (איור 1 א). עכברים נוטרו לירידה במשקל וסימנים קליניים (עייפות, inappetence, שלשול, יציבה כפופה) של CDI למשך 14 יום. האתגר של עכברים C57BL / 6 WT עם נבגים C. difficile R20291 הביא שלשול תוך 24 שעות ו ירידה משמעותית במשקל תוך 48 שעות שלאחר אתגר (איור 1B). למרות שלא נצפה בניסוי הזה, עכברי תיגר עם מינון גבוה יותר של C. difficile R20291 יכולים להיות חולים קשה או יש יותר מ -20% ירידה במשקל של 48 - 72 שעות שלאחר אתגר, לפיכך מחייבים המתת חסד הומנית. לכן, עכברים דורשים מינימום של פעמיים ביוםניטור לאחר אתגר עם נבגי difficile ג.

במחקר נציג זה, כמות משמעותית של ירידה במשקל סימנים קליניים של המחלה בעכברים נצפו גם על ימים 2 - 7-אתגר פוסט (איור 1B). ב -7 ימים לאחר אתגר, עכברים החלו לעלות במשקל, וסימנים קליניים של המחלה שככו. עד השבוע האחרון של הניסוי, העכברים נראו נורמלים קליני, ללא עדות הסימנים הקליניים של CDI, כוללים שלשול.

כדורי צואה נאספו לפני האתגר עם נבגים C. difficile וכל 48 שעות שלאחר אתגר (תרשים 1C). לפני הטיפול האנטיביוטי, עכברים לא היו יישבו עם difficile ג. בתוך 24 שעות שלאחר אתגר עם נבגים difficile ג, העכברים היו יישבו עם 10 7 CFUs של C. difficile לכל גרם של צואה (איור 1 ג </ Strong>). עכברים נשארו יישב בהתמדה עם difficile ג לאורך הניסוי, ולמרות שלא היו ראיות של ירידה במשקל או סימנים קליניים של CDI עבור 7 הימים האחרונים של הניסוי.

איור 1
איור 1: העכברים שטופלו Cefoperazone תיגר עם C. difficile R20291 לתצוגות הרזיה והם יישבו עם C. difficile. א) 5 שבועות בן C57BL / 6 עכברים JAX WT (n = 3M / 3F לכל קבוצה) טופלו קודם cefoperazone במי השתייה שלהם (0.5 מ"ג / מ"ל) במשך 5 ימים ואפשרה 2-יום לשטוף החוצה עם השתייה רגיל מַיִם. עכברים היו תיגר עם 10 5 נבגים של C. difficile R20291 gavage דרך הפה ביום 0. עכברים נוטרו לירידה במשקל וסימנים קליניים (עייפות, inappetence, שלשול, יציבה כפופה) של CDI למשך 14 יום. צואה נאספת ומשמשת ספירת חיידקים לפני תחילת cefoperazone, מייד after גמר האנטיביוטיקה בימים 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, ו -14 ברחבי זיהום. Necropsy בוצע בימים 0, 2, 4, 7, ו -14 B) העכברים איבדו כמות משמעותית של משקל הבסיס שלהם לאחר אתגר עם C. difficile R20291. ומשקל הגוף הממוצע של עכברים נמדד מדי יום בין יום 0. ירידה משמעותית במשקל נתפסה בימים 2 עד 7 בהשוואת היום 0, משקל הבסיס. C) C. difficile R20291 עומס חיידקים בצואה לאחר האתגר. תוך 24 שעות לאחר האתגר עם נבגי difficile ג, כל העכברים היו יישבו עם 10 7 CFUs (יחידות מושבת יוצרים) לכל גרם של צואה. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בפרמטרים אלה נראו בין נקבות וזכרים. משמעות נקבע על פי מבחן הלא פרמטרית Kruskal-Wallis חד סטרי ANOVA ואחריו posttest של דאן (*, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ***, p ≤ 0.001; ****, עמ ' אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ארבעה עכברים (2 זכרים 2 נקבות) היו מורדמים אנושיים והוכנו necropsy ביום 0, לפני ההדבקה, לשרת שולט נגועה כמו. בנוסף, אחת עכבר מכלוב היה מורדמים אנושיים והוכן necropsy על 2 ימים, 4, 7, ו -14 שלאחר אתגר (איור 1 א). ספירת C. difficile בתוך תוכן cecal בוצע בכל necropsy. הקונקורדנציה עם ספירה בצואה, לא difficile ג זוהה תוכן cecal של עכברים לפני האתגר עם difficile ג. בשעה 48 שעות שלאחר אתגר, העכברים היו יישבו עם כ 10 8 CFUs של difficile ג לכל גרם של תוכן cecal (איור2A). כל העכברים נשארו יישבו בהתמדה לאורך הניסוי.

