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Biology

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch doi: 10.3791/54899 Published: December 10, 2016

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.

Introduction

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Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) nicht unabhängig sind Organellen in der Zelle, aber sie interagieren strukturell und funktionell an Kontaktstellen definiert als Mitochondrien-assoziierte endoplasmatischen Retikulum Membranen (MAM). Tatsächlich entsprechen MAMs zu Regionen, in denen die Membranen des ER und Mitochondrien eng angelagert werden, so dass Wechselwirkungen zwischen Proteinen von beiden Seiten. Dennoch verschmelzen die Membranen dieser Organellen nicht innerhalb dieser Regionen, so behalten sie ihre separate Einheiten. Die MAMs spielen eine entscheidende Rolle bei der Calcium (Ca 2+) und Phospholipid Transfer von ER zu den Mitochondrien, den Energiestoffwechsel und das Überleben der Zellen 1-3 zu beeinträchtigen.

Die Assoziation zwischen dem ER und Mitochondrien wurde zuerst in den 1970er Jahren mit der Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht. Seitdem Transmissionselektronenmikroskopie 4,5, Elektronentomographie 6,7 oder Immuno-Lokalisierung von ER und Mitochondrien-spezifischen Fluorophores / fluoreszierende Proteine 8 wurden klassisch zu studieren ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen. Ein weiteres nützliches Werkzeug für die Analyse von MAM auf der Verwendung von subzellulären Fraktionierung basiert. Es erlaubt die Isolierung von MAM Fraktionen durch Differential Ultrazentrifugation gekoppelt mit einem Percollgradienten 9. Allerdings enthält das Endprodukt angereichert MAM Fraktionen, anstatt reinen Fraktionen. Insgesamt sind diese Strategien nicht besonders empfindlich und / oder quantitative, und sie sind nicht leicht zugänglich für große Screening. Alternativ haben genetische Ansätze unter Verwendung von arzneimittel induzierbaren fluoreszierendes inter-Organell Linkern entstanden, aber sie haben nicht die Analyse von Organell Wechselwirkungen an den endogenen Expressionsniveaus von 10 Proteinen ermöglichen.

Basierend auf Szabadkai Entdeckung des IP3R / Grp75 / VDAC Komplex im MAM 11 entwickelten wir eine quantitative Methode ER-Mitochondrien - Interaktionen zu analysieren. Wir haben die in situ Nähe ligatiauf Assay Wechselwirkungen zwischen VDAC1 und IP3R1 zwei Organell-Oberflächenproteine im Ca 2+ -channeling Komplex an der Grenzfläche MAM in fixierten Zellen 12 beteiligt zu detektieren und zu quantifizieren. Kurz gesagt, sondiert wir VDAC1 an der äußeren mitochondrialen Membran (Maus - anti-VDAC1 primärer Antikörper) und IP3R1 an der ER - Membran (Kaninchen - anti-IP3R1 primärer Antikörper) (Abbildung 1, Tafel A). Dann wird gemäß dem Test haben wir sowohl anti-Maus- und anti-Kaninchen-IgG (Maus und Kaninchen Proximity Ligation Assay-Sonden), die an komplementäre Oligonukleotid Erweiterungen konjugiert sind. Wenn die beiden Proteine gezielt in einem Abstand von weniger als 40 nm sind, können die Oligonukleotide mit den anschließend zugegeben Verbinder Oligos hybridisieren die Bildung einer kreisförmigen DNA - Templat (1, Feld B) zu ermöglichen. Diese kreisförmige DNA - Molekül ligiert und amplifiziert, eine einzelsträngige DNA - Produkt kovalent an einer der Näherungssensoren zu schaffen (Abbildung 1, Tafel c) 6, Proximity Ligation und Amplifikation kann durchgeführt werden, aufgrund der Hybridisierung von Texasrot-markierten Oligonukleotidsonden zum anschließenden Nachweis führen (Abbildung 1, Tafel d ). Jeder fluoreszierenden Punkt repräsentiert Wechselwirkungen zwischen VDAC1 / IP3R1, so dass die Quantifizierung der in - situ - ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen in einzelnen Zellen.

Abbildung 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Detektion von endoplasmatischen Retikulum-Mitochondrien Wechselwirkungen von In Situ Proximity Ligation Assay. a) Antikörpers Eine Maus primären gegen VDAC1 und ein Kaninchen primären Antikörper gerichtet gegen IP3R1 an ihre Epitope in der Nähe an der Schnittstelle MAM binden kann, b) die Zugabe eines Paares von Annäherungs Ligierung Sondengegen Maus und Kaninchen-IgG. Diese Sonden wurden DNA-Stränge befestigt, die Vorlagen für die Unterbindung des Steckers Oligos bilden können. c) Die kreisförmige DNA - Strang nach Ligatur gebildet wird, kann verstärkt und d) durch Mikroskopie als fluoreszierender Punkt unter Verwendung Texas rot-markierten Oligonukleotiden sichtbar gemacht werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ähnliche in situ Proximity Ligation Assay Experimente können mit dem Grp75 / IP3R1 Paar von Antikörpern sowie Cyclophilin D (CypD) / IP3R1 Antikörper durchgeführt werden, wenn man bedenkt , dass CypD wurde an der MAM Schnittstelle mit dem IP3R / Grp75 / VDAC - Komplex interagieren gezeigt 14.12.

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Protocol

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1. Herstellung der Lösungen

  1. Herstellung von 10% Formaldehyd in PBS (low-Salz) von 5,5 ml 37% Formaldehyd in 14,5 ml PBS verdünnt. Vorbereitung 1 M Glycin, pH 8,0, die durch Auflösen von 3,8 g Glycin in 50 ml PBS; verdünnt diese Lösung 100 mM Glycin in 1x PBS zu erhalten.
  2. Bereiten 0,1% Triton-X100 in 1x PBS. Bereiten Sie 20x Saline Sodium Citrate (SSC) unter Verwendung von 3,0 M Natriumchlorid und 0,30 M Trinatriumcitrat in einem VE-Wasser-Puffer mit pH 7,0 bei 25 ° C. Verdünnen Sie diesen Puffer auf 1x und 0,01x entsalztes Wasser.

2. Fixierung von Zellen

HINWEIS: Es wird verwendet , um die HuH7 hepatocarcinoma Zelllinie in dieser Studie, aber dieses Verfahren ist anwendbar auf andere adhärente Zellkulturen.

  1. Platte HuH7 Zellen (kultiviert in DMEM 1 g / l Glucose, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 0,01% Penicillin-Streptomycin Lager) bei 150000 Zellen pro unbeschichteten 35-mm Glasbodenschale. Bei Arbeiten an PrimärzelleKulturen, verwenden Kollagen-beschichteten Schalen.
  2. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Kulturmedium. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und absaugen. Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Formaldehyd 10% und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren.
  3. Stoppen Sie die Reaktion mit 1 ml 1 M Glycin und mischen durch Rotation. Entfernen Sie die Stopp-Reaktionslösung und die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml 1x PBS; durch Rotation und absaugen agitieren. 1 ml 100 mM Glycin zu den Zellen und inkubiere sie für 15 min bei RT unter Rühren und dann absaugen.
    HINWEIS: Das Protokoll hier angehalten werden kann und die folgenden Schritte können auf einen anderen Tag verschoben werden. In diesem Fall 1 ml 100 mM Glycin und halten bei 4 ° C, falls erforderlich.

3. Die Permeabilisierung der Zellen

  1. 1 ml 0,1% Triton-X100 in 1x PBS, Inkubation für 15 min bei RT unter Rühren, und dann gründlich absaugen. Diese Inkubationszeit erhöht 15 werden konnte - 20 min, wenn sie auf Primärzelle cultur Arbeitses (zB primäre Mäuse Hepatozyten). Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml 1x PBS; aspirieren.

4. Sperren

  1. Werden 40 & mgr; l Blockierungslösung zu jeder Probe (vom kit); Dieses Volumen kann erhöht werden, um die Probe zu bedecken. Inkubiere das Geschirr für 30 min bei 37 ° C in einer Feuchtigkeitskammer.
  2. Tippen Sie auf die Blockierungslösung aus der Gerichte. Versuchen Sie, gleich Restvolumina für jede Folie zu erhalten, da diese Reproduzierbarkeit beeinflussen. Lassen Sie sich nicht die Proben trocknen!

5. Primary Antibodies

  1. Verdünnen Sie die primären Antikörper in 1x PBS und fügen Sie die Lösung für die Gerichte (VDAC1 Maus-Antikörper: 1/100, IP3R1 Kaninchen-Antikörper: 1/500). Alternativ Grp75 oder CypD Antikörper (beide Maus-Antikörper bei 1/500 verwendet wird) kann anstelle von VDAC1 verwendet werden.
  2. Inkubieren über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4 ° C. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit Tris-gepufferte Salzlösung mit 0,01% Tween (TBS-T).
  1. Proximity-Ligation-Assay-Sonden werden von dem Kit zur Verfügung gestellt. Wählen Sonden entsprechend den Arten von primären Antikörpern.
  2. Bereiten Sie die beiden Proximity Ligation Assay-Sonden 1: 5 in Antikörperverdünnung. Lassen Sie die Mischung 20 min bei RT zu sitzen. Fügen Sie die verdünnte Nähe Ligatur Assaysonde Lösung. Inkubieren des Geschirrs in einem vorgewärmten Feuchtigkeitskammer für 1 h bei 37 ° C. Waschen Sie die Gerichte zweimal mit TBS-T.

7. Ligatur

  1. Verwenden Sie die in - situ - Nachweisreagenz Texas rot - Kit.
  2. Verdünnen Sie die 5-fach Ligatur Lager (zur Verfügung gestellt von dem Kit) 1: 5 in hochreinem Wasser und gut mischen. Verdünnen Sie die Ligase in 1x Ligierungslösung (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 01.40 und Wirbel. Warten, um die Ligase hinzuzufügen, bis unmittelbar vor der Zugabe zu den Proben.
  3. Diese Lösung wird zu jeder Probe (40 ul für 35-mm-Glasbodenschalen) und Inkubation der Objektträger in einem vorgewärmten Feuchtigkeit chamber für 30 min bei 37 ° C. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit TBS-T.

8. Amplification

HINWEIS: Achten Sie darauf, lichtempfindliche Reagenzien.

  1. Verdünnen Sie die 5-fach Verstärkung Lager (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 1: 5 in hochreinem Wasser. Entfernen Sie die Polymerase aus der Tiefkühltruhe mit dem Gefrierblock (-20 ° C). Verdünnen Sie die Polymerase (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 1:80 in der 1x Verstärkerlösung und Wirbel. Fügen Sie die Polymerase unmittelbar vor der Mischung verwendet wird.
  2. Diese Lösung wird zu jeder Probe (40 ul für 35-mm-Glasbodenschalen). Inkubieren der Objektträger in einem vorgewärmten feuchten Kammer für 100 min bei 37 ° C. Tippen Sie auf die Amplification-Polymerase-Lösung aus der Folien.

9. Schluss Waschen

  1. Waschen Sie die Folien in 1x SSC Waschpuffer für 2 min. Waschen Sie die Folien in 0,01x SSC Waschpuffer für 2 min. Lassen Sie die Gerichte im Dunkeln bei RT trocknen.

10. Vorbereitung für Imaging

Montieren Sie die Folien ein minimales Volumen von Montagemedium enthält DAPI (wässrige und nicht erstarrt), um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter dem Deckglas verfangen. Nagellack kann verwendet werden, um die Kanten zu versiegeln. Warten Sie ca. 15 Minuten vor der Verwendung eines Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop zu analysieren (Anregung: 594 nm, Emission: 624 nm, Vergrößerung: 63X).
  • Nach der Bebilderung, speichern Sie die Objektträger bei -20 ° C im Dunkeln.
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    Representative Results

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    Basierend auf unserer Erfahrung dieses Protokoll verwenden, können wir diese Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von ER-Mitochondrien-Wechselwirkungen in fixierten Zellen sicher zu empfehlen. Repräsentative Bilder von in situ Proximity Ligation Assay-visualisierten ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen in der HuH7 hepatocarcinoma Zelllinie unter Verwendung von mehreren Paaren von Antikörpern, gezeigt. Wie in Figur 2 durch Fluoreszenzmikroskopie gezeigt, stellt jede rote Punkt eine Wechselwirkung zwischen den beiden Zielproteine und Zellkerne in blau angezeigt. Als Negativkontrolle führte die Verwendung von nur einer primären Antikörpers zu keinem Signal (Bild 2, Bild A), das doppelten Erkennungsanforderung für in situ Proximity Ligation Assay Signalerzeugung validiert werden . Herkömmlicherweise analysieren wir ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen die VDAC1 / IP3R1 Paar von Antikörpern (Abbildung 2, Platte b) verwendet wird . Ähnlich wie in situ Nähe Ligatur Assay experiments könnte auch mit den Grp75 / IP3R1 oder CypD / IP3R1 Paare von Antikörpern (Abbildung 2, Paneele c bzw. d) durchgeführt werden, da Grp75 ein Chaperon im MAM Schnittstelle 11 koppelt VDAC und IP3R und CypD wurde mit zusammenzuwirken gezeigt die VDAC / Grp75 / IP3R Ca 2+ -channeling Komplex 12-14. Quantifizierung der fluoreszierenden Punkte können entweder Blob-Finder 15 oder ImageJ Software durchgeführt werden. Da die Kerne von Zellen in blau markiert sind, Quantifizierungen der ER-Mitochondrien-Interaktionen pro Zelle sind geeignet auszuführen. Wir validiert gründlich diesen Test 12, und wir können feststellen , dass diese Zielproteine sind gute Kandidaten ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen zu untersuchen.

    Figur 2
    Abbildung 2: Visualisierung der VDAC1 / IP3R1, Grp75 / IP3R1 und CypD / IP3R1 Wechselwirkungen von In Situ Nähe Ligation-Assay in HuH7 Zellen. Die Zellkerne erscheinen in blau, und Wechselwirkungen zwischen den beiden Zielproteine ​​sind in rot dargestellt (63X Vergrößerung, Skala bar = 20 & mgr; m). Wir zeigen, dass VDAC1, Grp75 und CypD mit IP3R1 interagieren. Als Negativkontrolle zeigen wir, dass nur eine primäre Antikörper nicht zu roter Fluoreszenz führt. Um zu überprüfen, haben den Test mehrere andere Kontrollen durchgeführt worden, um nachzuweisen, dass VDAC1, Grp75 und CypD nicht mit anderen ER-Proteine ​​interagieren und dass IP3R1 verursacht keine Wechselwirkungen mit anderen mitochondrialen Proteine ​​(Daten nicht gezeigt, siehe Nr. 9 und 13). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Acknowledgments

    Wir danken allen Menschen in unserem Labor, die das Protokoll beigetragen zu optimieren und zu validieren. Diese Arbeit wurde von INSERM und der nationalen Forschungsagentur (ANR-09-JCJC-0116 UND ANR-11-BSV1-033-02) unterstützt. ET wurde während ihrer Promotion durch ein Forschungsstipendium aus dem Französisch Ministerium für Hochschulbildung und Forschung unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Formaldehyde Sigma F-8775
    Glycine Sigma G-8898
    Triton Sigma T8532
    35 mm Glass bottom culture dishes MatTeK corporation P35G-0-14-C
    Blocking solution Sigma DUO-92004 or DUO-92002 provided in the Duolink PLA probes, Sigma
    VDAC1 antibody Abcam ab14734
    IP3R1-H80 antibody Santa Cruz sc28614
    CypD antibody Abcam ab110324
    Grp75 antibody Santa Cruz sc13967
    TBS 10x euromedex ET220 Dilute to obtain 1x
    Tween 100x euromedex 2001-B dilute in TBS to obtain 0,01%
    PLA Probes Mouse MINUS Sigma DUO-92004 Duolink, Sigma
    PLA Probes Rabbit PLUS Sigma DUO-92002 Duolink, Sigma
    Duolink detection reagents red Sigma DUO-92008 Duolink, Sigma
    Ligation solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Ligase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Amplification solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Polymerase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Duolink Mounting Medium Sigma DUO80102 Duolink, Sigma
    Softwares
    Blob-finder software BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
    ImageJ software Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen
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    Tubbs, E., Rieusset, J. Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells. J. Vis. Exp. (118), e54899, doi:10.3791/54899 (2016).More

    Tubbs, E., Rieusset, J. Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells. J. Vis. Exp. (118), e54899, doi:10.3791/54899 (2016).

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