Summary

Histologisk Kvantificering af kronisk hjerteinfarkt i rotter

Published: December 11, 2016
doi:

Summary

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

Abstract

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

Introduction

Myokardieinfarkt (MI) er en førende årsag til død og invaliditet i hele verden. Koronar hjertesygdom er den vigtigste årsag; MI skyldes iskæmi i træk til koronare hændelser såsom okklusion. Når reperfusion ikke udføres inden for de første 6 timer, iskæmi inducerer irreversibel myokardienekrose. Hos patienter, karakterisering af MI er afhængig af forskellige diagnostiske værktøjer, herunder kliniske tegn, elektrokardiografi, vurdering af plasmaniveauer af biomarkører, ekkokardiografi, MRI scanning, og histologiske analyser 1. Akut og kronisk MI er klassificeret som to forskellige faser af skade efter timingen af ​​myocardienekrose forhold til tidspunktet for koronar okklusion. Den akutte fase, der opstår under de første 7 dage, er forbundet med tab af cardiomyocytter, omfattende inflammation, og rekrutteringen af ​​fibroblaster. Sub-akutte fase, kendetegnet ved heling af hjertevævet og dannelsen af ​​et ar, opstårmellem 1 og 4 – 6 uger. Udvidelse af infarkt, ventrikel væg udtynding, og ventrikel dilatation karakterisere den kroniske fase. Omfattende ombygning af venstre ventrikel gradvist resulterer i alvorlig hjerteinsufficiens 2.

MI induceret af permanent venstre forreste nedadgående arterie (LAD) ligering repræsenterer standard gnaver model af kronisk myocardial infarkt. De koronar ligatur efterligner koronar okklusion. Størrelsen af ​​infarkt afhænger på stedet af ligaturen. Karakterisering af myocardial iskæmisk læsion i en gnaver-model er klassisk udført under anvendelse biomarkør plasmaniveauer, såsom troponin I og T 3, ekkokardiografi, MRI, og histologi 4,5. Biomarkør niveauer er korreleret med omfanget af cardiomyocyte død. Ekkokardiografi vurderer venstre ventrikel nyrefunktion som følge af regionale væg bevægelse abnormiteter. Desuden ikke-invasive billeddannelsesteknikker, såsom MRI eller høj opløsningekkokardiografi, at omfatte vurdering af reduktionen i væggen bevægelse, mængden af ​​arret med reduceret perfusion og levedygtig myocardium, og væggen udtynding. LV dimensioner tillader det nøjagtig evaluering af infarktstørrelse. Endelig kan kvantificering af levedygtige og døde myocardium udføres postmortem hjælp specifikke pletter af histologiske snit af høstede hjerter og tillader kontrol af infarktstørrelse (IS). Et andet vigtigt element er evalueringen af infarktet ekspansion indeks (El) 6. EI er forbundet med transmural infarkt og starter inden for de første 3 dage. EI er kendetegnet ved en gradvis reduktion i vægtykkelse, en stigning i LV hulrum størrelse og deraf følgende ændringer i LV form.

For at vurdere den terapeutiske effekt af nye behandlinger – især de regenerative strategier baseret på celler, matricer, og gen-levering-præcis vurdering af MI hos gnavere er af afgørende betydning.Når den måles på en enkelt tværsnit opnås ved papillærmusklen niveau, kan IS størrelse være forspændt på grund af den store variation, der eksisterer i infarkt udvikling efter LAD ligering; toppunktet infarkt kan derefter tildækkes. Vigtigere, har mere præcise metoder til bestemt MI størrelse blevet beskrevet for mus 7-9 eller rotter 10. Ikke desto mindre, IS er utilstrækkelig til præcist at kvantificere LV ombygninger eller terapeutisk inducerede reduktioner (eller preventions) af ombygningen. Faktisk er almindeligvis udtrykt som en procentdel af den samlede LV volumen vurderet på tværsnit af hjertet. Selv om denne metode er gyldig for akut MI, udtynding af LV væg forekommer under remodeling forbliver under overvejelse 11,12. En komplet morfometrisk kvantificering af infarktstørrelse og strukturelle ændringer bør kvantificere flere parametre, såsom endokardiale og epikardiale længder og diametre, samt infarkt og raske områder. Vi beskriver en metodisk ca.oach præcist at vurdere MI og ombygning i en kronisk rottemodel.

Protocol

Alle dyr modtog human måde i overensstemmelse med den europæiske konvention om Animal Care. Kirurgiske procedurer blev udført i overensstemmelse med den schweiziske Dyrenes Beskyttelse lov efter at have indhentet tilladelse fra staten Veterinærkontoret, Fribourg, der er godkendt af den schweiziske forbundsdomstol Veterinærkontoret, Schweiz. 1. Heart Høst BEMÆRK: Alle kirurgiske indgreb blev udført under isofluran anæstesi. blev gjort en indsats for at mind…

Representative Results

Seks uger efter LAD ligering blev hjerter høstet fra Lewis-rotter. 2 mm vævssnit blev opnået fra apex til basis. En TTC farvning procedure blev udført for at visualisere infarkt område, som vises i hvidt, og den sunde myocardium, som vises i rød (figur 2). Afhængigt af stedet for ligering af LAD, den infarktstørrelse varierer. For store MI blev transmurale infarkter observeret fra apex til basis (figur 2A). Mindre infarkter præsenteret hvid infa…

Discussion

Kritiske trin i protokollen

Fibrøst væv kan præcist vurderes i en kronisk MI rotte model med systematisk prøvetagning af den høstede hjerte og image analyser af trikromatiske-farvede histologiske snit opnået fra basen til spids. To skridt er særligt vigtige for en vellykket implementering af protokol. Først anvendelsen af ​​KCl til hjertet høsten opnår hjertemusklen, der skal holdes i en afslappet tilstand. Dette trin er vigtigt for sammenligning af infarkt dim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The study was supported by the Swiss National Foundation [SNF 310030-149986 to MNG], the University of Fribourg, and Fribourg Hospital.

Materials

Acrylic rat heart matrix 2mm 72-5015 Harvard Appartus
INSPIRA ADVANCED VOLUME CONTROLLED VENTILATOR HARVARD APPARATUS 557058
CATHETER INSYTE 14G BD 381267
O.C.T BDHA361603E VWR
TTC T8877-10G Sigma Aldrich
Mayer hematoxylin MHS32-1L Sigma Aldrich
Acid Fuchsin
CI 42685
F8129-50G Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin
CI 16150
P2395-25G Sigma Aldrich
Orange G
CI 16230
O3756-100G Sigma Aldrich
Light green
CI 42095
L5382-25G Sigma Aldrich
KCl P9333-500G Sigma Aldrich
Xylol 10315083 HoneyWell
Ethanol absolute 10303990 HoneyWell
2-methylbutane M32631-1L Sigma Aldrich
Stereogical microscope SM2800 Nikon
Formaldehyde 99340 Reactolab
Embedding cassette K113.1 Carl Roth
Bersoft Image measurement Software Bersoft.com Licensed software

References

  1. Amsterdam, E. A., et al. AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).
  2. Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment. JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).
  3. Frobert, A., et al. Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models. Front Physiol. 6, 353 (2015).
  4. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).
  5. Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).
  6. Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117, 1388-1396 (2008).
  7. Valente, M., et al. Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).
  8. Csonka, C., et al. Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).
  9. Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model. Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).
  10. Lichtenauer, M., et al. Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation. Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).
  11. Lutgens, E., et al. Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes. Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).
  12. Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix. J Vis Exp. , e51390 (2014).
  13. Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).
  14. Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101, 593-600 (1981).
  15. Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion. Circulation. 78, 186-201 (1988).
  16. Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat. J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).

Play Video

Cite This Article
Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats. J. Vis. Exp. (118), e54914, doi:10.3791/54914 (2016).

View Video