תוכן Cecal גם הוערך ברחבי הזיהום לנוכחות של רעלן C. difficile באמצעות assay cytotoxicity תא Vero. אין עדות cytotoxicity רעלן C. difficile זוהתה תוכן cecal לפני האתגר (איור 2 ב). C. difficile cytotoxicity זוהה 2 ימים לאחר האתגר עם נבגי C. difficile והתמיד ברחבי הזיהום. למרות קולוניזציה אחידה למדי עם difficile ג, וריאציה רמות של פעילות ציטוטוקסית C. difficile ניכרת עכברים בודדים (איור 2B).

רוב התוכן העכבר cecal לנטרל עם C. difficile antitoxin במהלך assay cytotoxicity תא Vero ו לא היו ראיות של רעילות (ce Veroll עיגול) של דילולים ביצע. עם זאת, כמה עכברים בודדים, למרות retesting, היו ראיות של 50 - cytotoxicity 100% ב -10 -1 דילול (הדילול שבו המדגם הוא מרוכז ביותר), ללא עדות תא Vero עיגול ב הדילולים האחרים. Antitoxin מנוצל assay זה הינו נוגדן polyclonal לנטרל רעלן difficile ג, ערוכים עזים 27. לכן, antitoxin זה לא יכול לנטרל את הרעלן בינארי difficile ג כי הוא מיוצר על ידי זן R20291. עם זאת, הרעלן בינארי difficile ק'לא נחשב ציטוטוקסיות 10. ג מוגזמת רעלן difficile מסוגל להיות מנוטרל על ידי נסיוב או נוכחות של סוכן אחר ציטוטוקסיות מלבד רעלן C. difficile יכול להוות את אחד הגורמים ממצא זה. תצפית זו לא השפיעה על קביעת כייל cytotoxicity עבור דגימות אלה, שכן כל הדילול האחרון של מדגם עם עיגול תא 80% Vero היהאין עדות cytotoxicity בשילוב עם antitoxin בדילול שצוין.

איור 2
איור 2: Colonization של cecum ו Cytotoxicity במהלך זיהום עם C. difficile R20291. א) עכברים ceca נשאר יישבו בהתמדה עם C. difficile לאורך הניסוי, למרות ברזולוציה של סימנים קליניים ועלייה במשקל נצפתה. כל העכברים היו יישבו עם יותר מ -10 8 CFUs לכל גרם של תוכן cecal כאשר הוערך 2 ימים-אתגר הפוסט. B) assay cytotoxicity תא Vero מתוכן cecal ברחבי זיהום עם C. difficile R20291. בעקבות אתגר עם נבגים difficile ג, היו עכברים רמות משמעותיות של רעילות, כפי שהיא נמדדת בדילול הגומלין 10 יומן של רעלן לכל גרם של תוכן cecal על 2 ימים, 4, ו -7 שלאחר אתגר לעומת יום 0 (חציונים representeD על ידי קו). משמעות נקבע על פי מבחן הלא פרמטרית Kruskal-Wallis חד סטרי ANOVA ואחריו posttest של דאן (*, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ***, p ≤ 0.001; ****, p ≤ 0.0001 ). ברים שגיאה מייצגים סטיות התקן מן הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מומלץ ערכה היסטולוגית מתנהלת על-ידי פתולוג וטרינרים-מועצת רואים באופן עיוור. לקבלת ניקוד רקמות, שיטת הניקוד המספרי 0-4 צריך להיות מועסק על מנת בנפרד להעריך בצקת, חדירה לתא דלקתיות, ונזק תא אפיתל מעי, cecum, והמעי הגס מבוסס על ערכת הבקיע בעבר פורסם בתאריך 17.

