Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Studier av endoplasmatiske retikulum og mitokondrier Interaksjoner med doi: 10.3791/54899 Published: December 10, 2016

Summary

Her beskriver vi en prosedyre for å visualisere og kvantifisere med høy følsomhet endogene samspillet mellom det endoplasmatiske retikulum og mitokondrier i faste celler. Protokollen har en optimalisert in situ nærhet ligation analysen rettet mot inositol 1,4,5-trifosfat reseptor / glukose-regulert protein 75 / spenningsavhengig anion kanal / cyklofilin D komplekse på mitokondriene assosierte membran grensesnitt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mitokondrier og endoplasmatisk retikulum (ER) er ikke uavhengige organeller i cellen, men de interagerer strukturelt og funksjonelt at kontaktsider er definert som mitokondrier-assosiert endoplasmatiske retikulum membraner (MAM). Faktisk, MAMS tilsvarer regioner hvor membranene ifølge ER og mitokondrier er tett av motstå, slik at interaksjonene mellom proteiner fra begge sider. Likevel, gjør membraner av disse organeller ikke smelter innenfor disse områdene, slik at de opprettholder sine separate enheter. De Mams spiller en avgjørende rolle i kalsium (Ca 2+) og fosfolipid overføring fra ER til mitokondriene, påvirker energiomsetningen og celle overlevelse 1-3.

Sammenhengen mellom ER og mitokondriene ble først visualisert i 1970 med elektronmikroskopi. Siden da transmisjonselektronmikroskopi 4,5, elektron tomografi 6,7 eller immuno-lokalisering av ER og mitokondrier-spesifikke fluoroforens / fluorescerende proteiner 8 ble klassisk brukt til å studere ER-mitokondrier interaksjoner. En annen nyttig verktøy for analyse av MAM er basert på bruk av subcellulære fraksjonering. Det tillater isolering av MAM-fraksjoner ved differensial-ultrasentrifugering koblet til en Percoll-gradient 9. Imidlertid inneholder det endelige produktet anrikede MAM fraksjoner, snarere enn rene fraksjoner. Til sammen er disse strategiene er ikke spesielt følsomme og / eller kvantitativ, og de er ikke lett mottagelig for stor screening. Alternativt har genetiske metoder ved hjelp av narkotika induserbar fluorescerende inter-organelle linkere dukket opp, men de tillater ikke analysen av organelle interaksjoner på endogene uttrykk nivåer av proteiner 10.

Basert på Szabadkai oppdagelse av IP3R / GRP75 / VDAC kompleks på MAM 11, har vi utviklet en kvantitativ metode for å analysere ER-mitokondrier interaksjoner. Vi brukte in situ nærhet ligatipå analyse for å påvise og kvantifisere interaksjoner mellom VDAC1 og IP3R1, to organelle-overflateproteiner involvert i Ca 2+ -channeling komplekse på MAM-grensesnittet i faste celler 12. I korthet, probet vi VDAC1 ved den ytre mitokondriemembranen (mus anti-VDAC1 primære antistoff) og IP3R1 ved ER-membranen (kanin-anti-IP3R1 primære antistoff) (figur 1, felt A). Deretter, i henhold til analysen, tilsatte vi både anti-mus og anti-kanin-IgG (mus og kanin nærhet ligering assay-prober), som er konjugert til komplementære oligonukleotid utvidelser. Hvis de to målrettede proteiner er i en avstand under 40 nm, kan oligonukleotidene hybridisere med de etterfølgende ekstra koblings oligoer for å tillate dannelsen av et sirkulært DNA-templat (figur 1, felt B). Dette sirkulært DNA-molekyl blir ligert og forsterkes, noe som skaper et enkelt-trådet DNA-produkt kovalent bundet til en av nærhets prober (figur 1, felt C) 6, kan nærhet ligering og forsterkning gjøres, noe som fører til etterfølgende påvisning på grunn av hybridisering av Texas Rødt-merkete oligonukleotider sonder (figur 1, panel d ). Hver fluorescerende prikk representerer interaksjoner mellom VDAC1 / IP3R1, og dermed gir kvantifisering av in situ ER-mitokondrier interaksjoner i enkeltceller.

Figur 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av Gjenkjenning av det endoplasmatiske retikulum-mitokondrier Interaksjoner med In Situ Proximity hemorroider analysen. a) En mus primært antistoff rettet mot VDAC1 og et kanin primært antistoff rettet mot IP3R1 kan binde seg til sine epitoper i nærhet ved MAM grensesnitt, b) Tilsetning av et par av nærhetsligerings proberrettet mot mus og kanin IgG. Disse probene har festet DNA-strengene som kan danne maler for ligering av koblings oligos. c) Den sirkulære DNA-tråd dannet etter ligering kan forsterkes og d) visualiseres ved mikroskopi som et fluorescerende punkt ved hjelp av Texas Rødt-merkete oligonukleotider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ligner in situ nærhet Ringsanalyse eksperimenter kan utføres med GRP75 / IP3R1 par av antistoffer, samt cyklofilin D (CypD) / IP3R1 antistoffer, med tanke på at CypD ble vist å samhandle med IP3R / GRP75 / VDAC komplekse på MAM-grensesnitt 12-14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Utarbeidelse av Solutions

  1. Fremstille 10% formaldehyd i PBS (lav-salt) ved å fortynne 5,5 ml 37% formaldehyd i 14,5 ml PBS. Fremstille en M glycin, pH 8,0, ved oppløsning av 3,8 g glycin i 50 ml PBS; fortynne denne løsningen for å oppnå 100 mM glycin i 1 x PBS.
  2. Forbered 0,1% Triton-X100 i 1x PBS. Forbered 20x Saline natriumcitrat (SSC) ved bruk av 3,0 M natriumklorid og 0,30 M trinatriumcitrat fremstilt i et avionisert vann buffer med pH 7,0 ved 25 ° C. Fortynn denne bufferen til 1x og 0.01x hjelp avionisert vann.

2. Fiksering av celler

MERK: Vi brukte HuH7 hepatokarsinom cellelinje i denne studien, men denne metoden kan anvendes på andre adherente cellekulturer.

  1. Plate HuH7-celler (dyrket i DMEM 1 g / l glukose, supplert med 10% føtalt kalveserum og 0,01% penicillin-streptomycin lager) på 150.000 celler per-belagte 35-mm glassbunn fatet. Ved arbeid på primærcellekulturer, bruker kollagen-belagt retter.
  2. Neste dag, fjerne dyrkingsmediet. Vask cellene med 1 ml PBS og aspirer. Fiksere cellene ved å tilsette 1 ml av formaldehyd 10% og inkuber i 10 min ved romtemperatur (RT) under omrøring.
  3. Stopp reaksjonen med 1 ml 1 M glycin og bland ved rotasjon. Fjern stoppreaksjonsløsningen og vask cellene ved tilsetning av 1 ml av 1 x PBS; agitere ved rotasjon og aspirer. Tilsett 1 ml 100 mM glycin til cellene og inkuber dem i 15 minutter ved RT under omrøring, og så aspirere.
    MERK: Protokollen kan bli stoppet her og følgende trinn kan utsettes til en annen dag. I så fall, tilsett 1 ml 100 mM glycin og holde ved 4 ° C, om nødvendig.

3. Permeabilization Celler

  1. Tilsett 1 ml 0,1% Triton-X100 i 1 x PBS, inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur under omrøring, og så aspirere. Dette inkubasjonstid kan økes opp til 15 - 20 min ved arbeid på primærcelle cultures (f.eks primær mus hepatocytes). Vask cellene ved tilsetning av 1 ml av 1 x PBS; aspirer.

4. Blokkering

  1. Legg 40 mL av blokkering løsning til hver prøve (leveres av kitet); dette volum kan økes for å dekke prøven. Inkuber retter til 30 minutter ved 37 ° C i et fuktighetskammer.
  2. Trykk på blokkering løsning av av rettene. Prøv å få like restmengder for hvert lysbilde, da dette vil påvirke reproduserbarhet. Ikke la prøvene tørke!

5. primære antistoffer

  1. Fortynn de primære antistoffer i 1x PBS og legger løsningen til rettene (VDAC1 mus antistoff: 1/100, IP3R1 kanin antistoff: 1/500). Alternativt kan GRP75 eller CypD antistoffer (både muse-antistoffer anvendes ved 1/500) brukes i stedet for VDAC1.
  2. Inkuber over natten i et fuktighetskammer ved 4 ° C. Vask lysbildene to ganger med Tris bufret saltvann med 0,01% Tween (TBS-T).
  1. Nærhets ligation analyse sonder er levert av settet. Velge prober i henhold til arten av primære antistoffer.
  2. Forbered to nærhets ligation analyse prober 1: 5 i antistoffdiluent. La blandingen stå i 20 minutter ved RT. Legg fortynnet nærhet ringsanalyse probe løsning. Inkuber retter i en forvarmet fuktighetskammeret i 1 time ved 37 ° C. Oppvasken to ganger med TBS-T.

7. hemorroider

  1. Bruk in situ deteksjonsreagensen Texas red kit.
  2. Fortynn 5x ligering lager (leveres av settet) 1: 5 i høy renhet vann og bland godt. Fortynne ligase i 1x ringsløsning (levert av settet) 01:40 og vortex. Vent med å legge til ligase til like før tillegg til prøvene.
  3. Legg denne løsningen til hver prøve (40 ul for 35 mm med glassbunn retter) og inkuber lysbildene i en forvarmet fuktighet chamber i 30 minutter ved 37 ° C. Vask lysbildene to ganger med TBS-T.

8. Amplification

MERK: Vær forsiktig, lysfølsomme reagenser.

  1. Fortynn 5x forsterkning lager (leveres av settet) 1: 5 i høy renhet vann. Fjern-polymerase fra fryseren ved hjelp av fryseblokken (-20 ° C). Fortynn polymerase (leveres av settet) 1:80 i 1x forsterkning løsning og virvle. Tilsett polymerase umiddelbart før bruk av blandingen.
  2. Legg denne løsningen til hver prøve (40 ul for 35 mm glassbunn retter). Inkuber glir i en forvarmet fuktighetskammer etter 100 minutter ved 37 ° C. Trykk på Amplification-Polymerase løsning ut av lysbildene.

9. Endelig Vaske

  1. Vask objektglassene i 1x SSC vaskebuffer i 2 min. Vask lysbildene i 0.01x SSC vaskebuffer for 2 min. La retter tørke ved romtemperatur i mørket.

10. Forberedelse til Imaging

Monter skinnene ved hjelp av et minimalt volum på montering medium som inneholder DAPI (vandig og ikke stivner), slik at ingen luftbobler blir fanget under dekkglass. Neglelakk kan brukes til å forsegle kantene. Vent i ca. 15 minutter før analyse ved anvendelse av en fluorescens eller konfokal mikroskop (eksitasjon: 594 nm, emisjon: 624 nm, forstørrelse: 63X).
  • Etter bildebehandling, lagre lysbilder ved -20 ° C i mørket.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Basert på vår erfaring med denne protokollen, kan vi trygt anbefale denne metoden for visualisering og kvantifisering av ER-mitokondrier interaksjoner i faste celler. Representative bilder av in situ nærhet Ringsanalyse-visualisert ER-mitokondrier interaksjoner i HuH7 hepatokarsinom cellelinje, ved hjelp av flere par av antistoffer, blir vist. Som vist i figur 2 av fluorescerende mikroskopi, representerer hver rød prikk en interaksjon mellom de to målrettede proteiner, og kjerner opptrer i blått. Som en negativ kontroll, bruk av bare ett primært antistoff førte til ingen signal (figur 2, felt A), å validere den doble anerkjennelse kravet til in situ nærhet ringsanalyse signalgenerering. Klassisk, analyserer vi ER-mitokondrier samhandling ved hjelp av VDAC1 / IP3R1 par av antistoffer (figur 2, panel b). Ligner in situ nærhet ligeringsanalyse experiments kan også utføres med GRP75 / IP3R1 eller CypD / IP3R1 par av antistoffer (figur 2, paneler c og d, henholdsvis), siden GRP75 er en anstand kopling VDAC og IP3R på MAM-grensesnittet 11 og CypD ble demonstrert til å samhandle med den VDAC / GRP75 / IP3R Ca 2+ -channeling kompleks 12-14. Kvantifisering av fluorescerende prikker kan utføres ved hjelp av enten Blob-finder 15 eller ImageJ programvare. Som kjerner av celler er merket med blått, kvantifisering av ER-mitochondria interaksjoner per celle er egnet til å utføre. Vi grundig validert denne analysen 12, og vi kan konkludere med at disse målrettet proteiner er gode kandidater til å studere ER-mitokondrier interaksjoner.

    Figur 2
    Figur 2: Visualisering av VDAC1 / IP3R1, GRP75 / IP3R1 og CypD / IP3R1 Interaksjoner med In Situ Proximity Ligation analysen i HuH7 Cells. Cellekjerner vises i blått, og interaksjoner mellom de to målrettede proteiner er avbildet i rødt (63X forstørrelse; skala bar = 20 mikrometer). Vi viser at VDAC1, GRP75, og CypD samhandle med IP3R1. Som en negativ kontroll, viser vi at bare en primær antistoff ikke fører til rød fluorescens. For å validere analysen, har flere andre kontroller er utført for å demonstrere at VDAC1, GRP75, og CypD ikke samhandler med andre ER proteiner og at IP3R1 ikke interagerer med andre mitokondrielle proteiner (data ikke vist, se ref. 9 og 13). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Vi takker alle menneskene i vårt laboratorium som har bidratt til å optimalisere og validere protokollen. Dette arbeidet ble støttet av INSERM og nasjonale forskningsbyrået (ANR-09-JCJC-0116 OG ANR-11-BSV1-033-02). ET ble støttet i løpet av sin doktorgrad ved en stipendiatstilling fra det franske departementet for høyere utdanning og forskning.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Formaldehyde Sigma F-8775
    Glycine Sigma G-8898
    Triton Sigma T8532
    35 mm Glass bottom culture dishes MatTeK corporation P35G-0-14-C
    Blocking solution Sigma DUO-92004 or DUO-92002 provided in the Duolink PLA probes, Sigma
    VDAC1 antibody Abcam ab14734
    IP3R1-H80 antibody Santa Cruz sc28614
    CypD antibody Abcam ab110324
    Grp75 antibody Santa Cruz sc13967
    TBS 10x euromedex ET220 Dilute to obtain 1x
    Tween 100x euromedex 2001-B dilute in TBS to obtain 0,01%
    PLA Probes Mouse MINUS Sigma DUO-92004 Duolink, Sigma
    PLA Probes Rabbit PLUS Sigma DUO-92002 Duolink, Sigma
    Duolink detection reagents red Sigma DUO-92008 Duolink, Sigma
    Ligation solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Ligase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Amplification solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Polymerase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Duolink Mounting Medium Sigma DUO80102 Duolink, Sigma
    Softwares
    Blob-finder software BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
    ImageJ software Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
    2. Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
    3. Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
    4. Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169 (2012).
    5. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
    6. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
    7. Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
    8. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
    9. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
    10. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
    11. Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
    12. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
    13. Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
    14. Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
    15. Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
    16. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. (2016).
    17. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
    18. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
    19. De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
    20. Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).
    Studier av endoplasmatiske retikulum og mitokondrier Interaksjoner med<em&gt; In Situ</em&gt; Nærhet hemorroider analysen i fikserte celler
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Tubbs, E., Rieusset, J. Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells. J. Vis. Exp. (118), e54899, doi:10.3791/54899 (2016).More

    Tubbs, E., Rieusset, J. Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells. J. Vis. Exp. (118), e54899, doi:10.3791/54899 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter