Studier av endoplasmatiske retikulum og mitokondrier Interaksjoner med<em> In Situ</em> Nærhet hemorroider analysen i fikserte celler

Summary

Her beskriver vi en prosedyre for å visualisere og kvantifisere med høy følsomhet endogene samspillet mellom det endoplasmatiske retikulum og mitokondrier i faste celler. Protokollen har en optimalisert in situ nærhet ligation analysen rettet mot inositol 1,4,5-trifosfat reseptor / glukose-regulert protein 75 / spenningsavhengig anion kanal / cyklofilin D komplekse på mitokondriene assosierte membran grensesnitt.

Abstract

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introduction

Mitokondrier og endoplasmatisk retikulum (ER) er ikke uavhengige organeller i cellen, men de interagerer strukturelt og funksjonelt at kontaktsider er definert som mitokondrier-assosiert endoplasmatiske retikulum membraner (MAM). Faktisk, MAMS tilsvarer regioner hvor membranene ifølge ER og mitokondrier er tett av motstå, slik at interaksjonene mellom proteiner fra begge sider. Likevel, gjør membraner av disse organeller ikke smelter innenfor disse områdene, slik at de opprettholder sine separate enheter. De Mams spiller en avgjørende rolle i kalsium (Ca ²⁺⁾ og fosfolipid overføring fra ER til mitokondriene, påvirker energiomsetningen og celle overlevelse ^1-3.

Sammenhengen mellom ER og mitokondriene ble først visualisert i 1970 med elektronmikroskopi. Siden da transmisjonselektronmikroskopi ^4,5, elektron tomografi ^6,7 eller immuno-lokalisering av ER og mitokondrier-spesifikke fluoroforens / fluorescerende proteiner ⁸ ble klassisk brukt til å studere ER-mitokondrier interaksjoner. En annen nyttig verktøy for analyse av MAM er basert på bruk av subcellulære fraksjonering. Det tillater isolering av MAM-fraksjoner ved differensial-ultrasentrifugering koblet til en Percoll-gradient ^9. Imidlertid inneholder det endelige produktet anrikede MAM fraksjoner, snarere enn rene fraksjoner. Til sammen er disse strategiene er ikke spesielt følsomme og / eller kvantitativ, og de er ikke lett mottagelig for stor screening. Alternativt har genetiske metoder ved hjelp av narkotika induserbar fluorescerende inter-organelle linkere dukket opp, men de tillater ikke analysen av organelle interaksjoner på endogene uttrykk nivåer av proteiner ^10.

Basert på Szabadkai oppdagelse av IP3R / GRP75 / VDAC kompleks på MAM ^11, har vi utviklet en kvantitativ metode for å analysere ER-mitokondrier interaksjoner. Vi brukte in situ nærhet ligatipå analyse for å påvise og kvantifisere interaksjoner mellom VDAC1 og IP3R1, to organelle-overflateproteiner involvert i Ca ²⁺ -channeling komplekse på MAM-grensesnittet i faste celler ^12. I korthet, probet vi VDAC1 ved den ytre mitokondriemembranen (mus anti-VDAC1 primære antistoff) og IP3R1 ved ER-membranen (kanin-anti-IP3R1 primære antistoff) (figur 1, felt A). Deretter, i henhold til analysen, tilsatte vi både anti-mus og anti-kanin-IgG (mus og kanin nærhet ligering assay-prober), som er konjugert til komplementære oligonukleotid utvidelser. Hvis de to målrettede proteiner er i en avstand under 40 nm, kan oligonukleotidene hybridisere med de etterfølgende ekstra koblings oligoer for å tillate dannelsen av et sirkulært DNA-templat (figur 1, felt B). Dette sirkulært DNA-molekyl blir ligert og forsterkes, noe som skaper et enkelt-trådet DNA-produkt kovalent bundet til en av nærhets prober (figur 1, felt C) </strong>. Da avstanden mellom ER og mitokondrier på MAM-grensesnittet i området fra 10 nm til 25 nm ^6, kan nærhet ligering og forsterkning gjøres, noe som fører til etterfølgende påvisning på grunn av hybridisering av Texas Rødt-merkete oligonukleotider sonder (figur 1, panel d ). Hver fluorescerende prikk representerer interaksjoner mellom VDAC1 / IP3R1, og dermed gir kvantifisering av in situ ER-mitokondrier interaksjoner i enkeltceller.

Figur 1: Skjematisk illustrasjon av Gjenkjenning av det endoplasmatiske retikulum-mitokondrier Interaksjoner med In Situ Proximity hemorroider analysen. a) En mus primært antistoff rettet mot VDAC1 og et kanin primært antistoff rettet mot IP3R1 kan binde seg til sine epitoper i nærhet ved MAM grensesnitt, b) Tilsetning av et par av nærhetsligerings proberrettet mot mus og kanin IgG. Disse probene har festet DNA-strengene som kan danne maler for ligering av koblings oligos. c) Den sirkulære DNA-tråd dannet etter ligering kan forsterkes og d) visualiseres ved mikroskopi som et fluorescerende punkt ved hjelp av Texas Rødt-merkete oligonukleotider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ligner in situ nærhet Ringsanalyse eksperimenter kan utføres med GRP75 / IP3R1 par av antistoffer, samt cyklofilin D (CypD) / IP3R1 antistoffer, med tanke på at CypD ble vist å samhandle med IP3R / GRP75 / VDAC komplekse på MAM-grensesnitt ^12-14.

Protocol

1. Utarbeidelse av Solutions Fremstille 10% formaldehyd i PBS (lav-salt) ved å fortynne 5,5 ml 37% formaldehyd i 14,5 ml PBS. Fremstille en M glycin, pH 8,0, ved oppløsning av 3,8 g glycin i 50 ml PBS; fortynne denne løsningen for å oppnå 100 mM glycin i 1 x PBS. Forbered 0,1% Triton-X100 i 1x PBS. Forbered 20x Saline natriumcitrat (SSC) ved bruk av 3,0 M natriumklorid og 0,30 M trinatriumcitrat fremstilt i et avionisert vann buffer med pH 7,0 ved 25 ° C. Fortynn denne bufferen til 1x og 0.01x…

Representative Results

Basert på vår erfaring med denne protokollen, kan vi trygt anbefale denne metoden for visualisering og kvantifisering av ER-mitokondrier interaksjoner i faste celler. Representative bilder av in situ nærhet Ringsanalyse-visualisert ER-mitokondrier interaksjoner i HuH7 hepatokarsinom cellelinje, ved hjelp av flere par av antistoffer, blir vist. Som vist i figur 2 av fluorescerende mikroskopi, representerer hver rød prikk en interaksjon mellom de to målretted…

Discussion

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b…

Materials

Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10X	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1X
Tween 100X	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and  Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html