לאחר בחינת histopathologic עיוורת ination של מעי, cecum Murine, ומעי גס הבא אתגר עם C. difficile R20291, השינויים פתולוגיים המשמעותיים ביותר שהועלו cecum (איור 3). הציונים היסטולוגית הכולל cecal היו שונים משמעותית בין יום 0 ו ימים 2 ו -4-אתגר הפוסט. אין נגעים משמעותיים נרשמו המעי ברחבי זיהום (איור 3). נגעים מתונים צוינו במעי הגס. הציונים היסטולוגית הכוללים הגסים היו שונים משמעותיים בין היום 0 ו ימים 2 ו -7 אתגר פוסט (איור 3).

נציג H & E חלקים של מעי, cecum, והמעי הגס ברחבי זיהום זמינים באיור 4. כל תמונה יש ציון היסטולוגית הכולל שלו בהתאמה ועשרות בודדות לנזק אפיתל, דלקת, בצקת, כפי שנקבע על ידי פתולוג וטרינרי עיוור-מועצת רואי ( SAM).

: לשמור-together.within-page = "1"> איור 3
איור 3: ניקוד היסטולוגית של Murine המעי, cecum, ומעי גס במהלך זיהום עם C. difficile R20291. עשרות היסטולוגית סה"כ חושבו על ידי הוספת כל שלושה ציונים מן הפרמטרים העריכו: נזק אפיתל, דלקת, בצקת. לא היו שינויים משמעותיים histopathological צוינו מעי ברחבי זיהום. רקמת Cecal כלולה הנגעים היסטולוגית המשמעותיים ביותר במהלך CDI. הציונים היסטולוגית הכולל cecal היו שונים במידה משמעותית מהיום 0 בימים 2 ו -4-אתגר פוסט. נגעים מתונים צוינו במעי הגס. הציונים היסטולוגית הכוללים הגסים היו שונים במידה משמעותית מהיום 0 בימים 2 ו -7-אתגר פוסט. משמעות נקבע על פי מבחן הלא פרמטרית Kruskal-Wallis חד סטרי ANOVA ואחריו posttest של דאן (*, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ***, עמ '804; 0.001; ****, P ≤ 0.0001). ברים שגיאה מייצגים סטיות התקן מן הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: Histopathology במהלך זיהום עם C. difficile R20291. לוח זה מכיל סעיפים H & E נציג מעי, cecum, והמעי הגס ברחבי זיהום עם C. difficile R20291. הציונים היסטולוגית בסך הכל הם בסוגריים () ליום המקביל והרקמות רשומות: עבור היום מעי 0 (0), יום 2 (1), יום 4 (0), יום 7 (0), ויום 14 (0) ; עבור cecum יום 0 (0), יום 2 (5), יום 4 (4), יום 7 (3), ויום 14 (3); ולמען המעי הגס יום 0 (0), יום 2 (4), יום 4 (1), יום 7 (4), ויום 14 (2). Photomicrographs התקבלו על microscop אורדואר עם מצלמה דיגיטלית 5 מגה פיקסל ותוכנת הנלווים (את סרגל קנה המידה מייצג 200 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1x PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1x Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  4. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
  5. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  6. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  7. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  8. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  9. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
  10. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  11. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  12. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  13. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  14. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  15. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  16. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
  17. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  18. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  19. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  20. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  21. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  22. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
  23. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787 (2013).
  24. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  25. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).
  26. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).
  27. Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
  28. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
  29. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  30. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
  31. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  32. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  33. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
  34. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).

Tags

זיהום גיליון 118, במודל של עכברים אנטיביוטיקה קולוניזציה cytotoxicity היסטולוגיה דלקת תאים Vero
Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 הזנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winston, J. A., Thanissery, R.,… More

Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter