Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em> In Situ</em> Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Summary

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Abstract

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introduction

Las mitocondrias y del retículo endoplásmico (ER) no son orgánulos independientes en la célula, pero que interactúan estructural y funcionalmente en los sitios de contacto definidas como las membranas del retículo endoplásmico mitocondrias-asociado (MAM). De hecho, MAM corresponden a regiones en las que las membranas de la ER y mitocondrias están estrechamente yuxtapuestas, permitiendo interacciones entre las proteínas de ambos lados. No obstante, las membranas de estos orgánulos no se fusionan dentro de estas regiones, por lo que mantienen sus entidades separadas. Los MAM juegan un papel crucial en calcio (Ca2 ⁺⁾ y la transferencia de fosfolípidos de ER a las mitocondrias, lo que afecta el metabolismo energético y la supervivencia celular ^1-3.

La asociación entre el RE y las mitocondrias se visualizó por primera vez en la década de 1970 con el microscopio electrónico. Desde entonces, la microscopía electrónica de transmisión de ^{4,5, 6,7} o tomografía electrónica inmuno-localización de ER y mitocondrias específica fluoróforos / proteínas fluorescentes ⁸ fueron utilizados clásicamente para estudiar las interacciones ER-mitocondrias. Otra herramienta útil para el análisis de MAM se basa en el uso de fraccionamiento subcelular. Se permite el aislamiento de fracciones de MAM por ultracentrifugación diferencial acoplado a un gradiente de Percoll ^9. Sin embargo, el producto final contiene fracciones enriquecidas MAM, en lugar de fracciones puras. En conjunto, estas estrategias no son particularmente sensibles y / o cuantitativa, y no son fácilmente susceptibles de gran proyección. Como alternativa, utilizando enfoques genéticos fluorescentes engarces entre orgánulos inducible con las drogas han surgido, pero no permitir que el análisis de las interacciones de los orgánulos en los niveles de expresión endógena de proteínas ^10.

Basado en el descubrimiento de Szabadkai del complejo IP3R / GRP75 / VDAC en el MAM ^11, hemos desarrollado un método cuantitativo para analizar las interacciones ER-mitocondrias. Se utilizó la proximidad situ en ligatien ensayo para detectar y cuantificar las interacciones entre VDAC1 y IP3R1, dos proteínas orgánulo de superficie implicadas en la -channeling complejo Ca2 ⁺ en la interfaz de MAM en células fijadas ^12. En pocas palabras, que probaron VDAC1 en la membrana externa mitocondrial (ratón anti-VDAC1 anticuerpo primario) y IP3R1 en la membrana ER (conejo anti-IP3R1 anticuerpo primario) (Figura 1, panel a). Entonces, de acuerdo con el ensayo, hemos añadido tanto anti-ratón y anti-IgG de conejo (sondas de ensayo de ratón y conejo proximidad ligadura), que se conjuga con extensiones de oligonucleótidos complementarios. Si las dos proteínas específicas, son a una distancia por debajo de 40 nm, los oligonucleótidos pueden hibridar con los oligos de conectores añadidos posteriormente para permitir la formación de una plantilla circular de ADN (Figura 1, panel B). Esta molécula de ADN circular se liga y se amplifica, la creación de un producto de ADN de cadena sencilla unido covalentemente a una de las sondas de proximidad (Figura 1, panel C) </strong>. Dado que la distancia entre el ER y las mitocondrias en la interfaz de MAM se extiende de 10 nm a 25 nm ^6, la ligadura de proximidad y la amplificación se pueden realizar, lo que lleva a la detección posterior debido a la hibridación de Tejas oligonucleótidos rojo marcado sondas (Figura 1, panel D ). Cada punto representa fluorescente interacciones entre VDAC1 / IP3R1, lo que permite la cuantificación de las interacciones in situ ER-mitocondrias en las células individuales.

Figura 1: ilustración esquemática de la detección de las interacciones retículo endoplásmico-mitocondrias por In Situ proximidad ligadura de ensayo. a) un anticuerpo primario de ratón dirigido contra VDAC1 y un anticuerpo primario de conejo dirigido contra IP3R1 puede unirse a sus epítopos en la proximidad a la interfaz de MAM, b) la adición de un par de sondas de ligación de proximidaddirigida contra ratón y IgG de conejo. Estas sondas se han unido las hebras de ADN que pueden formar plantillas para la ligación de oligonucleótidos de conector. c) La cadena de ADN circular formada después de la ligadura se puede amplificar y d) se visualizaron por microscopía fluorescente como un punto mediante el uso de oligonucleótidos de Texas rojo marcado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Similares en los experimentos de ensayo situ proximidad de ligación se puede realizar con el par GRP75 / IP3R1 de anticuerpos, así como la ciclofilina D (CypD) / anticuerpos IP3R1, teniendo en cuenta que CypD ha demostrado interactuar con el complejo de IP3R / GRP75 / VDAC en la interfaz MAM ^12-14.

Protocol

1. Preparación de soluciones Preparar 10% de formaldehído en PBS (baja en sal) diluyendo 5,5 ml de formaldehído al 37% en 14,5 ml de PBS. Preparar 1 M de glicina, pH 8,0, mediante la disolución de 3,8 g de glicina en 50 ml de PBS; diluir esta solución para obtener glicina 100 mM en 1 x PBS. Preparar 0,1% de Triton-X100 en 1x PBS. Preparar 20x Saline citrato de sodio (SSC) utilizando cloruro de 3,0 M de sodio y citrato trisódico 0,30 M preparado en un tampón de agua desionizada con pH 7,0 a 25…

Representative Results

Sobre la base de nuestra experiencia en el uso de este protocolo, con seguridad podemos recomendar este método para la visualización y cuantificación de las interacciones ER-mitocondrias en las células fijadas. Imágenes representativas de en las interacciones in situ de ligación proximidad de ensayo-visualizado ER-mitocondrias en la línea celular de hepatocarcinoma HuH7, utilizando varios pares de anticuerpos, se muestran. Como se muestra en la Figura 2</…

Discussion

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b…

Materials

Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10X	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1X
Tween 100X	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and  Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html