Histologisk Kvantifisering av kronisk hjerteinfarkt i rotter

Summary

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

Abstract

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

Introduction

Hjerteinfarkt (MI) er en ledende årsak til død og uførhet på verdensbasis. Koronar hjertesykdom er den viktigste årsaken; MI skyldes iskemi rad til koronare hendelser som okklusjon. Når reperfusjon ikke utføres innenfor de første 6 timer, induserer irreversibel ischemi myokardial nekrose. Hos pasienter, karakterisering av MI er avhengig av ulike diagnostiske verktøy, inkludert kliniske tegn, EKG, vurdering av plasmanivået av biomarkører, ekkokardiografi, MR imaging, og histologiske analyser ^ett. Akutt og kronisk MI klassifiseres som to forskjellige faser av skade i henhold til tidspunktet for myokardial nekrose i forhold til tidspunktet for koronar okklusjon. Den akutte fasen, forekommer i løpet av de første 7 dagene, er assosiert med tap av cardiomyocytes, omfattende betennelse, og rekruttering av fibroblaster. Den sub-akutte fase, karakterisert ved helbredelse av hjertevevet og dannelsen av et arr, oppstårmellom 1 og 4 – 6 uker. Utvidelse av infarkt, ventrikkel veggen tynning, og ventrikkel dilatasjon karakterisere kronisk fase. Omfattende ombygging av venstre hjertekammer gradvis fører til alvorlig hjertesvikt ^to.

MI fremkalt ved permanent venstre fremre nedstigende arterie (LAD) ligering representerer standard gnager-modell med kronisk hjerteinfarkt. Koronar ligaturinnstillingene ligner coronary okklusjon. Størrelsen på infarkt avhenger av området av ligaturen. Karakterisering av hjerteinfarkt iskemisk skade i en gnager modellen er klassisk utført ved hjelp av biomarkører plasmanivå, for eksempel troponin I og T ^3, ekkokardiografi, MR og histologi ^4,5. Biomarkør nivåer er korrelert med graden av kardiomyocytt død. Ekkokardiografi evaluerer venstre ventrikkel nyrefunksjon som følge av regionale veggbevegelse unormalt. I tillegg er ikke-invasive avbildningsteknikker, slik som MRI eller høyoppløseligekkokardiografi, tillate vurdering av reduksjonen i veggen bevegelse, vil volumet av arret område med redusert perfusjon og levedyktig hjertemuskelen, og veggen tynning. LV dimensjoner tillater presis evaluering av infarktstørrelsen. Endelig kan kvantifisering av levedyktige og døde hjertemuskelen bli utført post mortem ved hjelp av bestemte flekker av histologiske snitt av høstet hjerter og tillater verifisering av infarktstørrelse (IS). En annen viktig funksjon er evalueringen av infarkt utvidelse indeks (EI) ^6. EI er forbundet med transmuralt infarkt og starter i løpet av de første 3 dager. EI er karakterisert ved en progressiv reduksjon i veggtykkelse, en økning i hulrom størrelse LV, og påfølgende endringer i LV form.

For å bedømme den terapeutiske effekt av nye behandlinger – i særdeleshet, den regenerative strategier basert på celler, matriser, og genavlevering-nøyaktig vurdering av MI i gnagere er av største betydning.Når den måles på et enkelt tverrsnitt oppnådd ved den papillære muskelnivået, kan IS størrelse bli forspent på grunn av den store variasjon som finnes i infarkt utvikling følgende LAD ligering; apex infarkt kan være så occulted. Viktigere, har mer nøyaktige metoder til bestemmes MI størrelse blitt beskrevet for mus ^7-9 eller rotter ^10. Likevel er ikke tilstrekkelig for å nøyaktig kvantifisere LV ombygging eller terapeutisk induserte reduksjoner (eller preventions) av ombygging. Faktisk er det ofte uttrykt som en prosent av total LV volum vurderes tverrsnitt av hjertet. Selv om denne metoden er gyldig for akutt MI, forblir tynning av LV veggen som oppstår under ombygging under-evaluert ^11,12. En fullstendig morfometrisk kvantifisering av infarktstørrelse og strukturelle endringer bør kvantifisere flere parametere, slik som endokardiale og epikardiale lengder og diametre, samt av infarktet og friske områder. Vi beskriver en metodisk ca.oach å nøyaktig vurdere MI og ombygging i en kronisk rottemodell.

Protocol

Alle dyr fikk human behandling i samsvar med den europeiske konvensjonen om Animal Care. Kirurgiske prosedyrer ble utført i samsvar med den sveitsiske Dyrevernloven etter å ha innhentet tillatelse fra Statens veterinærkontoret, Fribourg, godkjent av den sveitsiske føderale veterinærkontoret, Sveits. 1. Hjerte Høsting MERK: Alle kirurgiske inngrep ble utført under isoflurananestesi. Arbeidet ble gjort for å redusere dyrs lidelser. Særlig alle dyr som mottok…

Representative Results

Seks uker etter LAD ligation, ble hjerter høstet fra Lewis rotter. 2 mm vevssnitt ble oppnådd fra toppen til bunnen. En TTC fargeprosedyre ble utført for å visualisere infarktområdet, som vises i hvitt, og den friske myokard, som vises i rødt (figur 2). Avhengig av området av ligering av LAD varierer infarktstørrelsen. For store MI, ble transmurale infarkter observert fra apex til bunnen (figur 2A). Mindre infarkter present hvit infarkt vev synli…

Discussion

Kritiske trinn i protokollen

Fibrotisk vev kan være nøyaktig vurderes i en kronisk MI rottemodell ved hjelp av systematisk prøvetaking av høstet hjerte og bildeanalyse av trichromatic-farget histologiske snitt hentet fra basen til apex. To trinn er spesielt viktig for en vellykket gjennomføring protokoll. Først, bruk av KCl for hjerte høsting tillater hjertemuskelen til å bli opprettholdt i en avslappet tilstand. Dette trinnet er viktig for sammenligninger av infarkt…

Materials

Acrylic rat heart matrix 2mm	72-5015	Harvard Appartus
INSPIRA ADVANCED VOLUME CONTROLLED VENTILATOR	HARVARD APPARATUS	557058
CATHETER INSYTE 14G	BD	381267
O.C.T	BDHA361603E	VWR
TTC	T8877-10G	Sigma Aldrich
Mayer hematoxylin	MHS32-1L	Sigma Aldrich
Acid Fuchsin CI 42685	F8129-50G	Sigma Aldrich
Ponceau Xylidin CI 16150	P2395-25G	Sigma Aldrich
Orange G CI 16230	O3756-100G	Sigma Aldrich
Light green CI 42095	L5382-25G	Sigma Aldrich
KCl	P9333-500G	Sigma Aldrich
Xylol	10315083	HoneyWell
Ethanol absolute	10303990	HoneyWell
2-methylbutane	M32631-1L	Sigma Aldrich
Stereogical microscope	SM2800	Nikon
Formaldehyde	99340	Reactolab
Embedding cassette	K113.1	Carl Roth
Bersoft Image measurement Software		Bersoft.com	Licensed software