Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Cefoperazone इलाज के माउस मॉडल नैदानिक ​​प्रासंगिक doi: 10.3791/54850 Published: December 10, 2016

Summary

इस प्रोटोकॉल क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम संक्रमण (सीडीआई) एक चिकित्सकीय प्रासंगिक और आनुवंशिक रूप से विनयशील तनाव, R20291 का उपयोग करने का Cefoperazone माउस मॉडल की रूपरेखा। नैदानिक रोग निगरानी, सी बेलगाम बैक्टीरियल गणन, विष cytotoxicity, और एक माउस मॉडल में CDI भर histopathological परिवर्तन पर जोर प्रोटोकॉल में विस्तृत रहे हैं।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम एक anaerobic, ग्राम पॉजिटिव, बीजाणु के गठन बेसिलस कि जीवन के लिए खतरा दस्त 1 का कारण बनता है। सी बेलगाम संक्रमण (सीडीआई) प्रति वर्ष 1-4 स्वास्थ्य देखभाल की लागत में अधिक 4.8 अरब $ में वृद्धि हुई मानव रुग्णता और मृत्यु दर और परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है। 2013 में, रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र एक जरूरी एंटीबायोटिक प्रतिरोध जोखिम के रूप में सी बेलगाम वर्गीकृत, यह दर्शाता है कि यह सार्वजनिक स्वास्थ्य 1 के लिए एक तत्काल खतरा बन गया है। वर्तमान में, vancomycin के साथ एंटीबायोटिक उपचार और metronidazole CDI 5 के लिए देखभाल के मानक माना जाता है। रोगियों 2,5-7 का 30% - दुर्भाग्य से, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ सफल इलाज के बाद CDI की पुनरावृत्ति 20 में होने वाली उच्च है। इसलिए, इस आंतों का रोगज़नक़ के खिलाफ उपन्यास चिकित्सा की खोज के लिए आवश्यक है। सी बेलगाम, एक पशु मॉडल एसी में मानव रोग का अनुमान करने के खिलाफ चिकित्सा विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिएlinically प्रासंगिक तनाव की जरूरत है।

प्रारंभ में, कोच की अभिधारणा 1977 में सी बेलगाम के लिए स्थापित किए गए थे एक clindamycin इलाज सीरियाई हम्सटर मॉडल 8 का उपयोग। यह मॉडल आज भी उपयोग किया जाता है रोगजनन 9,10 पर सी बेलगाम विषाक्त पदार्थों के प्रभाव की जांच करने के लिए। हालांकि, CDI हम्सटर मॉडल में उच्च मृत्यु दर में यह परिणाम है और पुरानी घातक बीमारी अभिव्यक्तियों CDI 10,11 के साथ मनुष्य में देखा जा सकता है कि लगभग नहीं है। अनुसंधान के क्षेत्र में murine प्लेटफार्मों की पहुंच और अभिकर्मक उपलब्धता के आधार पर, CDI के एक माउस मॉडल प्रासंगिक है।

2008 में, CDI के एक मजबूत माउस मॉडल 3 दिन clindamycin 12 की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा पीछा के लिए पीने के पानी में एक एंटीबायोटिक कॉकटेल (केनामाइसिन, जेंटामाइसिन, colistin, metronidazole, और vancomycin) के साथ चूहों के इलाज से स्थापित किया गया था। यह प्रदान की गई चूहों CDI और गंभीर कोलाइटिस के लिए अतिसंवेदनशील। निर्भर करती हैinoculum खुराक प्रशासित पर हैैं, नैदानिक ​​लक्षण और मारक की एक सीमा के इस मॉडल का उपयोग कर देखा जा सकता है। इस समय के बाद से, विभिन्न एंटीबायोटिक परहेजों 13,14 जांच की गई है कि murine पेट microbiota परिवर्तन, इस मुद्दे पर जहां सी बेलगाम जठरांत्र पथ उपनिवेश स्थापित कर सकते हैं बसाना प्रतिरोध कम (लॉली एंड यंग बेस्ट एट अल में समीक्षा की। और)।

हाल ही में, एक व्यापक स्पेक्ट्रम cephalosporin, Cefoperazone, 5 या 10 दिनों के लिए पीने के पानी में दिए गए reproducibly CDI 15 को अतिसंवेदनशील चूहों प्रदान करता है। चूंकि तीसरी पीढ़ी सेफालोस्पोरिन्स के प्रशासन मानव में CDI का एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं, Cefoperazone मॉडल के उपयोग को और अधिक सही स्वाभाविक रूप से होने वाली बीमारी 16 को दर्शाता है। Cefoperazone इलाज चूहों सी बेलगाम के लिए अतिसंवेदनशील दोनों सी बेलगाम बीजाणुओं और नैदानिक में लेकर उपभेदों की एक किस्म की वनस्पति कोशिकाओं के साथ चुनौती दी गई हैप्रासंगिकता और डाह 17। संक्रामक फार्म के रूप में सी बेलगाम वनस्पति कोशिकाओं के उपयोग के मूल अध्ययन से कुछ के बावजूद, सी बेलगाम बीजाणुओं संचरण 18 वर्ष की प्रमुख विधा माना जाता है।

पिछले दशक में, सी बेलगाम R20291, एक NAP1 / बीआई / 027 तनाव, उभरा है, CDI 19,20 की महामारी के कारण। हम रोग के नैदानिक पाठ्यक्रम निर्धारित करने के लिए जब Cefoperazone इलाज चूहों नैदानिक प्रासंगिक और आनुवंशिक रूप से विनयशील सी बेलगाम तनाव, R20291 साथ चुनौती दी थी की मांग की। इस प्रोटोकॉल नैदानिक पाठ्यक्रम विवरण, वजन घटाने, बैक्टीरियल उपनिवेशवाद, विष cytotoxicity, और सी बेलगाम R20291 बीजाणुओं के साथ चुनौती दी चूहों के जठरांत्र संबंधी मार्ग में परिवर्तन सहित histopathological। कुल मिलाकर, इस माउस मॉडल CDI मानव रोग का अनुमान करने के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक मंच साबित होता है। यह विशेषता माउस मॉडल इस प्रकार प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकतानैदानिक रोग के सुधार पर और सी बेलगाम के खिलाफ उपनिवेशन प्रतिरोध की बहाली पर उपन्यास चिकित्सा की।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

नैतिक कथन:
संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) उत्तरी कैरोलिना स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज पशु चिकित्सा में (NCSU) इस अध्ययन को मंजूरी दे दी। NCSU पशु की देखभाल और नीति NCSU पर 1985 प्रयोगशाला पशु सुविधाओं के पशु कल्याण अधिनियम और स्वास्थ्य अनुसंधान विस्तार अधिनियम में निर्धारित मानकों और दिशा निर्देशों की देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए लागू होता है प्रयोग करें। जानवरों के स्वास्थ्य की स्थितियों दैनिक का मूल्यांकन किया गया है, और मरणासन्न पशुओं को नम्रता से माध्यमिक उपायों के द्वारा पीछा सीओ 2 asphyxiation द्वारा euthanized थे। प्रशिक्षित पशु तकनीशियन या एक पशु चिकित्सक इस अध्ययन के दौरान एक AAALAC से मान्यता प्राप्त सुविधा में पशुपालन प्रदर्शन किया।

पीने के पानी में एंटीबायोटिक Cefoperazone 1. प्रशासन सी बेलगाम औपनिवेशीकरण और रोग के लिए संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए

नोट 5- करने के लिए 8 सप्ताह पुराने C57BL / 6 गुम्मट चूहों (महिलाओं और पुरुषों)खरीदा है और एंटीबायोटिक पानी प्रशासन शुरू करने से पहले 1 सप्ताह के लिए निगरानी कर रहे थे। संगरोध के बाद, चूहों autoclaved भोजन, बिस्तर, और पानी के साथ रखे थे। पिंजरे परिवर्तन एक लामिना का प्रवाह हुड में प्रयोगशाला कर्मचारियों द्वारा साप्ताहिक प्रदर्शन किया गया।

  1. 7 दिन (चित्रा 1) चुनौती के लक्षित दिन से पहले बाँझ आसुत जल में Cefoperazone (0.5 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें।
  2. Cefoperazone पानी के साथ autoclaved पानी की बोतलें (0.5 मिलीग्राम / एमएल) भरें और उन्हें प्रत्येक माउस के पिंजरे में जगह है।
    नोट: के रूप में कदम 1.1 और 1.2 में चिह्नित हौसले से तैयार Cefoperazone पानी एक 5 दिन की अवधि के दौरान किए गए और हर 2 दिन बाहर परिवर्तित किया जाना चाहिए। संस्थागत पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा के दिशा निर्देशों का पालन Cefoperazone पानी के उचित निपटान की सिफारिश की है।
  3. Cefoperazone पानी पर 5 दिनों के बाद, autoclaved पानी बाँझ आसुत जल से भरा बोतलों के साथ बोतलों की जगह। प्रयोग की अवधि के लिए चूहों इस पीने का पानी दे।

2. सी बेलगाम बीजाणु inoculum के तैयारी और चूहे की मौखिक Gavage

नोट: शुरुआत से पहले, यह सुनिश्चित करें कि निम्न आइटमों को कम से कम 24 घंटे के लिए अवायवीय कक्ष में रखा जाता है: 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस; सामग्री देखें), taurocholate साइक्लोसेरीन cefoxitin फ्रुक्टोज अगर (TCCFA) प्लेटों (सामग्री और पूरक फ़ाइल देखें ), और एक बाँझ एल के आकार स्प्रेडर।

नोट: चूहे सी बेलगाम बीजाणुओं के साथ चुनौती दी एक जैव सुरक्षा स्तर 2 जानवरों की सुविधा में रखा जाना चाहिए।

  1. वांछित तनाव है कि पहले तैयार किया गया था और बाँझ पानी 21,22 में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत (इस मामले में, R20291 में) की एक सी बेलगाम बीजाणु शेयर प्राप्त करते हैं। पहले इस बीजाणु शेयर की गणना का निर्धारण करते हैं का उपयोग करें।
  2. ज्ञात एकाग्रता बीजाणु शेयर की (बीजाणुओं / एमएल) के आधार पर, गणना 25 μl प्रति 10 5 बीजाणुओं प्राप्त करने के लिए वांछित कमजोर पड़ने। inoculum मात्रा सुनिश्चित सब टीका लगाना करने के लिए पर्याप्त हैप्रयोग (माउस प्रति 25 μl), चूहों में inoculum की गणना (लगभग 30 μl) प्रदर्शन करने के लिए, और pipetting त्रुटि के लिए खाते।
  3. भंवर मूल सी बेलगाम बीजाणु शेयर। फिर, एक पेंच से ढकी microcentrifuge ट्यूब के भीतर बाँझ पानी में मूल सी बेलगाम बीजाणु स्टॉक से (2.2 कदम से) गणना की मात्रा resuspend। एक लामिना का प्रवाह हुड में aerobically इस प्रदर्शन करना। के रूप में इस पतला मिश्रण को पहचानें "बीजाणु inoculum।"
  4. बीजाणु inoculum एक 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें और 20 मिनट के लिए यह गर्मी।
    नोट: यह कदम यह सुनिश्चित करेंगे कि केवल सक्रिय सी बेलगाम बीजाणुओं गर्मी उपचार के बाद रहते हैं।
  5. लामिना का प्रवाह हुड के भीतर, गर्म बीजाणु inoculum के 50 μl लेने के लिए एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में जगह है, और यह अवायवीय कक्ष 23 में से गुजरती हैं। बीजाणु गणन के लिए इस नमूने का प्रयोग करें।
  6. लामिना का प्रवाह हुड के भीतर, शेष गर्म बीजाणु inoculum int लोडOA 1 मिलीलीटर सिरिंज एक बाँझ बल्ब इत्तला दे दी गैस्ट्रिक gavage सुई से जुड़ी। एक मैनुअल सिरिंज का उपयोग स्टेपर चूहों के बीच खुराक सटीक और तेजी से दोहराने के लिए सुनिश्चित करें। सुनिश्चित करें कि gavage सुई गर्म बीजाणु inoculum उपयोग करने से पहले से भर जाता है।
    नोट: प्रत्येक माउस के लिए एक नया बाँझ gavage सुई की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, अगर सी बेलगाम बीजाणुओं के विभिन्न खुराक प्रशासित रहे हैं, एक नया gavage सुई प्रत्येक खुराक के लिए सिफारिश की है।
    नोट: सी बेलगाम बीजाणुओं अत्यधिक पारंपरिक कीटाणुनाशक के लिए प्रतिरोधी रहे हैं। इसलिए, इस तरह # 62 Perisept Sporicidal कीटाणुनाशक के रूप में एक sporicidal कीटाणुनाशक, का उपयोग करते हैं, यह आवश्यक है। निर्माता सी बेलगाम बीजाणुओं को नष्ट करने के लिए एक 2 मिनट संपर्क समय की सिफारिश की।
  7. Gavage बीजाणु inoculum के 25 μl के साथ प्रत्येक माउस। गर्दन के ढीली त्वचा से और आदेश सिर स्थिर करने में वापस जानवर लोभी द्वारा धीरे प्रत्येक माउस को नियंत्रित। तर्जनी का उपयोग करते हुए आगे पशु के सिर करने के लिए और स्थिरघेघा बढ़ाना। सुनिश्चित करें कि पशु vocalize या संयम के दौरान संकट के अन्य लक्षण नहीं दिखा है।
    नोट: कुल मात्रा gavage द्वारा चूहों को दिया 10 मिलीग्राम / किलो वजन (0.1 मिलीग्राम / 10 ग्राम) से अधिक नहीं होनी चाहिए।
  8. एक ईमानदार, ऊर्ध्वाधर स्थिति में माउस बनाए रखें और धीरे से मुँह के पक्ष में gavage सुई से गुजरती हैं। मुँह की छत के साथ gavage सुई प्रत्यक्ष और धीरे धीरे घेघा में gavage सुई अग्रिम।
    नोट: किसी भी प्रतिरोध का सामना करना पड़ा है, तो gavage सुई श्वासनली में प्रवेश किया जा सकता है और इस तरह से उन्नत नहीं होना चाहिए, बल्कि हटा दिया है और तुरंत repositioned।
  9. बाद gavage सुई घेघा में लगभग आधे रास्ते में है, गर्म बीजाणु inoculum के 25 μl इंजेक्षन और धीरे से घेघा से gavage सुई वापस ले लें।
    नोट: gavage सुई की सशक्त उन्नति घेघा या पेट का टूटना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसलिए, प्रतिरोध का सामना करना पड़ा है जब gavage सुई आगे बढ़ रहायह सबसे अच्छा है तुरंत हटाने और gavage सुई का स्थान।
  10. अपने पिंजरे में पशु लौटें और किसी भी खाँसी या श्वसन संकट के संकेत के लिए यह निरीक्षण, के रूप में यह अनजाने में सांस की नली प्रशासन या गर्म बीजाणु inoculum की आकांक्षा का संकेत हो सकता।
    नोट: चूहे अत्यंत एंटीबायोटिक उपचार के बाद सी बेलगाम लिए अतिसंवेदनशील होते हैं; इसलिए, सावधानियों पार प्रदूषण को रोकने के लिए पिंजरों के बीच आवश्यक है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब नियंत्रण के रूप में एंटीबायोटिक का इलाज लेकिन चुनौती चूहों प्रबंध है।
  11. सभी चूहों inoculating के बाद, एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में शेष गर्म बीजाणु inoculum जगह है और यह बीजाणु गणन के लिए अवायवीय कक्ष में गुजरती हैं।
  12. गर्म बीजाणु inoculum की गणना के लिए और शेष gavaged गरम किया बीजाणु inoculum (2.4 कदम से), 1x पीबीएस में प्रत्येक inoculum के 1:10 धारावाहिक dilutions बनाओ। 5 dilutions (यानी, 10 -1 के माध्यम से - बनाने के लिए और 4 थाली करने के लिए सिफारिश की है10 -5)।
  13. सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करना, एक व्यक्ति TCCFA थाली पर प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने के 100 μl हस्तांतरण।
  14. एक बाँझ एल के आकार स्प्रेडर का उपयोग करना, समान रूप से कमजोर पड़ने थाली भर में मध्यम करने के लिए लागू फैल गया। पतला inoculum का भी प्रसार के बीजाणुओं की सटीक गणना के लिए आवश्यक है।
  15. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए anaerobically प्लेटें सेते हैं। 24 घंटे के बाद, सी बेलगाम कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFUs) संक्रामक खुराक 25 μl (0.025 एमएल) मात्रा में चूहों को दिलाई (पूरक फ़ाइल "उदाहरण गणना" देखें) प्राप्त करने के लिए समझा जा सकता है। सी बेलगाम कालोनियों फ्लैट और हल्के पीले कर रहे हैं और अनियमित किनारों और एक जमीन गिलास उपस्थिति 24 की है।
    ध्यान दें: बैक्टीरियल गणन के लिए पता लगाने की सीमा 10 2 CFU है।

3. निगरानी माउस वजन घटाने और नैदानिक सी बेलगाम संक्रमण भर में रोग के लक्षण

  1. वजन एकपहले और 5 दिन Cefoperazone एंटीबायोटिक उपचार के बाद nimals, एंटीबायोटिक दवाओं के बंद 2 दिन वसूली (0 दिन) के बाद, और फिर प्रयोग की अवधि के लिए।
    नोट: प्रत्येक दिन एक सुसंगत समय में वजन प्राप्त करते हैं। बाट प्राप्त (0 दिन) चुनौती के दिन सी बेलगाम संक्रमण भर में तुलना के लिए प्रारंभिक आधारभूत वजन के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  2. एक डिजिटल पैमाने पर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें। एक बाँझ प्लास्टिक बीकर पैमाने पर रखें और प्लास्टिक बीकर का वजन मरोड़ा। फिर, धीरे पूंछ के आधार द्वारा माउस लेने के लिए और प्लास्टिक बीकर में जगह।
    1. बीकर पैमाने पर वापस प्लेस। बीकर के शीर्ष पर एक हाथ हॉवर कि यह सुनिश्चित करने के लिए माउस से बच नहीं करता है। 3 सेकंड के लिए एक स्थिर वजन प्राप्त करने के लिए - यह 2 लग सकता है। फिर, धीरे माउस अपने पिंजरे में वापस जगह है। इस वजन रिकॉर्ड और कहा कि पिंजरे में प्रत्येक माउस के लिए इस प्रक्रिया को दोहराने।
      नोट: यह आवश्यक है कि सावधानियों पार contamina को रोकने के लिए लिया जाता हैपिंजरों के बीच tion जब वजन प्राप्त करने के। चूहों के प्रत्येक पिंजरे वजन के लिए अपने स्वयं के प्लास्टिक बीकर होनी चाहिए। प्लास्टिक बीकर प्रत्येक उपयोग के बीच एक sporicidal एजेंट के साथ कीटाणुरहित और बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाना चाहिए।
  3. दिन में दो बार (कम से कम) चिकित्सकीय-गंभीर सी बेलगाम संक्रमण के लक्षण, सुस्ती, भूख, दस्त की हानि, और hunched मुद्रा सहित के लिए चुनौती दी जानवरों की निगरानी।
  4. नम्रता से जानवरों है कि उनके प्रारंभिक आधारभूत वजन का 20% खो euthanize और / या सी बेलगाम संक्रमण (3.3 कदम में सूचीबद्ध) के गंभीर नैदानिक लक्षण विकसित करना।
    नोट: चूहों कि सी बेलगाम संक्रमण के नैदानिक लक्षण प्रदर्शित के रूप में सुनिश्चित करने के लिए कि वे अपने प्रारंभिक आधारभूत वजन के 20% नहीं खोया है प्रयोग के दौरान जरूरत से तौला जाना चाहिए। प्रयोग में जल्दी समय बिंदुओं के दौरान, इस दो बार दैनिक माप मतलब हो सकता है।

4. सी बेलगाम का बैक्टीरियल गणनमाउस मल और cecal सामग्री से

नोट: शुरुआत से पहले, यह सुनिश्चित करें कि निम्न आइटमों को कम से कम 24 घंटे के लिए अवायवीय कक्ष में रखा जाता है: 1x पीबीएस (सामग्री देखें), TCCFA प्लेटों (देखें सामग्री), एक बाँझ एल के आकार स्प्रेडर, और बाँझ microcentrifuge ट्यूब और / या dilutions के लिए पीसीआर प्लेटें।

  1. सी बेलगाम गणन के लिए नमूने प्राप्त करने के
    नोट: मल या cecal सामग्री प्राप्त करने से पहले, एक विश्लेषणात्मक पैमाने पर बाँझ microcentrifuge ट्यूबों तौलना। ट्यूब के किनारे पर ट्यूब वजन रिकॉर्ड, चार दशमलव स्थानों (जैसे, 0.9864 जी) को गोलाई। के रूप में इस वजन निरूपित "ट्यूब वजन।" एकत्र प्रत्येक नमूना एक बाँझ, तौला microcentrifuge ट्यूब में रखा जाना चाहिए।
    1. माउस मल की बाँझ संग्रह
      1. धीरे गर्दन के ढीली त्वचा से और आदेश सिर स्थिर करने में वापस जानवर लोभी द्वारा प्रत्येक माउस को नियंत्रित। , धीरे पशु की पूंछ को नियंत्रित करने के कनिष्ठा उंगली का प्रयोग टीपति गुदा उजागर। सुनिश्चित करें कि पशु vocalize या संयम के दौरान संकट के अन्य लक्षण नहीं दिखा है।
      2. सीधे जानवर के गुदा के तहत एक बाँझ, तौला microcentrifuge ट्यूब पकड़ो। यह आवश्यक है कि ट्यूब माउस के साथ सीधे संपर्क में नहीं आती है।
        1. पशु शौच के रूप में, ट्यूब में मल गोली इकट्ठा। कमरे के तापमान पर ट्यूब रखें जब तक सभी मल के नमूने एकत्र कर रहे हैं। यह कई मिनट लग सकते हैं एक माउस ख़ारिज करने के लिए, इस प्रकार मल इकट्ठा करने के लिए दोहराने के प्रयास की जरूरत महसूस।
      3. विश्लेषणात्मक पैमाने पर मल युक्त ट्यूबों वजन। ट्यूब वजन रिकॉर्ड, चार दशमलव स्थानों (जैसे, 1.0021 जी) को गोलाई। के रूप में प्राप्त वजन निरूपित "अंतिम ट्यूब वजन।"
      4. सीधे मल संग्रह के बाद जीवाणु गणन के लिए अवायवीय कक्ष में मल के नमूने गुजरती हैं।
    2. शव-परीक्षा के समय में माउस cecal सामग्री की बाँझ संग्रह
      1. माध्यमिक उपायों के द्वारा पीछा सीओ 2 asphyxiation द्वारा मानवीय इच्छामृत्यु के बाद, अंधान्त्र 25 प्राप्त करने के लिए एक शव-परीक्षा प्रदर्शन करते हैं। अंधान्त्र जठरांत्र संबंधी मार्ग के बड़े, अल्पविराम के आकार का भाग है।
      2. एक बाँझ प्लास्टिक पेट्री डिश पर अंधान्त्र रखें। एक डिस्पोजेबल, बाँझ कोई फायदा नहीं। 10 स्केलपेल ब्लेड cecal सामग्री को बेनकाब करने की थैली के अंधे अंत से खुला अंधान्त्र कटौती करने के लिए।
        1. धीरे स्केलपेल ब्लेड के साथ प्रकाश दबाव लागू करने और अंधान्त्र के छिन्न हिस्से की ओर सामग्री व्यापक द्वारा cecal सामग्री को निकालें।
          नोट: देखभाल cecal ऊतक, जो Histopathological परीक्षा के लिए प्रस्तुत किया जाएगा बाधित नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए।
      3. cecal सामग्री तुरंत संग्रह के बाद एक बाँझ, तौला microcentrifuge ट्यूब में रखें। cecal सामग्री के बारे में केवल 10 मिलीग्राम बैक्टीरियल गणन के लिए आवश्यक है।
      4. विश्लेषणात्मक scal पर cecal सामग्री युक्त ट्यूबों वजनई। ट्यूब वजन रिकॉर्ड, चार दशमलव स्थानों (जैसे, 1.0021 जी) को गोलाई। के रूप में प्राप्त वजन निरूपित "अंतिम ट्यूब वजन।"
      5. बैक्टीरियल गणन के लिए अवायवीय कक्ष में cecal सामग्री के नमूने गुजरती हैं।
  2. सी बेलगाम का बैक्टीरियल गणन
    1. सामग्री (मल या cecal) कि सी बेलगाम लिए प्रगणित किया जाएगा के अंतिम वजन की गणना। से "अंतिम ट्यूब वजन" घटा कर इस प्रदर्शन "ट्यूब वजन।"
    2. 1X पीबीएस में सामग्री की एक 1:10 कमजोर पड़ने की गणना और तदनुसार resuspend। मल छर्रों के लिए, पिपेट की नोक का उपयोग धीरे समाधान में गोली बाधित करने के लिए (पूरक फ़ाइल "उदाहरण गणना" देखें)।
    3. Anaerobically 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इन resuspended नमूने सेते हैं, सामग्री व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है।
    4. इनम के लिए 1x पीबीएस में प्रत्येक नमूना के लिए धारावाहिक dilutions बनाओप्रति सामग्री (मल या cecal) जी CFU की eration। इस anaerobically प्रदर्शन करना।
    5. सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करना, TCCFA प्लेटों के लिए प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने के 100 μl हस्तांतरण। एक बाँझ एल के आकार स्प्रेडर का उपयोग करना, कमजोर पड़ने मीडिया पर लागू समान रूप से थाली भर में यह प्रसार करने के लिए फैल गया। कमजोर पड़ने की भी फैल रहा कालोनियों की सटीक गणना के लिए आवश्यक है।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए anaerobically प्लेटें सेते हैं। इस समय, प्रति सामग्री (मल या cecal) जी CFU प्राप्त करने के लिए सी बेलगाम कालोनियों की गणना करें। सी बेलगाम कालोनियों फ्लैट और हल्के पीले कर रहे हैं और अनियमित किनारों और एक जमीन गिलास उपस्थिति 24 की है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल ileal और colonic सामग्री सहित अन्य murine सैनिक सामग्री, से सी बेलगाम गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पीसीआर प्लेटों धारावाहिक dilutions बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

5. वेरो सेल cytotoxicity परख यों सी बेलगाम विष Cytotoxiशहर

नोट: यह सिफारिश की है कि इस परख नमूने शव-परीक्षा में एकत्र की है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पर माउस मॉडल के पूरा होने के बाद किया जा सकता है। सड़न रोकनेवाला सेल संस्कृति तकनीक इस परख के दौरान वेरो कोशिकाओं के प्रदूषण को रोकने के लिए आवश्यक हैं। इस प्रोटोकॉल 2 दिन लगते हैं करने के लिए। सभी मल और आंतों सामग्री इस परख में उपयोग एक तौला, बाँझ microcentrifuge ट्यूब में संग्रहीत किया जाना चाहिए (के साथ चिह्नित "ट्यूब वजन," अनुभाग ऊपर देखें)। अंतिम ट्यूब वजन (सामग्री सहित) निकटतम चार दशमलव स्थानों के लिए एक विश्लेषणात्मक पैमाने के माध्यम से मापा जाता है (धारा ऊपर देखें)। एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग इस परख के लिए सिफारिश की है।

नोट: शुरुआत से पहले, यह सुनिश्चित करें कि निम्न आइटम उपलब्ध हैं: वेरो कोशिकाओं, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन मीडिया ( "के रूप में DMEM 1x चिह्नित साथ ईगल मध्यम (DMEM) 1x की Dulbecco बार संशोधन मीडिया, "सामग्री और पूरक फ़ाइल देखें), 0.25%Trypsin-EDTA, 1x पीबीएस, 0.4% Trypan ब्लू, एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति फ्लैट नीचे की थाली, एक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट, क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम विष ए (3 μl में 1 माइक्रोग्राम / μl में अति शुद्ध पानी में विभाज्य और -80 डिग्री सेल्सियस) पर दुकान, क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम अतिविष, एक वर्कशीट (गणना और प्लेट नक्शे के लिए; पूरक फ़ाइलें देखें)।

नोट: सावधानी सी बेलगाम और उसके विष को कर्मियों तक पहुंचाने के लिए इस परख के दौरान लिया जाना चाहिए।

  1. वेरो कोशिकाओं बंटवारे दिवस (1)
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में DMEM 1x मीडिया, 0.25% trypsin EDTA, और 1x पीबीएस पहले से गरम।
    2. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) से वेरो कोशिकाओं की एक कुप्पी प्राप्त करें और बाँझ सेल संस्कृति लामिना का प्रवाह हुड में जगह है। डाकू और उपकरणों का उपयोग करने से पहले नीचे पोंछने के लिए 70% इथेनॉल का प्रयोग करें। एक serologic पिपेट का उपयोग करना, वेरो कोशिकाओं से हटा दें और बर्बादी सी में यह त्यागने के लिए टिशू कल्चर कुप्पी से मीडिया aspirateontainer।
    3. 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ वेरो कोशिकाओं कुल्ला टिशू कल्चर फ्लास्क में (छोड़ देते हैं)। पीबीएस Aspirate और बर्बादी कंटेनर में यह त्यागें।
    4. टिशू कल्चर फ्लास्क को 0.25% trypsin EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़ें। 3 मिनट - 2 के साथ संपर्क समय की अनुमति दें। इस समय के दौरान, निरीक्षण कोशिकाओं कुप्पी सतह से आने के लिए शुरू करते हैं। धीरे वेरो कोशिकाओं को ढीला करने के पक्ष की टिशू कल्चर कुप्पी की ओर रॉक।
    5. Trypsin-EDTA के साथ संपर्क समय के बाद, तुरंत टिशू कल्चर फ्लास्क में DMEM 1x मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें। इस ट्रिप्सिन- EDTA बेअसर करेंगे। इस समाधान का उपयोग धीरे कुप्पी के पीछे से किसी भी स्वाधीन वेरो कोशिकाओं को धोने के लिए। फिर, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इस मिश्रण को हस्तांतरण करने के लिए एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करें।
    6. 180 XG पर 5 मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए शंक्वाकार ट्यूब में वेरो कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज ठीक से संतुलित है। centrifuging के बाद, शंक्वाकार ट्यूब के नीचे वेरो कोशिकाओं के एक दृश्य गोली निरीक्षण करते हैं। disr करने के लिए सावधान नहीं किया जाइस गोली UPT। शंक्वाकार ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला बंद महाप्राण और यह त्यागें।
    7. DMEM 1x मीडिया के 3 मिलीलीटर में वेरो कोशिकाओं Resuspend।
  2. वेरो कोशिकाओं की गिनती
    1. 0.4% Trypan ब्लू के 100 μl के लिए वेरो सेल निलंबन (चरण 5.1.7 में किए गए) के 100 μl जोड़ें। धीरे समाधान ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
    2. एक hemocytometer के प्रत्येक कक्ष के लिए इस मिश्रण के 10 μl जोड़ें।
    3. hemocytometer के चार quadrants भीतर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना। मृत वेरो कोशिकाओं Trypan ब्लू तक ले जाएगा और इस तरह नीले रंग के दाग हो जाएगा (इन कोशिकाओं को नहीं गिना जाना चाहिए)। में इन नंबरों रिकॉर्ड "वेरो सेल वर्कशीट," प्रदान की है।
    4. सभी चार quadrants में व्यवहार्य वेरो कोशिकाओं की कुल संख्या योग और औसत की गणना। गुणा कमजोर पड़ने कारक है, जो कोशिकाओं के 2 100 के बाद से μl है से तरल के 200 μl के कुल में कर रहे हैं।
    5. सुधार कारक से गुणा दे "; कोशिकाओं की संख्या / एमएल "एक hemocytometer का उपयोग करते हैं, सुधार कारक हमेशा 10 4 की कुल मात्रा देने के लिए से गुणा करें।" कोशिकाओं की कुल संख्या "।।
  3. एक प्रयोग के लिए आवश्यक है वेल्स की संख्या का निर्धारण
    नोट: एक भी नमूना (या तो मल या आंतों सामग्री) 24 अलग कुओं दो प्रतियों में प्रदर्शन किया जा करने की आवश्यकता है। अच्छी तरह से प्रति 10 5 वेरो कोशिकाओं के एक एकाग्रता (90 μl की कुल मात्रा) की आवश्यकता है।
    नोट: एक 37 डिग्री सेल्सियस, अच्छी तरह से प्रति 10 3 वेरो कोशिकाओं की एकाग्रता में रात भर वेरो सेल 96 अच्छी तरह प्लेटें सेते चाहता है तो बढ़ाया ऊष्मायन समय के लिए खाते में सिफारिश की है। वेरो सेल वर्कशीट भीतर गणना इस बदलाव के लिए खाते में समायोजित करने की आवश्यकता होगी।
    1. कुओं कि वेरो कोशिकाओं उपलब्ध की राशि के आधार पर उपयोग किया जा सकता की संख्या का निर्धारण (चरण 5.2 से; वेरो सेल वर्कशीट, बशर्ते उपयोग करें)।
    2. की मात्रा का निर्धारणवेरो सेल निलंबन वांछित कुओं की संख्या को भरने की जरूरत (नमूनों की संख्या के आधार पर परीक्षण किया जा रहा)। सुनिश्चित करें कि किसी भी अतिरिक्त मात्रा (बशर्ते वेरो सेल वर्कशीट का उपयोग करें) त्रुटि pipetting के लिए खाते में जोड़ा जाता है।
    3. मात्रा प्रयोग के लिए आवश्यक प्राप्त करने के लिए DMEM 1x मीडिया में वेरो सेल निलंबन (चरण 5.1.7 में प्राप्त) पतला।
  4. एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में सीडिंग वेरो कोशिकाओं
    1. चरण 5.3.2 से वेरो सेल मेजबान का उपयोग करना, एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति फ्लैट नीचे प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए वेरो सेल निलंबन के 90 μl जोड़ने के लिए एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करें।
    2. कुओं के लिए विष (नमूने) जोड़ने से पहले 4 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वेरो कोशिकाओं के साथ थाली सेते हैं और 5% सीओ 2। इस ऊष्मायन समय वेरो कोशिकाओं में अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे का पालन करने की अनुमति देगा।
  5. नमूने से स्टॉक समाधान बनाने (मल याआंतों सामग्री)
    नोट: सभी नमूनों "ट्यूब वजन" और "अंतिम ट्यूब वजन" एक विश्लेषणात्मक पैमाने के माध्यम से मापा जाना चाहिए था। गणना के लिए वेरो सेल वर्कशीट का प्रयोग करें।
    1. सामग्री के वजन की गणना। कन्वर्ट जी मिलीग्राम, तो μl मिलीग्राम। 1x पीबीएस में 1:10 कमजोर पड़ने बनाने के लिए आवश्यक समाधान के μl के अंतिम कुल संख्या की गणना। नमूना में जोड़ने के लिए 1x पीबीएस की कुल राशि की गणना।
    2. 1x पीबीएस (ऊपर गणना) की कुल मात्रा नमूना करने के लिए जोड़ें। इस aerobically प्रदर्शन, और सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर। मल छर्रों के लिए, पिपेट की नोक का उपयोग धीरे समाधान में गोली बाधित करने के लिए।
    3. नमूने भंवर और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,522 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज ठीक से संतुलित है। गोली बाधित करने के लिए नहीं सावधान रहना है और समाधान में नमूना resuspend।
      नोट: चरण 5.5.3 के दौरान, यदि केवल कुछ नमूने कार्रवाई की जा रही है, सामग्री द्वारा निष्फल किया जा सकताएक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट का उपयोग कर के बजाय एक ही 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से उन्हें गुजर रहा है। कुछ नमूने इस तकनीक का उपयोग पूरी मात्रा सामग्री बाँझ करने के लिए कई फिल्टर की आवश्यकता हो सकती है।
    4. सतह पर तैरनेवाला के 150 μl ले रही है और एक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट पर अलग कुओं में रखकर नमूना / पीबीएस मिश्रण जीवाणुरहित। एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति फ्लैट नीचे प्लेट के शीर्ष पर सुरक्षित फिल्टर प्लेट इतनी जगह है कि सामग्री को इस थाली में फिल्टर होगा।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 431 XG पर फिल्टर प्लेट / सेल कल्चर प्लेट ढेर अपकेंद्रित्र। सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज ठीक से संतुलित है और कहा कि फिल्टर प्लेट / सेल कल्चर प्लेट ढेर कसकर गठबंधन कर रहे हैं और centrifugation के दौरान बदलाव नहीं होगा।
      नोट: ये फ़िल्टर सामग्री 10 -1 शेयर है कि कमजोर पड़ने प्लेटों में उपयोग किया जाएगा रहे हैं।
    6. नमूने बर्फ पर फ़िल्टर के साथ थाली रखें।
  6. बनाना कमजोर पड़ने प्लेट # 1
    नोट: कमजोर पड़ने पीएलएते # 1 (डी पी 1 #) सकारात्मक (सी बेलगाम विष ए) और नकारात्मक (1x पीबीएस) नियंत्रण (वेरो सेल वर्कशीट पर डीपी # 1 लेआउट देखें) सहित नमूना प्रति 6 कुओं, की आवश्यकता होगी।
    1. इस परख के लिए सकारात्मक नियंत्रण (सी बेलगाम विष ए) तैयार करने के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस से 3-μl aliquots (1 माइक्रोग्राम / μl) प्राप्त करने और ultrapure पानी के 297 μl जोड़ने के लिए, 0.01 माइक्रोग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता उपज। बर्फ पर रखें।
    2. प्रत्येक नमूना के लिए उनकी dilutions (10 -1 10 -6 के लिए) के साथ कुओं लेबल और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का संकेत मिलता है (डीपी # 1 लेआउट देखें)।
    3. 1x पीबीएस की उचित मात्रा में प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें। 10 -1 कुओं में, कोई पीबीएस जोड़ें। 10 -2 10 -6 के लिए कुओं के लिए, 1x पीबीएस के 90 μl जोड़ें।
    4. नमूनों की उचित मात्रा में प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें। 10 -1 कुओं में, प्रत्येक नमूना के लिए 10 -1 शेयर के 100 μl जोड़ने (फिल्टर बेनी से कदम 5.5.7 देखनाई)। 10 -2 10 -6 कुओं के लिए, धारावाहिक dilutions बनाने के लिए; 10 -1 अच्छी तरह से 10 μl ले रही है और 10 -2 को यह अच्छी तरह से जोड़कर शुरू करते हैं। 10 -6 कमजोर पड़ने के लिए बाहर धारावाहिक dilutions जारी रखें।
    5. एक स्पष्ट प्लास्टिक चिपकने वाला मुहर के साथ डीपी # 1 प्लेट कवर और बर्फ पर जगह है।
  7. बनाना कमजोर पड़ने प्लेट # 2
    नोट: कमजोर पड़ने प्लेट (डीपी # 2) सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित प्रत्येक नमूना, (देखें वेरो सेल वर्कशीट पर डीपी # 2 लेआउट) के लिए 6 कुओं के 2 गलियों की आवश्यकता होगी।
    1. प्रत्येक नमूना के लिए उनकी dilutions (10 -1 10 -6 के लिए) के साथ कुओं लेबल और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का संकेत मिलता है (डीपी # 2 लेआउट देखें)। नमूना नाम या अतिविष के साथ नमूना नाम ( "के रूप में वह विषनाशक कुएं" चिह्नित) ( "के रूप में नमूना कुओं" चिह्नित) के साथ कुओं लेबल।
    2. इस परख के लिए आवश्यक अतिविष की राशि की गणना। ध्यान दें: अतिविष एक 25x शेयर हैसमाधान की जरूरत है कि 1x पीबीएस में 01:25 पतला होना करने के लिए। बर्फ पर तैयार अतिविष 1x समाधान रखें।
    3. के लिए "नमूना कुओं," ठीक है कि नमूने के सभी dilutions (10 -1 10 -6) के लिए प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस के 20 μl जोड़ें। के लिए "अतिविष कुओं," ठीक है कि नमूने के सभी dilutions (10 -1 10 6) के लिए प्रत्येक के लिए 1x अतिविष के 20 μl जोड़ें।
    4. 6 और 7 पंक्तियाँ - - पंक्तियों 1 के लिए डीपी # 2 पर डीपी # 1 से कुओं में स्थानांतरण पतला नमूना के 20 μl नामित कुओं में 12 (देखें वेरो सेल वर्कशीट पर डीपी # 2 लेआउट)। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे समाधान मिश्रण।
    5. एक स्पष्ट प्लास्टिक चिपकने वाला सील के साथ कवर डीपी # 2 और कमरे के तापमान पर ऊष्मायन के 40 मिनट के लिए अनुमति देते हैं। इस ऊष्मायन अतिविष बाँध और इस तरह निष्क्रिय और सी बेलगाम विष को बेअसर करने की अनुमति है।
    6. ऊष्मायन के बाद, (उचित वेरो सेल कुओं के लिए डीपी # 2 से मिश्रण के 10 μl जोड़ने वी पर वेरो सेल प्लेट लेआउट देखनेERO सेल वर्कशीट)। धीरे ऊपर और नीचे pipetting, देखभाल करने के वेरो कोशिकाओं है कि कुओं के नीचे की सतह का पालन कर रहे बाधित नहीं करने के द्वारा समाधान मिश्रण।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रात भर वेरो सेल प्लेट सेते हैं और 5% सीओ 2।
  8. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग गोलाई लिए वेरो कोशिकाओं का आकलन (2 दिन)
    नोट: याद है कि 10 के एक पहलू से कमजोर पड़ने कारक परिवर्तन जब वेरो सेल प्लेट के लिए नमूना मिश्रण जोड़ने (जैसे, 10 -3 अब 10 -4) है। वेल्स अतिविष मौजूद है कि कोई वेरो सेल गोलाई करने के लिए थोड़ा उल्लेख किया जाना चाहिए था। वेरो सेल गोलाई (cytotoxicity) नमूने है कि सी बेलगाम विष शामिल में नोट कर दी जाएगी। साइटोटोक्सिक गतिविधि एक कमजोर पड़ने नमूना और अतिविष युक्त निष्प्रभावी है, तो सी बेलगाम विष वेरो सेल cytotoxicity में जिसके परिणामस्वरूप की उपस्थिति की पुष्टि की है।
    1. वेरो सेल गोलाई लिए जांच एक ligh का उपयोग कर200X बढ़ाई टी माइक्रोस्कोप। नमूना कुओं (सकारात्मक नियंत्रण सहित) के लिए, अच्छी तरह से 80% वेरो सेल गोलाई का उल्लेख किया है करने के लिए पिछले है कि के कमजोर पड़ने रिकॉर्ड है।
    2. साइटोटोक्सिक अनुमापांक, जो सबसे ज्यादा कमजोर पड़ने कि प्रति नमूना जी 80% वेरो सेल गोलाई उत्पादन के पारस्परिक रूप में परिभाषित किया जाता है की गणना। उदाहरण के लिए, सबसे कमजोर पड़ने 10 -5 है, तो कमजोर पड़ने कारक 10 -6 इस नमूने के लिए हो सकता है अगर। इस प्रकार, लॉग [अंतिम कमजोर पड़ने कारक] / नमूना के जी [10 6], जो 6 के एक पारस्परिक अनुमापांक पैदावार के लिए लॉग इन किया जाएगा।
      नोट: - 4 मार्ग और कोई 30 से अधिक अंश इस परख 26 में उनके उपयोग के लिए पहले वेरो कोशिकाओं की जरूरत कम से कम 3 आया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

एक प्रतिनिधि अध्ययन के दौरान, 5 सप्ताह पुराने C57BL / 6 WT चूहों 5 दिनों के लिए उनके पीने के पानी (0.5 मिलीग्राम / एमएल) में Cefoperazone साथ pretreated और एक 2 दिन नियमित रूप से पीने के पानी के साथ बाहर धोने की अनुमति दी गई। चूहे दिन 0 (चित्रा 1 ए) पर मौखिक gavage के माध्यम से सी बेलगाम R20291 का 10 5 बीजाणुओं के साथ चुनौती दी थी। चूहे 14 दिनों के लिए CDI के वजन घटाने और नैदानिक ​​लक्षण (सुस्ती, अनिच्छा, दस्त, और hunched मुद्रा) के लिए निगरानी की गई। सी बेलगाम R20291 बीजाणुओं के साथ C57BL / 6 WT चूहों की चुनौती 24 घंटा और 48 घंटे बाद चैलेंज (चित्रा 1 बी) के भीतर महत्वपूर्ण वजन घटाने के भीतर दस्त में हुई। हालांकि इस प्रयोग में नहीं मनाया, सी बेलगाम R20291 के एक उच्च खुराक के साथ चुनौती दी चूहों गंभीर रूप से बीमार हो जाते हैं या 48 से 20% से अधिक वजन कम कर सकते हैं - 72 घंटा के बाद चुनौती इस प्रकार मानवीय इच्छामृत्यु की जरूरत महसूस। इसलिए, चूहों दो बार दैनिक की एक न्यूनतम आवश्यकतासी बेलगाम बीजाणुओं के साथ चुनौती के बाद निगरानी।

7 डाक-चैलेंज (चित्रा 1 बी) - इस प्रतिनिधि अध्ययन में, वजन घटाने और चूहों में इस रोग के नैदानिक लक्षण का एक महत्वपूर्ण राशि भी 2 दिन पर मनाया गया। 7 दिनों के बाद चुनौती, चूहों के वजन हासिल करने के लिए शुरू किया, और रोग के नैदानिक ​​लक्षण थम गया। प्रयोग के अंतिम सप्ताह तक चूहों CDI के नैदानिक ​​लक्षण, दस्त सहित का कोई सबूत के साथ चिकित्सकीय सामान्य दिखाई दिया।

Fecal छर्रों सी बेलगाम बीजाणुओं के साथ चुनौती है और हर 48 घंटे बाद चैलेंज (चित्रा 1 सी) के लिए पहले एकत्र किए गए थे। एंटीबायोटिक उपचार के लिए पहले, चूहों सी बेलगाम साथ उपनिवेश नहीं थे। भीतर सी बेलगाम बीजाणुओं के साथ 24 घंटे बाद चुनौती, चूहों मल के प्रति जी सी बेलगाम का 10 7 CFUs (चित्रा 1C <साथ उपनिवेश थे/ Strong>)। चूहे लगातार प्रयोग के पिछले 7 दिनों के लिए वजन घटाने या CDI के नैदानिक लक्षण के कोई सबूत नहीं होने के बावजूद, प्रयोग के दौरान सी बेलगाम साथ उपनिवेश रहे।

आकृति 1
चित्रा 1: Cefoperazone इलाज सी बेलगाम R20291 प्रदर्शनी वजन घटाने के साथ चुनौती दी है और सी बेलगाम साथ उपनिवेश रहे हैं चूहे। ए) 5 सप्ताह पुराने C57BL / 6 गुम्मट JAX चूहों (एन = 3 एम / समूह प्रति 3F) 5 दिनों के लिए उनके पीने के पानी (0.5 मिलीग्राम / एमएल) में Cefoperazone साथ pretreated थे और 2 दिन नियमित रूप से पीने के साथ बाहर धोने की अनुमति दी पानी। चूहे दिन 0. चूहे 14 दिनों के लिए CDI के वजन घटाने और नैदानिक लक्षण (सुस्ती, अनिच्छा, दस्त, और hunched मुद्रा) के लिए निगरानी की गई पर मौखिक gavage के माध्यम से सी बेलगाम R20291 का 10 5 बीजाणुओं के साथ चुनौती दी थी। मल एकत्र की है और बैक्टीरियल गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था से पहले Cefoperazone शुरू करने के लिए, तुरंत afteआर एंटीबायोटिक परिष्करण, और दिनों 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, और 14 के संक्रमण के दौरान। शव-परीक्षा दिनों 0, 2, 4, 7 पर प्रदर्शन किया गया था, और 14 बी) चूहों सी बेलगाम R20291 के साथ चुनौती के बाद अपने आधारभूत वजन का एक महत्वपूर्ण राशि खो दिया है। चूहों की औसत वजन के माध्यम से 7 दिन 0. महत्वपूर्ण वजन घटाने दिन 2 पर देखा गया था से दैनिक मापा गया था जब दिन 0, आधारभूत वजन की तुलना में। चुनौती के बाद मल में सी) सी बेलगाम R20291 जीवाणु भार। सी बेलगाम बीजाणुओं के साथ चुनौती के बाद 24 घंटे के भीतर, सभी चूहों 10 7 CFUs (कॉलोनी के गठन इकाइयों) प्रति मल के जी के साथ उपनिवेश थे। इन मानकों में कोई महत्वपूर्ण मतभेद महिलाओं और पुरुषों के बीच देखा गया। महत्व गैर पैरामीट्रिक Kruskal वालिस एक तरह से एनोवा परीक्षण डन posttest (के बाद से निर्धारित किया गया था *, पी ≤ 0.05; **, पी ≤ 0.01; ***, पी ≤ 0.001; ****, पी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चार चूहों (2 पुरुषों और 2 महिलाओं) नम्रता euthanized और, 0 दिन पर शव-परीक्षा के लिए तैयार करने से पहले संक्रमण, के रूप में असंक्रमित नियंत्रण की सेवा के लिए किया गया। इसके अलावा, प्रत्येक पिंजरे से एक माउस नम्रता euthanized किया गया था और दिन 2, 4, 7 पर शव-परीक्षा के लिए तैयार है, और 14 के बाद चुनौती (चित्रा 1 ए)। Cecal सामग्री के भीतर सी बेलगाम का गणन प्रत्येक शव-परीक्षा में प्रदर्शन किया था। मल गणना के साथ सामंजस्य में, कोई सी बेलगाम से पहले सी बेलगाम के साथ चुनौती देने के लिए चूहों के cecal सामग्री में खोजा गया था। 48 घंटे बाद चुनौती, चूहों के प्रति cecal सामग्री के जी सी बेलगाम का लगभग 10 8 CFUs साथ उपनिवेश थे (चित्रा2A)। सभी चूहों लगातार प्रयोग के दौरान उपनिवेश रहे।

Cecal सामग्री भी सी बेलगाम वेरो सेल cytotoxicity परख का उपयोग विष की उपस्थिति के लिए संक्रमण भर में मूल्यांकन किया गया था। सी बेलगाम विष cytotoxicity का कोई सबूत चुनौती (चित्रा 2 बी) के लिए पहले cecal सामग्री में पाया गया था। सी बेलगाम cytotoxicity 2 दिन सी बेलगाम बीजाणुओं के साथ चुनौती के बाद पता चला है और संक्रमण के दौरान कायम किया गया था। सी बेलगाम के साथ काफी वर्दी उपनिवेशवाद के बावजूद, सी बेलगाम साइटोटोक्सिक गतिविधि के स्तर में बदलाव व्यक्तिगत चूहों (चित्रा 2 बी) में स्पष्ट है।

माउस cecal वेरो सेल cytotoxicity परख के दौरान सी बेलगाम अतिविष साथ निष्प्रभावी सामग्री के बहुमत और cytotoxicity के कोई सबूत नहीं था (वेरो सीईप्रदर्शन dilutions में गोलाई) करेंगे। 10 -1 कमजोर पड़ने (कमजोर पड़ने जहां नमूना सबसे केंद्रित है) में 100% cytotoxicity, वेरो सेल अन्य dilutions में गोलाई का कोई सबूत के साथ - हालांकि, कुछ व्यक्तिगत चूहों, retesting के बावजूद, 50 का सबूत था। अतिविष इस परख में उपयोग सी बेलगाम विष को एक निष्क्रिय पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी, बकरी 27 में तैयार किया है। इसलिए, इस अतिविष सी बेलगाम बाइनरी विष है कि तनाव R20291 द्वारा निर्मित है बेअसर नहीं हो सकता। हालांकि, सी बेलगाम बाइनरी विष साइटोटोक्सिक 10 नहीं माना जाता है। अत्यधिक सी बेलगाम विष अतिविष या किसी अन्य के साइटोटोक्सिक से सी बेलगाम विष इस खोज के लिए योगदान किया जा सकता है अन्य एजेंट की उपस्थिति से निष्प्रभावी किया जा करने में असमर्थ। इस अवलोकन, इन नमूनों के लिए cytotoxicity अनुमापांक के निर्धारण को प्रभावित नहीं किया, क्योंकि प्रत्येक नमूना के 80% वेरो सेल गोलाई के साथ पिछले कमजोर पड़ने थाcytotoxicity के कोई सबूत नहीं है जब निर्दिष्ट कमजोर पड़ने पर वह विषनाशक के साथ संयुक्त।

चित्र 2
चित्रा 2: सी के साथ संक्रमण के दौरान Cecum और cytotoxicity का औपनिवेशीकरण। बेलगाम R20291। ए) चूहे Ceca लगातार नैदानिक लक्षण के संकल्प और मनाया वजन के बावजूद, प्रयोग के दौरान सी बेलगाम साथ उपनिवेश रहे। जब 2 दिनों के बाद चुनौती पर मूल्यांकन सभी चूहों प्रति cecal सामग्री की जी अधिक से अधिक 10 8 CFUs साथ उपनिवेश थे। बी) सी के साथ संक्रमण के दौरान cecal सामग्री से वेरो सेल cytotoxicity परख। बेलगाम R20291। सी बेलगाम बीजाणुओं के साथ चुनौती के बाद, चूहों के रूप में प्रति दिन 2, 4 पर cecal सामग्री के छ विष का लॉग 10 पारस्परिक कमजोर पड़ने में मापा जाता है, और 7 के बाद चुनौती 0 दिन की तुलना में, cytotoxicity के महत्वपूर्ण स्तर था (medians representeलाइन द्वारा डी)। **, पी ≤ 0.01; ***, पी ≤ 0.001; ****, पी ≤ 0.0001 महत्व गैर पैरामीट्रिक Kruskal वालिस एक तरह से एनोवा परीक्षण डन posttest (*, पी ≤ 0.05 से पीछा द्वारा निर्धारित किया गया था )। त्रुटि सलाखों मतलब से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह सिफारिश की है कि histologic मूल्यांकन एक बोर्ड द्वारा प्रमाणित एक अंधे ढंग से पशु चिकित्सा रोगविज्ञानी द्वारा आयोजित किया जाता है। ऊतक स्कोरिंग के लिए, एक 0-4 संख्यात्मक स्कोरिंग प्रणाली अलग लघ्वान्त्र, अंधान्त्र, और एक पहले से प्रकाशित स्कोरिंग स्कीम 17 के आधार पर पेट में सूजन, सूजन सेल घुसपैठ, और उपकला कोशिका क्षति का आकलन करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए।

अंधा histopathologic परीक्षा परसी बेलगाम R20291 साथ murine लघ्वान्त्र, अंधान्त्र, और पेट के निम्न चुनौती से निपटने के ination, सबसे महत्वपूर्ण वैकृत परिवर्तन अंधान्त्र (चित्रा 3) में उल्लेख किया गया था। कुल cecal histologic स्कोर 0 दिन और दिन 2 और 4 के बाद चुनौती के बीच काफी अलग थे। कोई महत्वपूर्ण घावों में संक्रमण के दौरान लघ्वान्त्र (चित्रा 3) में उल्लेख किया गया था। मामूली घावों पेट में नोट किया गया। कुल colonic ऊतकीय स्कोर 0 दिन और दिन 2 और 7 पद चुनौती (चित्रा 3) के बीच काफी अलग थे।

प्रतिनिधि एच ई संक्रमण भर लघ्वान्त्र, अंधान्त्र, और पेट के वर्गों चित्रा 4 में उपलब्ध हैं के रूप में एक अंधे बोर्ड द्वारा प्रमाणित पशु चिकित्सा रोगविज्ञानी द्वारा निर्धारित प्रत्येक छवि, अपने-अपने कुल ऊतकीय स्कोर और उपकला क्षति, सूजन, और सूजन के लिए व्यक्तिगत स्कोर है ( एसएएम)।


चित्रा 3: Murine Ileum, cecum के histological स्कोरिंग, और पेट के सी के साथ संक्रमण के दौरान। बेलगाम R20291। उपकला क्षति, सूजन, और सूजन: कुल ऊतकीय स्कोर मूल्यांकन के मापदंडों से सभी तीन के स्कोर को जोड़कर गणना की गई। कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन histopathological संक्रमण भर लघ्वान्त्र में नोट किया गया। Cecal ऊतक CDI के दौरान सबसे महत्वपूर्ण ऊतकीय घावों निहित। कुल cecal ऊतकीय स्कोर दिन 2 और 4 के बाद चुनौती पर 0 दिन से काफी अलग थे। मामूली घावों पेट में नोट किया गया। कुल colonic ऊतकीय स्कोर दिनों 2 और 7 के बाद चुनौती पर 0 दिन से काफी अलग थे। महत्व गैर पैरामीट्रिक Kruskal वालिस एक तरह से एनोवा परीक्षण डन posttest (के बाद से निर्धारित किया गया था *, पी ≤ 0.05; **, पी ≤ 0.01; ***, पी804; 0.001; ****, पी ≤ 0.0001)। त्रुटि सलाखों मतलब से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: सी के साथ संक्रमण के दौरान हिस्तोपैथोलोजी। बेलगाम R20291। इस पैनल प्रतिनिधि एच ई सी बेलगाम R20291 के साथ संक्रमण के दौरान लघ्वान्त्र, अंधान्त्र, और पेट के वर्गों में शामिल है। कुल ऊतकीय स्कोर कोष्ठकों () इसी दिन और सूचीबद्ध ऊतक लिए कर रहे हैं: लघ्वान्त्र दिन के लिए 0 (0), दिन 2 (1), दिन 4 (0), दिन 7 (0), और दिन 14 (0) ; अंधान्त्र दिन के लिए 0 (0), दिन 2 (5), दिन 4 (4), दिन 7 (3), और 14 दिन (3); और पेट के दिन 0 स्थान (0), दिन 2 (4), दिन 4 (1), दिन 7 (4), और दिन के 14 (2)। Photomicrographs एक प्रकाश microscop पर प्राप्त किया गयाएक 5 मेगापिक्सेल डिजिटल कैमरा और उसके साथ सॉफ्टवेयर के साथ ई (पैमाने बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1x PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1x Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  4. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
  5. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. (2016).
  6. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  7. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  8. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  9. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. (2016).
  10. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  11. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  12. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  13. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  14. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  15. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  16. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
  17. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  18. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. (2016).
  19. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  20. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  21. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  22. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
  23. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. e50787 (2013).
  24. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  25. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. Academic Press. 15-40 (2012).
  26. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. Appendix 4, Appendix 4E (2008).
  27. Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
  28. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
  29. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  30. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
  31. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  32. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  33. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
  34. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).
Cefoperazone इलाज के माउस मॉडल नैदानिक ​​प्रासंगिक<em&gt; क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम</em&gt; तनाव R20291
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).More

Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter