Summary

Studier av endoplasmatiske retikulum og mitokondrier Interaksjoner med<em> In Situ</em> Nærhet hemorroider analysen i fikserte celler

Published: December 10, 2016
doi:

Summary

Her beskriver vi en prosedyre for å visualisere og kvantifisere med høy følsomhet endogene samspillet mellom det endoplasmatiske retikulum og mitokondrier i faste celler. Protokollen har en optimalisert in situ nærhet ligation analysen rettet mot inositol 1,4,5-trifosfat reseptor / glukose-regulert protein 75 / spenningsavhengig anion kanal / cyklofilin D komplekse på mitokondriene assosierte membran grensesnitt.

Abstract

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introduction

Mitokondrier og endoplasmatisk retikulum (ER) er ikke uavhengige organeller i cellen, men de interagerer strukturelt og funksjonelt at kontaktsider er definert som mitokondrier-assosiert endoplasmatiske retikulum membraner (MAM). Faktisk, MAMS tilsvarer regioner hvor membranene ifølge ER og mitokondrier er tett av motstå, slik at interaksjonene mellom proteiner fra begge sider. Likevel, gjør membraner av disse organeller ikke smelter innenfor disse områdene, slik at de opprettholder sine separate enheter. De Mams spiller en avgjørende rolle i kalsium (Ca 2+) og fosfolipid overføring fra ER til mitokondriene, påvirker energiomsetningen og celle overlevelse 1-3.

Sammenhengen mellom ER og mitokondriene ble først visualisert i 1970 med elektronmikroskopi. Siden da transmisjonselektronmikroskopi 4,5, elektron tomografi 6,7 eller immuno-lokalisering av ER og mitokondrier-spesifikke fluoroforens / fluorescerende proteiner 8 ble klassisk brukt til å studere ER-mitokondrier interaksjoner. En annen nyttig verktøy for analyse av MAM er basert på bruk av subcellulære fraksjonering. Det tillater isolering av MAM-fraksjoner ved differensial-ultrasentrifugering koblet til en Percoll-gradient 9. Imidlertid inneholder det endelige produktet anrikede MAM fraksjoner, snarere enn rene fraksjoner. Til sammen er disse strategiene er ikke spesielt følsomme og / eller kvantitativ, og de er ikke lett mottagelig for stor screening. Alternativt har genetiske metoder ved hjelp av narkotika induserbar fluorescerende inter-organelle linkere dukket opp, men de tillater ikke analysen av organelle interaksjoner på endogene uttrykk nivåer av proteiner 10.

Basert på Szabadkai oppdagelse av IP3R / GRP75 / VDAC kompleks på MAM 11, har vi utviklet en kvantitativ metode for å analysere ER-mitokondrier interaksjoner. Vi brukte in situ nærhet ligatipå analyse for å påvise og kvantifisere interaksjoner mellom VDAC1 og IP3R1, to organelle-overflateproteiner involvert i Ca 2+ -channeling komplekse på MAM-grensesnittet i faste celler 12. I korthet, probet vi VDAC1 ved den ytre mitokondriemembranen (mus anti-VDAC1 primære antistoff) og IP3R1 ved ER-membranen (kanin-anti-IP3R1 primære antistoff) (figur 1, felt A). Deretter, i henhold til analysen, tilsatte vi både anti-mus og anti-kanin-IgG (mus og kanin nærhet ligering assay-prober), som er konjugert til komplementære oligonukleotid utvidelser. Hvis de to målrettede proteiner er i en avstand under 40 nm, kan oligonukleotidene hybridisere med de etterfølgende ekstra koblings oligoer for å tillate dannelsen av et sirkulært DNA-templat (figur 1, felt B). Dette sirkulært DNA-molekyl blir ligert og forsterkes, noe som skaper et enkelt-trådet DNA-produkt kovalent bundet til en av nærhets prober (figur 1, felt C) </strong>. Da avstanden mellom ER og mitokondrier på MAM-grensesnittet i området fra 10 nm til 25 nm 6, kan nærhet ligering og forsterkning gjøres, noe som fører til etterfølgende påvisning på grunn av hybridisering av Texas Rødt-merkete oligonukleotider sonder (figur 1, panel d ). Hver fluorescerende prikk representerer interaksjoner mellom VDAC1 / IP3R1, og dermed gir kvantifisering av in situ ER-mitokondrier interaksjoner i enkeltceller.

Figur 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av Gjenkjenning av det endoplasmatiske retikulum-mitokondrier Interaksjoner med In Situ Proximity hemorroider analysen. a) En mus primært antistoff rettet mot VDAC1 og et kanin primært antistoff rettet mot IP3R1 kan binde seg til sine epitoper i nærhet ved MAM grensesnitt, b) Tilsetning av et par av nærhetsligerings proberrettet mot mus og kanin IgG. Disse probene har festet DNA-strengene som kan danne maler for ligering av koblings oligos. c) Den sirkulære DNA-tråd dannet etter ligering kan forsterkes og d) visualiseres ved mikroskopi som et fluorescerende punkt ved hjelp av Texas Rødt-merkete oligonukleotider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ligner in situ nærhet Ringsanalyse eksperimenter kan utføres med GRP75 / IP3R1 par av antistoffer, samt cyklofilin D (CypD) / IP3R1 antistoffer, med tanke på at CypD ble vist å samhandle med IP3R / GRP75 / VDAC komplekse på MAM-grensesnitt 12-14.

Protocol

1. Utarbeidelse av Solutions Fremstille 10% formaldehyd i PBS (lav-salt) ved å fortynne 5,5 ml 37% formaldehyd i 14,5 ml PBS. Fremstille en M glycin, pH 8,0, ved oppløsning av 3,8 g glycin i 50 ml PBS; fortynne denne løsningen for å oppnå 100 mM glycin i 1 x PBS. Forbered 0,1% Triton-X100 i 1x PBS. Forbered 20x Saline natriumcitrat (SSC) ved bruk av 3,0 M natriumklorid og 0,30 M trinatriumcitrat fremstilt i et avionisert vann buffer med pH 7,0 ved 25 ° C. Fortynn denne bufferen til 1x og 0.01x…

Representative Results

Basert på vår erfaring med denne protokollen, kan vi trygt anbefale denne metoden for visualisering og kvantifisering av ER-mitokondrier interaksjoner i faste celler. Representative bilder av in situ nærhet Ringsanalyse-visualisert ER-mitokondrier interaksjoner i HuH7 hepatokarsinom cellelinje, ved hjelp av flere par av antistoffer, blir vist. Som vist i figur 2 av fluorescerende mikroskopi, representerer hver rød prikk en interaksjon mellom de to målretted…

Discussion

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker alle menneskene i vårt laboratorium som har bidratt til å optimalisere og validere protokollen. Dette arbeidet ble støttet av INSERM og nasjonale forskningsbyrået (ANR-09-JCJC-0116 OG ANR-11-BSV1-033-02). ET ble støttet i løpet av sin doktorgrad ved en stipendiatstilling fra det franske departementet for høyere utdanning og forskning.

Materials

Formaldehyde Sigma F-8775
Glycine Sigma G-8898
Triton Sigma T8532
35mm Glass bottom culture dishes MatTeK corporation P35G-0-14-C
Blocking solution Sigma DUO-92004 or DUO-92002 provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody Abcam ab14734
IP3R1-H80 antibody Santa Cruz sc28614
CypD antibody Abcam ab110324
Grp75 antibody Santa Cruz sc13967
TBS 10X euromedex ET220 Dilute to obtain 1X
Tween 100X euromedex 2001-B dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS Sigma DUO-92004 Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS Sigma DUO-92002 Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red Sigma DUO-92008 Duolink, Sigma
Ligation solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium Sigma DUO80102 Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and  Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

References

  1. Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
  2. Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
  3. Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
  4. Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169 (2012).
  5. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
  6. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
  7. Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
  8. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
  9. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
  10. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
  11. Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
  12. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
  13. Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
  14. Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
  15. Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
  16. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
  17. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
  18. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
  19. De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
  20. Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).

Play Video

Cite This Article
Tubbs, E., Rieusset, J. Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells. J. Vis. Exp. (118), e54899, doi:10.3791/54899 (2016).

View Video