Summary
Denne protokol beskriver driften af et flow prøveholder væske til scanning transmissionselektronmikroskopi af AuNPs i vand, som anvendes til observation af nanoskala dynamiske processer.
Abstract
Prøver fuldt indlejret i flydende kan studeres på nanoskala rumlig opløsning med Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) med en mikrofluid kammer samlet i prøven holder til Transmission Electron Microscopy (TEM) og STEM. Den mikrofluidsystem består af to silicium mikrochips understøtter tynde siliciumnitrid (SiN) membran vinduer. Denne artikel beskriver de grundlæggende trin i prøven lastning og dataopsamling. Vigtigst af alt er at sikre, at væskekammeret er korrekt samlet, hvilket således tilvejebringer et tyndt væskelag og et vakuum forsegling. Denne protokol indeholder også en række tests er nødvendige for at udføre under prøve lastning med henblik på at sikre korrekt montering. Når prøven er lagt i elektronmikroskop, skal måles væsken tykkelse. Ukorrekt montering kan resultere i en alt for tyk væske, mens en for tynd væske kan indikere fravær af væske, såsom når en boble dannes. Endelig protokollenforklarer, hvordan billederne er taget, og hvordan dynamiske processer kan studeres. En prøve indeholdende AuNPs afbildes både i rent vand og i saltvand.
Introduction
Konventionel Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) er begrænset af intervallet af enheder egnede til analyse, specielt de tørre og faste prøver velegnet til placering i et højt vakuum. Men mange videnskabelige og teknologiske spørgsmål vedrører nanoskala materialer og processer i flydende miljø. Prøver fuldt indlejret i flydende kan nu studeres med STEM ved hjælp af et koncept, der indebærer en mikrofluid kammer samlet i prøven holder til Transmission Electron Microscopy (TEM) og STEM 1. Denne nyudviklede teknik er blevet mere og mere populært, da det giver ny indsigt i vigtige processer i forskellige forskningsemner, herunder vækst, opløsning, og aggregeringsprocesser af nanopartikler 2, 3, 4, 5, 6. Ikke kun metaller, men også biominerals 7 og biologiske systemer kan studeres 8, 9, 10, 11. Prøven lastning og erhvervelse billede til væske-fase STEM er anderledes end for STEM af tørre prøver og involverer en protokol, der kræver dedikeret træning.
Den mikrofluidsystem består af to silicium mikrochips understøtter siliciumnitrid (SiN) membran vinduer gennemsigtige for elektronstrålen ved 200 keV energi 12 (se figur 1A). Nærmere oplysninger om dimensionerne og håndteringen af disse mikrochips kan findes andre steder 12, 13. Prøven indeholder normalt nanoskala objekter. I dette papir observerede vi guld nanopartikler (AuNPs). De AuNPs immobiliseres øverst vindue (med hensyn til en nedadgående-rejser elektronstråler) eller flyder på liquid. Nanoskala rumlig opløsning i STEM opnås ved scanning elektronstrålen over AuNPs og opsamling transmitterede spredte elektroner ved hjælp den ringformede Mørk Field (ADF) detektor 9. De to mikrochips anbringes i en lille spalte i spidsen af væskestrømningen TEM holder 1 (landbrugeren fungerer tilfredsstillende i både STEM og TEM men omtales som indehaveren af TEM). En af mikrochips indeholder en spacer, således at en flydende rum er dannet mellem mikrochips. O-ringe på begge sider af de to mikrochips giver vakuum forsegling af væskekammeret 13 (se figur 1 B).
Formålet med denne artikel er at vise de grundlæggende trin i prøven lastning og dataopsamling, så interesserede brugere kan finde let adgang til denne nye nye teknik. Et system til rådighed fra en bestemt virksomhed er brugt, men protokollen er også gældende for systemer af andre virksomheder. Teknikken ermere kompleks end konventionelle TEM og STEM, og en række praktiske aspekter skal overvejes, når der arbejdes med en væske holder systemet 13. Vigtigst af alt er at sikre, at væskekammeret er korrekt samlet, hvilket således tilvejebringer et tyndt væskelag og et vakuum forsegling. Derfor er det yderst vigtigt at arbejde rent og forhindre dannelsen af støv under fremstillingen og samling af strømningen TEM indehaveren væske. Især O-ringe og de to silicium mikrochips skal være fri for enhver urenhed. Selv små partikler af støv på en af mikrochips kan alvorligt øge tykkelsen af den samlede celle, som kan forhindre, at opnåelsen af en nyttig rumlig opløsning. Et vakuum forsegling er vigtigt, så ingen forurening eller skader vil blive efterladt i elektronmikroskop efter forsøget. Denne protokol beskriver lastning procedure og flere nødvendige tests. Driften af elektronmikroskop er ligetil, but det kræver nogle ekstra trin sammenlignet med mikroskopi af faste prøver. Med stigende flydende tykkelser, flere elektroner absorberes og spredes af væsken; en måling af den flydende tykkelse er afgørende. Endelig forklarer protokollen hvordan billeder taget, og hvordan dynamiske processer kan studeres.
Figur 1: Flydende flowcelle til scanning Transmission Electron Microscopy (STEM). (A) Skematisk illustration af den samlede flydende celle. To silicium mikrochips med siliciumnitrid (SiN) membran vinduer er anbragt mellem to O-ringe. Væsken er indesluttet mellem SiN membranen og er således adskilt fra vakuumet i elektronmikroskop. En fokuseret elektronstråle scanner over prøven. Kontrast er fremstillet af spredte elektroner. Guld nanopartikler (AuNPs) immobiliseres inden væsken ved SiN membranen, men kan også bevæge sig ivæske. (B) Skematisk sidebillede tværsnit af stablen af to mikrochips med O-ringe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Figur 2: Rengøring Sagsbehandling for Si Mikrochips. (A) To bægre er fyldt med 40-60 ml acetone og ethanol hver. (B) Si mikrochips anbringes i bægerglasset fyldt med acetone. Den side med SiN membranen skal vende opad. Refleksionen af de to Si mikrochips viser tydeligt rillen på bagsiden af to mikrochips. (C) Efter 2 min, er Si mikrochips overført til den anden bægerglas fyldt med ethanol. Efter endnu 2 min, er Si mikrochips overført til en renrum væv til tørring. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Væske Flow Transmission Electron Microscopy (TEM) Holder udstyr. (A) Væskestrømmen TEM holder med plastrør og en sprøjte til væskestrømning. (B) Spidsen af strømningen TEM holder væske fjernes fra holderen akslen, låget af den flydende cellekammer, O-ringe, og to silicium mikrochips. Slangen rager frem fra den venstre side af spidsen. (C) Den flydende cellekammer viser en O-ring, spalten til mikrochippen placering. (D) Forskellige pincetter på en støvfri overflade (aluminiumsfolie). (E) Låget af den flydende cellekammer med sine to O-ringe. (F) To silicium mikrochips med synd membran vinduer. Venstre: prøven mikrochip uden en spacer; højre: dækslet mikrochip med en 200 um spacer. (G) Mikrofluidapparat pumpesystem. Klik her for at se en større version af denne Figure.
1. Forberedelse af mikrochips
1. Rensning af mikrochips
- Forbered et arbejdsområde med et lavt støv niveau i en laminar luftstrøm hætte med en støv partikelfilter.
- Rense en lysmikroskopi objektglas med en fiberfri væv og ren ethanol til placering og transport af mikrochips. Placer objektglasset på en renrum væv i en petriskål.
BEMÆRK: Undgå at bruge teknisk ethanol på alle tidspunkter. - Vælg 5 base-mikrochips (uden en spacer) for prøve placering og 5 mikrochips med en 200 nm tyk spacer.
BEMÆRK: Vinduet dimensioner er 20 x 400 um 2 og SiN tykkelse er 50 nm. Da der er en vis tolerance på dimensionerne, anbefales det at kontrollere dimensionerne ved anvendelse af et lysmikroskop. - Brug kulstof-belagte pincet til at fjerne mikrochips fra opbevaringsboks og placere dem på objektglasset. Grab mikrochips fast, men forsigtigt på deres long sider. Håndter mikrochip, således at SiN membranen side altid vender opad.
BEMÆRK: Undgå at røre den skrøbelige SiN membran på oversiden. Også være forsigtig med håndtering af mikrochips til at undgå revner deres skarpe kanter, der kan forårsage problemer på grund af silicium-partikler, der er bosiddende på mikrochippen eller senere lækager.
BEMÆRK: Træning for proceduren for at fjerne mikrochips fra den klæbrige overflade kan udføres på (billig) dummy mikrochips. - Placer mikrochips på et renrum væv i en petriskål. Luk skålen og overføre den til stinkskabet.
BEMÆRK: Trinene involverer acetone udføres i et stinkskab til kemisk sikkerhed. - Tag to 120 ml glas bægre. Skyl et bæger med acetone og det andet med ethanol til at rense dem. Fyld den første med 40-60 ml acetone, og den anden med 40-60 ml ethanol.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge HPLC-grade væsker også til dette trin i protokollen. - Overførselde mikrochips i bægeret med acetone for at fjerne det beskyttende modstå lag. Bevæg bægeret med hånden for at effektivt at skylle mikrochips, men pas på ikke at vende mikrochips på hovedet - se figur 2.
- Efter 2 min, fjern mikrochips og hurtigt overføre dem i bægeret med ethanol. flytte forsigtigt bægerglasset i hånden med ethanol i 2 minutter for at fjerne eventuelle rester af resisten lag. Bægerglasset dækkes med alufolie, og overføre det til den laminare luftstrøm arbejdsbord.
BEMÆRK: Lad ikke de mikrochips tørre ud under overførslen for at undgå aflejring af snavs. - Fjern mikrochips fra bægeret og placere dem på en ny renrum væv. Lad dem tørre i et par minutter og overføre mikrochips på lysmikroskop objektglasset i petriskålen.
BEMÆRK: De våde mikrochips kan nemt flip rundt, vende på hovedet, eller holde sig til de pincet, når de slippes. Dette kan undgås ved pressynge mikrochips blidt på filtrerpapir og trække pincetten væk i vandret retning. - Luk petriskål og overføre mikrochips til plasmaet renere.
- Placer objektglas med mikrochips ind i plasma renere. Kør en 5 min rengøringsprogram at gøre overfladen af siliciumnitrid membran hydrofil og fjerne kulbrinter.
BEMÆRK: Egnede indstillinger ansøgt om vores plasma renere er: 70 mTorr, gas flow på 11,5 SCCM for O 2 og 35,0 SCCM for Ar, 50 W fremad Radio Frequency (RF) mål, 5 W RF rækkevidde, og max reflekterede RF. Ethvert plasma stand til at inducere en overfladeladning er egnet. - Sæt objektglasset med mikrochip tilbage i petriskålen, lukker låget, og overføre det til lysmikroskop.
- Undersøg mikrochips under et lysmikroskop for eventuelle membran brister eller resterende snavs partikler. Vær særlig forsigtig med de vinduesarealer og tjekke for små pletter angiver arupture af membranen. Afvis mikrochips med beskadigede membraner.
- Luk petriskål og gemme det i laminare luftstrøm arbejdsbord.
2. Forberedelse af prøven på mikrochips
- Forbered en vandig AUNP opløsning (citrat stabiliseret) ved at blande små mængder af de stamopløsninger indeholdende 30 nm-diameter, citrat-stabiliserede AuNPs ved en koncentration på ~ 3 M.
- Placer mikrochips på en ren, klæbrig overflade i en transportkasse til dråbe ansøgning / prøve deposition.
- Placer en dråbe (1-2 pi) af prøveopløsningen på SiN membran side af frisk plasma-renset mikrochip (brug en mikrochip uden en spacer), og lad den løsning, tørre i laminar luftstrøm arbejdsbord.
BEMÆRK: Denne procedure kan gentages for at forøge koncentrationen af AuNPs på SiN membranen. - Påfør 1 pi deioniseret vand til mikrochippen til fjernelse af salt og / eller overfladeaktive midler. Efter 30 s, omhyggeligtfjerne dråben af vand med filtrerpapir. Lad mikrochips tørre i luft i den laminare luftstrøm arbejdsbord.
BEMÆRK: Et tilstrækkeligt stort antal AuNPs vil have klæbet til mikrochip og vil ikke blive skyllet væk i vand længere. - Brug den forberedte prøve mikrochips indenfor 4 timer, da SiN mister sine hydrofile ydede overfladeegenskaber over tid, hvilket kan få væsken til at opføre sig anderledes under et eksperiment. Bemærk: Se afsnittet diskussion for flere detaljer.
- Brug en lukket transportkasse til opbevaring og overførsel af mikrochips.
2. Forberedelse af Liquid Flow TEM Holder
- Rengøring TEM indehaveren væskestrømmen
- Rengør alle værktøjer (pincet og en skruetrækker), der vil være i kontakt med vakuum dele ved hjælp af acetone og ethanol i et ultralydsbad og placere dem på støvfri overflade tilvejebragt af et stykke nyt aluminiumsfolie placeret på arbejdsbordet. Arbejde med handskerat undgå forurening af strømningen TEM indehaveren væske.
BEMÆRK: værktøjer behøver ikke at være udstrakt rengøres, hvis man er sikker på, at de er rene til arbejde med vakuum dele. Handsker kan undgås, hvis man er i stand til at håndtere udstyr uden at røre vakuum dele. - Placer flow TEM indehaveren flydende under kikkerten lysmikroskop på en sådan måde, at spidsen af holderen indeholder væsken kammer kan observeres. Se figur 3.
- Fjern låget af holderen spids og placere den på støvfri overflade.
BEMÆRK: titanium Låget er følsom over for ridser forårsaget af hårdere materialer som pincet. Det anbefales at bruge polymerovertrukne pincet til følsomme materialer. - Fremstilles mindst 1-2 ml rent vand (HPLC-kvalitet).
BEMÆRK: Hvis man ikke bruger flydende HPLC-kvalitet, anbefales det at kontrollere, at de væsker, som anvendes ikke indeholder mikro partikler, der muligvis kan føre til tilstopninger af flow-systemet; FILTis væsken efter behov med en mikro-pore filter. - Anvend en glassprøjte (1 ml) for at skylle hele strømmen systemet med 0,5 ml rent vand. Det anbefales at bruge en mikrofluid sprøjtepumpe system. Brug en pipette og / eller filterpapir for at fjerne væsken udstødes i den flydende cellekammer. Test alle rør til flydende flow. Tør holderen spids bagefter ved hjælp filtrerpapir og / eller en pipette.
- Brug lyset mikroskop for at kontrollere, at spidsen af holderen er ren og tør. Hvis det er nødvendigt, vaske spidsen af holderen med vand eller ethanol for at fjerne eventuelle faste rester, der kunne have været efterladt af den tørrede løsning. Fjern stykker af støv eller rester af fibre samt. Fjern forsigtigt disse stykker med en pincet og derved undgå at ridse titanium overflade. Kontroller også inde i O-ring riller og fjern resterne af væske med et lille stykke renrum væv.
BEMÆRK: Hvis indehaveren ikke bliver rent med denne procedure, så det anbefalesat fjerne spidsen fra holderen og rense det i acetone i 2 minutter og i ethanol i yderligere 2 min ved anvendelse af et ultrasonisk bad. - Undersøg alle andre dele af spidsen (O-ringe, låg og skruer) under lysmikroskop og fjerne støv, fibre, osv ...
BEMÆRK: lejlighedsvis, skal små stykker, der hidrører fra skruer eller Si mikrochips også fjernes. Hvis det er nødvendigt, kortvarigt rense vakuum dele med HPLC-kvalitet ethanol. Låget og skruer kan rengøres med ultralyd, som forklaret for tippet. Undgå at placere O-ringene ofte i ethanol, da det kan gøre O-ringene skørt over tid, formindske deres vakuum tæthed. Systemet drives uden vakuum fedt, men hvis der opstår tætningsproblemer, kan vakuum fedt anvendes. - Sæt O-ringene i de respektive riller i holderen, og kontrollere, at de passer og ikke stikker på hver side af rillen.
- Hold TEM indehaveren væskestrømmen fri for støv, indtil prøven belastning (f.eks., Ved at dække den med aluminiumfolie).
- Rengør alle værktøjer (pincet og en skruetrækker), der vil være i kontakt med vakuum dele ved hjælp af acetone og ethanol i et ultralydsbad og placere dem på støvfri overflade tilvejebragt af et stykke nyt aluminiumsfolie placeret på arbejdsbordet. Arbejde med handskerat undgå forurening af strømningen TEM indehaveren væske.
- Montering TEM indehaveren væskestrømmen
BEMÆRK: Følgende procedure beskriver proceduren lastning af mikrochips i en prøve holder med optimal orientering for STEM. I denne konfiguration vil basen mikrochip med prøven være den øvre mikrochip engang overført til mikroskopet. Se figur 4. For TEM, er den højeste rumlige opløsning opnået ved bunden af den flydende celle i forhold til en nedadrettet-traveling elektronstråle. Således vil de mikrochips monteres den anden vej rundt.- Brug buede pincet til at få fat i prøven mikrochip på den lange side og placere det inde i åbningen (lomme) i spidsen af flow TEM holder væske. Hold SiN side opad. Kontroller den korrekte placering af mikrochip i spalten ved hjælp af en kikkert lysmikroskop.
BEMÆRK: Hvis O-ringen under mikrochip ikke er placeret korrekt, kan mikrochippen rage from åbningen. - Placer en dråbe af 0,3 pi af den filtrerede væske til eksperimentet på prøven mikrochip under anvendelse af en mikropipette. Hvis det er nødvendigt, fastsætte mikrochippen på plads med en pincet, da de kapillære kræfter dråben kan trække mikrochip ud af sin lomme.
- Bruge hovedet buede pincet til at tage den anden mikrochip (den med afstandslaget). Vend forsigtigt mikrochip på hovedet. Placer spacer mikrochip på basen mikrochip i stikket.
BEMÆRK: Denne procedure skal gøres tilstrækkeligt hurtigt for at undgå tørring af dråben på prøven mikrochip. - Undersøg den korrekte placering ved hjælp af en kikkert lysmikroskop, mens du flytter et stykke lysreflekterende materiale under spidsen af holderen prøven. Begge mikrochips skal være justeret nøjagtigt parallelt for at opnå den bedste overlap af Sin vinduer.
BEMÆRK: I tilfælde vinduerne ikke overlapper, de mikrochips kan flyttes ved at skubbe på den ene side med en spidspincetten, men undgå at flytte mikrochips for meget, da det SiN membran kan blive beskadiget nemt. Nogle mikrochips kommer med en krydset konfiguration (vinduet i en mikrochip er vinkelret på vinduet i den anden mikrochip); denne konfiguration letter opretningen af de to mikrochips endnu reducerer også synsfeltet i elektronmikroskop. - Tag forsiden af prøven kammerets låg med pincet og vend det på hovedet. Uden at røre ved mikrochips, placere bagsiden af låget på spidsen. Åbn langsomt pincetten på en sådan måde, at låget udelukkende hviler på den nederste gren af pincetten. Sænk forsigtigt låget, indtil det hviler på de to mikrochips. Fjern pincet.
- Kontrollér justeringen af vinduerne i begge mikrochips. Hvis det er nødvendigt, fjerne låget, justere placeringen af mikrochips, og placere låget igen.
- Placer skruerne og løse dem i deres sædvanlige steder. Kontroller justeringen af de to vinduer. jegf nødvendigt fjernes skruerne igen og juster mikrochips.
BEMÆRK: Du må ikke lave skruerne for stramt, da dette kan medføre skader. Et vakuum forsegling opnås, når skruerne bare stramme. - Kontroller tæthed ved at indlede en væskestrømning gennem systemet med en strømningshastighed på 4 pl / min. Hvis der ikke observeres utæt på hver side af spidsen, det er en god indikation af vakuum tæthed.
- Overfør holderen til vakuumpumpen station og kontrollere vakuum tæthed. Vakuum-niveau skal nå mindst 10 -5 mbar senest 5 minutter pumpning.
BEMÆRK: Det anbefales at teste pumpestationen med en dummy holder før brug. - Overfør holderen til elektronmikroskop i sit bur for at forhindre det i at samle støv.
BEMÆRK: Hver kommerciel holder kommer med et kabinet.
- Brug buede pincet til at få fat i prøven mikrochip på den lange side og placere det inde i åbningen (lomme) i spidsen af flow TEM holder væske. Hold SiN side opad. Kontroller den korrekte placering af mikrochip i spalten ved hjælp af en kikkert lysmikroskop.
3. STEM af en prøve i Liquid
- Justering af elektronmikroskop for STEM BEMÆRK: Funktionen af elektronmikroskop beskrevet i denne protokol er baseret på standard procedurer, der kan findes i brugermanualen. Protokollen beskriver den ønskede detalje ud over standard procedurer for dataindsamling på flydende prøver.
- Start mikroskopet med STEM tilstand på linie. I holder prøven, indsætte en stikprøve bestående af en tynd carbon film med AuNPs. Juster indstillingerne for STEM mikroskop som følger: sæt sonden strøm til 0,18 nA og konvergensen semi-vinkel elektronstråle til 20 mrad ved at vælge en plet størrelse 4C og målet blændeåbning på 30 um. Vælg en 8 cm kamera længde.
- Notér den angivne strømtæthed målt ved fluorescens skærmen, mens der indsættes ADF detektoren. Fjern holderen prøven.
BEMÆRK: Denne aktuelle værdi er nødvendig senere at estimere tykkelsen af væsken. - Start væskestrømmen med rent vand. Du må ikke overstige en strøm af 2pi / min.
- Sæt flow TEM indehaveren væske i elektronmikroskop og start evakuering. Kontrollere både vakuum angivelse af forvakuum kammer og varigheden af evakuering. Hvis vakuumniveauet er standard og varigheden af pumpning procedure ikke overstiger den normale evakuering tid (ca. 1 minut) med en faktor på to, indsætte holderen.
- Åbn stråle ventilen, når vakuum af de vigtigste prøvekammeret er i området, der tillader dets åbning. Sæt ADF detektoren ved at trykke på ADF.
BEMÆRK: Denne protokol henviser til en ADF detektor placeret over phosphor screen af elektronmikroskop. - Indstil mikroskopet i kontinuerlig erhvervelse billedtilstand hjælp en billedstørrelse på 512 x 512 pixels, en pixel opholdstid på 2 mikrosekunder, og en forstørrelse på 20.000. Søg efter vinduet SiN ved at oversætte den fase i x- og y-retninger.
BEMÆRK: De mikrochips blokere elektroner passerer gennem prøven mod opdageeller; signal er kun synlig på placeringen af synden. Se figur 5. Nogle gange er det nemmere at finde vinduet SiN ved at se fluorescensen skærmen. - Når vinduet er fundet, justere kontrast og lysstyrke (ved hjælp af de respektive knapper), således, at kanten af vinduet bliver synlig. Flyt kant mod midten af synsfeltet ved at trykke x- og y-oversættelse knapperne på prøvebordet. Tryk på reset-knappen på objektivet.
BEMÆRK: Lysstyrken skal i stor udstrækning reduceret i forhold til et vakuum prøve på grund af stærk spredning i væsken. - Fortsæt ved grov fokusering det skarpe hjørne ved kanten af vinduet SiN ved at justere den lodrette position (z-translation) af prøven fase. Kontrollere, at prøven position er i den eucentric højde ved at dreje stadium ved 5 ° og dreje det tilbage. Funktioner af prøven og hjørne af vinduet SiN bør ikke skifte ved lave forstørrelser.
- Justere lodret stilling efter behov for at placere vinduet kant i midten af synsfeltet igen. Gemme positionen af scenen ved anvendelse butikken knappen af softwaren.
- Flyt til en position, hvor små stykker af snavs eller andre formål med høj kontrast (f.eks AuNPs) er til stede ved at oversætte den fase i x- og y-retningerne. Juster fokus af objektivets så alle objekter vises skarpt i fokus.
- Læg mærke til strømtæthed målt ved phosphor screen synlig via operativsystemet software, der angiver den transmitterede strøm gennem væsken holder og gennem åbningen af ADF-detektor. Beregn tykkelsen af den flydende celle ved anvendelse af ligning 1. Fortsæt kun hvis væsken tykkelsen er blevet bestemt og ikke overstiger 3 um.
14
ligning 1
med t SIN tykkelsen af den amorfe siliciumnitrid membran og t vand tykkelsen af vandlaget. Den gennemsnitlige frie vej længder beløb til l SiN = 0,79 um af synd, = og l vand = 3,0 um vand til detektoren åbning semi-vinkel på 35 mrad 14. - observere omhyggeligt væsken ved lavere forstørrelser at sikre, at gasbobler ikke er til stede. Gasbobler kan forhindres ved hjælp af kontinuerlig væskestrøm og sonde nuværende lavere end 0. 5 nA.
- Oversæt scenen i x- og y-retninger, indtil et område med mindst 20 AuNPs has er fundet. Indstil billedstørrelsen til 1.024 x 1.024 pixels, pixel opholdstid til 19 mikrosekunder, og forstørrelsen til 400.000. Anskaf billeder af AuNPs klæbet til Sin membran ved at trykke på knappen købet.
BEMÆRK: Når billederne er blevet opnået, hvor AuNPs er synlige med stærk kontrast og skarpe kanter (se figur 6), kan man være sikker på, at eksperimentet er korrekt sat op. I tilfælde opstå uventede problemer, skal du ikke gå videre med forsøget, men sørg for at løse årsagen.
- STEM af opløsningen af AuNPs
- Fjern strømningen TEM indehaveren væske fra mikroskopet og stoppe væskestrømmen.
- Fremstilles mindst 1 ml af en opløsning af 0,1 M natriumchlorid i HPLC-kvalitet vand i et glas injektionssprøjte.
- Juster strømningssystem til en hastighed på 20 pi / min og skyl hele strømmen systemet med 0,3 ml saltopløsningen. Brug filter papir til at opsamle væsken udsprøjtning påanden ende af røret. Bagefter genjustere strømningssystem til 2 pl / min.
- Kontrollere integriteten af vinduet SiN anvendelse af et binokulært lysmikroskop. Hvis der ikke observeres lækage, genindsætte flow TEM indehaveren væske ind i mikroskopet.
- Kontroller vakuum angivelse af præ-vakuumkammer og varigheden af evakuering. Hvis vakuumniveauet er standard og varigheden af pumpning procedure ikke overstiger den normale evakuering tid (ca. 1 minut) med en faktor på to, indsætte holderen
- Flyt fase bagsiden af mikroskopet tilbage til sin tidligere position ved hjælp af lagrede position fase. Indstil mikroskopet i kontinuerlig erhvervelse billedtilstand hjælp en billedstørrelse på 512 x 512 pixels, en pixel opholdstid på 2 mikrosekunder, og en forstørrelse på 20.000 x. Juster kontrast, lysstyrke, fokus og eucentric højde, som beskrevet i trin 3.1.7-3.1.9.
- Find et sted af interesse ved at oversætte den fase i x- og y-retninger. Indstil billedstørrelsentil 1.024 x 1.024 pixels, pixel opholdstid til 2 mikrosekunder, og forstørrelsen til 500.000. Optag en serie af STEM billeder ved at trykke på knappen erhvervelse manuelt, når det forrige billede er blevet optaget.
BEMÆRK: De AuNPs starter, så snart elektronstrålen scannes over prøven for at opløse. Partikler uden det bestrålede område påvirkes ikke og kan iagttages umiddelbart efter. Tidsstemplet lagres i billedet header. Det er også muligt at anvende software til automatisk indsamling af en serie af billeder til en film.
- Adskillelse og rengøring indehaveren TEM efter forsøget
- Når væske-fase TEM eksperimenter er afsluttet, og holderen er trukket tilbage fra elektronmikroskop, rengøre slangen, det flydende kammer, og dens komponenter for at fjerne alle partikler eller resterende salt, der kan påvirke fremtidige eksperimenter.
- Løsn den bageste skrue lidt, så det stadig er fasti sin slot, men låget kan fjernes nemt. Løsn den forreste skrue, fjerne det, og placere den i et støvfrit miljø.
- Fjern låget, og læg det i støvfri omgivelser til opbevaring.
- Fjern de to mikrochips fra lommen. Adskille dem ved at dyppe dem grundigt i vand eller i den resterende opløsning af eksperimentet. Placer mikrochips på silkepapir med SiN membranen side opad og lad dem tørre i luft til yderligere analyse.
- Fjern O-ringe og rengør de respektive riller med HPLC-kvalitet vand. Opbevar O-ringe i et støvfrit miljø.
- Anvend en glassprøjte (5 ml) for at skylle alle rør (input og output), hver med 5 ml HPLC-kvalitet vand. Opsamling af væsken med en lille bæger placeres under TEM holderen spids. Efter skylning, brug en pipette og / eller filterpapir for at fjerne den resterende væske fra væskekammeret.
- Undersøg spidsen af indehaveren af TEM og fjern rester ligesom brudte kanter af silicium mikrochips, fibre eller støv. Hvis salt er stadig synlige, skal du gentage rensningen. Retur O-ringene til deres riller.
- Opbevar TEM indehaveren og dets komponenter i et støvfrit miljø.
- Procedure alternativ til 3,2: STEM af bevægelige nanopartikler af guld
BEMÆRK: En anden samling procedure er nødvendig for at studere bevægelse AuNPs i væske.- Udelad trin 1.2. Læg AuNPs på silicium mikrochip umiddelbart inden du sætter dem i TEM Holder i trin 2.2. Hold prøven dækket af et flydende lag på alle tidspunkter for at undgå en stærk fastgørelse af AuNPs til SiN membran. De andre trin i protokollen er de samme. En serie af STEM billeder er opnået i trin 3.2.6.
ligning 1 
Figur 4: Samling af Liquid Flow TEM Holder. (A) Den flydende celle rum med the mindre O-ring placeres i rillen. Den indsatte viser ovenfra. (B) Basen mikrochip er anbragt i den respektive sokkel. Det indsatte viser sidebilledet på sådan vinkel, at mikrochippen er synlig fra lysrefleksion. (CD) En dråbe af opløsningen sættes til mikrochippen. (EG) Placering af dækslet mikrochip. (HI) Placering af låget af den flydende cellekammer. (J) Fiksering af låget med de to skruer. (K) sammensatte væskestrøm TEM holder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Indledende Positionering og Fokusering ved hjælp STEM Mikrografer. (A) For at finde vinduet SiN, er scenen flyttet mod den lyseste SIGnal. Silicium mikrochip er tynd nok for nogle elektroner at passere gennem tæt til vinduet. (B) Kanten af det fokuserede SiN vindue, der viser nogle AuNPs opført lyse på den mørke (mindre spredning) SiN membran vindue. Kanten af mikrochippen er lyse på grund af overdreven spredning. (C) Fokusering sker på hjørnet af vinduet synd. Billederne viser under-fokuseret, i fokus, og over-fokuseret situationer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
flow TEM Indehaveren væsken blev anvendt til at undersøge opførslen af AuNPs i væske. AuNPs blev stabilt immobiliseret på SiN membran i rent vand og blev afbildet på nanoskala hjælp væske-fase STEM (figur 6). Fremragende kontrast blev opnået på den stærkt-spredning guld. Den strømtæthed på phosphor screen målt for en tør testprøve var 20 pA / cm, mens det udgjorde 8 pA / cm med væskestrømmen TEM holder indsat. Anvendelse af ligning 1, t vand = 2,4 ± 0,5 um, meget større end hvad der var forventet baseret på afstandsstykket tykkelse på 200 nm. Alligevel er tykkelsen ikke er for store til billeddannelse af AuNPs med nanometer rumlig opløsning. Den flydende tykkelse var tykkere end 200 nm fastsat af spacer grund udbuling af SiN membraner, ikke-fladhed af mikrochips, og snavs bosat på mikrochips.
16, selvom reaktive Radiolyseprodukterne (e - aq, H • H +, OH •) med oprindelse fra interaktionen af elektronstråle med vand kan oxidere enkelt guld atomer, fører til en ændring af formen af AuNPs 15. Men når væskeflowet systemet blev anvendt til at indføre chloridioner i et andet eksperiment, stabiliteten af de AuNPs ændret. Chloridioner stand til at stabilisere oxiderede guld atomer i form af tetrachloroaureat, AuCl 4 -. Figur 7 viser, at AuNPs langsomt opløst i en STEM imaging tidsforskudt serie i lighed med resultater rapporteret tidligere 16. For den anvendte elektron dosishastigheden, tog det ~ 300 s til at opløse de 30 nm-sized AuNPs.
Bevægelserne af AuNPs i wate R blev undersøgt i et tredje eksperiment (figur 8). Forud for forsøget blev flow TEM holder væsken renses for at fjerne alle spor af salt. Til forskel fra det første forsøg blev en alternativ prøveforberedelse tilgang, der anvendes til at opnå en svagere tilknytning af AuNPs til SiN membranen 14. I dette eksperiment blev AUNP opløsningen placeret på silicium mikrochip og samles i strømmen TEM indehaveren væske uden at lade opløsningen tørre ud. På denne måde, de AuNPs let adskilt fra SiN membranen ved billeddannelse med en dosis, der anvendes. Nogle af AuNPs bevæges bort fra synsfeltet ind i de bulkopløsninger, mens de resterende AuNPs holdt sig inden for synsfeltet i umiddelbar nærhed af vinduet SiN. Bevægelser af disse AuNPs blev observeret, og til sidst de agglomererede. Efter et stykke tid, disse agglomerater også løsrevet fra SiN membranen og flyttede ud af synsfeltet og ind i løsningen.
ntent "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 6: Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) Mikrograf af AuNPs 30 nm i diameter på toppen af en Pure Water Layer. Den viste billede er et udvalgt område af det oprindelige billede. Billedstørrelsen var 1.024 x 1.024 pixels, pixel opholdstid var 19 mikrosekunder, pixel størrelse var 0,73 nm, og forstørrelsen var 400,000X. Elektronen dosis var således 7,1 x 10 4 e - / nm². Strømtætheden måles på phosphor screen var 8 pA / cm2, så væsken tykkelse blev beregnet til at udgøre 2,4 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Time-lapse-serienSTEM mikrografier af AuNPs i Saline. (AD) Billeder udvundet af time-lapse serie STEM billeder med 30 s intervaller. De AuNPs gradvist opløses i væsken som følge af tilstedeværelsen af chloridioner. Den pixel opholdstid var 2 mikrosekunder, ramme tidspunktet for tidsforskydningen serien var 1,75 s, pixelstørrelse var 0,44 nm, og forstørrelsen var 500,000X. Elektronen dosis pr billede var 1,2 x 10 4 e - / nm². Den flydende tykkelse var 2,4 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: STEM Mikrograf af AuNPs Flytning i rent vand. (A) SiN membran med AuNPs, hvoraf flere er valgt med pile. (B) spor Motionaf de udvalgte AuNPs (se A). Nogle AuNPs bevæge sig væk fra synsfeltet i den tid af billeddannelse. De resterende AuNPs bevæge sig lateralt langs SiN membran og begynde agglomerering. Efter at have nået et kritisk klynge størrelse, de afsendelsen fra membranen og bevæge sig væk fra området visning.Hotellet pixel opholdstid blev 1 mikrosekund, rammen tid var 0,52 s, pixel størrelse var 1,8 nm, og forstørrelsen var 120,000X. Elektronen dosis pr billede var 3,5 x 10 2 e - / nm² og væsken tykkelse 2,4 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den beskrevne protokol muliggør STEM af AuNPs i en væske, herunder observation af dynamiske processer. Samlingen af indehaveren er en nem-at-lære teknikken. Dog skal flere aspekter overvejes, når der arbejdes med strømmen TEM holder væske. For eksempel kan brudte kanter af Si mikrochip eller store partikler på O-ringene resultere i lækage af det flydende celle. På den anden side, store partikler (> 200 nm; fx støv eller Si materiale) kan på SiN membran resultere i en forøget tykkelse af det flydende celle, hvilket fører til en lav billeddannelse kontrast eller til en lav rumlig opløsning og endog medføre SiN vinduer til at bryde. Vigtigt er det, kan rester af salt eller andre kemikalier påvirke resultatet af forsøgene på en uønsket måde. Derfor er det afgørende, at de forskellige trin i prøveforberedelse og holder samling udføres omhyggeligt og på et rent og støvfrit miljø.
Tykkelsen af den flydende cell bestemmer den opnåelige opløsning, samt kontrasten af de opnåede billeder 17. Denne tykkelse kan justeres via afstandsstykker placeret på en af de to Si mikrochips. Afhængigt af dimensionerne af prøven, kan forskellige tykkelser af det flydende celle realiseres. Til studiet af AuNPs, er det muligt at anvende små afstandsstykker (200-500 nm), mens hele eukaryote celler brug for større afstandsstykker på op til 5 um. Tykkelsen af den flydende celle er yderligere påvirket af udbuling af SiN membran vinduer som følge af trykforskellen mellem væsken celle og den omgivende vakuum. Denne virkning bliver mere udtalt med større SiN membran vinduer. Således, for at minimere tykkelsen af den flydende celle, anbefales det at bruge små SiN membran vinduer. I tilfælde er det vanskeligt at finde en overlapning mellem to små vinduer, kan de samles i en krydset konfiguration under anvendelse af en anden base, mikrochip. Alternative konfigurationer largely forhindre udbuling og består af et monolitisk mikrochip 18 eller membran vinduer understøttet af søjler 19, men disse udviser ulemper vedrørende prøvepåsætning. Et af de mest udfordrende aspekter ved den nuværende teknologi er manglen på præcis kontrol over den flydende tykkelse. Ofte er væsken meget tykkere end hvad der forventes af afstandselementerne dimensioner anvendes, som blev vist her. Flere grupper brugte lukket flydende kamre 4, 20, 21, 22; disse systemer har nogle fordele med hensyn til rumlig opløsning, som den flydende tykkelse kan reduceres ved at inducere en boble i væsken. Alternativt kan SiN vinduer blive tvunget til at bryde sammen, hvilket fører til en tyndere flydende lag. For det tredje, indkapsling af andre tyndere vinduer eksisterer (f.eks graphene) 23, også resulterer i meget tyndere væskerend hvad der er muligt med systemet beskrevet i denne protokol. Det er imidlertid umuligt at flyde væske i disse systemer.
Som for enhver høj opløsning mikroskopi teknik, skal en række eksperimentelle aspekter tages i betragtning. Det vigtigste aspekt er samspillet af elektronstrålen med væsken eller prøven. Foruden stråleskader, hvilket begrænser den opnåelige rumlige opløsning for mange faste prøver 24 er de flydende prøver også påvirket af elektronstrålekanoner-genereret Radiolyseprodukterne 15, 25. Da disse produkter kan påvirke forsøget, omhyggelige data fortolkning og eksperimenterende design er afgørende 26. Mikroskopet indstillinger skal vælges i overensstemmelse med målene for en bestemt undersøgelse. ADF STEM er mere kraftfuld for billeddannende nanopartikler af en høj atomnummer (Z) i større tykkelser af det flydende celle, while TEM giver bedre kontrast på lav-Z materialer og er typisk hurtigere, men kræver tyndere flydende lag 3. Stedet for at bruge ADF detektoren er Bright Field (BF) detektor undertiden anvendes til at afbilde det flydende celle, eftersom BF STEM er fordelagtig til afbildning lav-Z materialer i tykke lag 27. Med stigende tykkelse af den flydende celle, er behov for mere strøm. Dette forøger imidlertid også koncentrationerne af Radiolyseprodukterne og øger strålingsskade. Det skal også bemærkes, at en omvending af kontrastmiddel observeres i ADF detektor til meget tykke væsker (> 10 um for vand).
De flydende betingelser blev ændret mellem vore forsøg ved at fjerne holderen fra mikroskopet og udveksling både prøven og væsken. Ud over at ændre saltkoncentrationen, er det let muligt at ændre andre egenskaber af væsken ved at strømme i forskellige væsker (f.eks, kan manbruge bufferopløsninger for at sætte en bestemt pH-værdi 16 eller kan indføre økologiske løsninger eller andre tilsætningsstoffer). Det er også muligt at ændre væsken mens holderen stadig er indsat i mikroskopet ved at strømme væsker gennem mikrofluidsystem. Men i dette tilfælde er det ukendt, på hvilket tidspunkt punkt væsken ved prøven ændringer. Det er også bemærkelsesværdigt, at mikrochips understøttende elektroder er tilgængelige, så nanoskala elektrokemi eksperimenter kan udføres 28.
Formålene med undersøgelsen er ikke begrænset til AuNPs i vand, men en lang række prøver kan undersøges under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, herunder silica, titanoxid, og polymerer. Hvis bevægelser af objekter er for hurtigt til at fange i et billede inden købet, kan viskositeten reduceres med en størrelsesorden ved hjælp af en blanding af 50% glycerol og 50% vand.
Fra de førnævnte punkter,en række fordele, muligheder, og også ulemper bliver synlige. Når man arbejder med flydende fase STEM, de vigtigste ulemper at overveje, er, at: 1) enhver eksperiment er påvirket af det dynamiske samspil af elektronstrålen med hele prøven (objektet under observation, væsken og Synden membraner); 2) prøvehåndteringen er langsommelig, og det er ofte vanskeligt at opnå et tyndt væskelag, fordi prøven eller mikrochips indeholder nogle mikrometer størrelse partikler; 3) den flydende tykkelse sædvanligvis varierer stærkt fra den tiltænkte tykkelse fastsat af afstandsstykket; og 4) rumlig opløsning og kontrast stærkt afhænge af flydende tykkelsen og forskellen mellem ændringen densiteten af objektet under observation og væsken.
I øjeblikket findes der rigelig metoder for mikroskopi af objekter i væske med nanometer rumlig opløsning. Elektronmikroskopi i amorf is er en kraftfuld teknik 29,men de involverede eksperimentelle procedurer er sarte, ikke alle eksperimenter tillader forberedelse af prøven i is, og tid-løst eksperimenter er umulige. Røntgenmikroskopi 30, 31 kunne i princippet anvendes, men det har en begrænset rumlig opløsning og er ikke bredt tilgængelige i laboratorier. Atomic force mikroskopi i væske er blevet fastlagt, men er en overflade teknik kun 32, 33, 34, 35. Lysmikroskopi ikke udviser tilstrækkelig rumlig opløsning. På nuværende, elektronmikroskopi i flydende synes den mest kraftfulde teknik til direkte mikroskopi af nanoskala objekter og processer i væske.
Flydende-fase TEM og STEM er endnu ikke rutinemæssige analytiske teknikker, men er stadig under udvikling. Antallet af parametre for at tage i betragtning, er betydelig, og det er oftenn vanskelige at reproducere eksperimentelle resultater. Desuden kvantitative data er vanskeligt at opnå, fordi virkningerne af undersøgelsen er sammenflettet med processer, der forekommer som et resultat af elektronstrålen. Protokollen beskrevet her har til formål at standardisere forsøgsprotokollen, hvorved der tegner sig for alle relevante uædle aspekter af eksperimentet. Vi håber, at denne protokol vil føre til en bedre reproducerbarhed af eksperimentelt arbejde i dette nye område.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular light microscope | Leica | M60 CMO | |
| Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector | JEOL | ARM200F | |
| Liquid flow TEM specimen holder | DENS Solutions | Ocean | |
| Microfluidic syringe pump | Harvard Scientific | PicoPlus | |
| Plasma cleaner | Gatan | Solarus950 | |
| Chemicals | |||
| Acetone, Rotisolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
| Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
| Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
| Materials | |||
| Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Microfluidic peek tubing | Upchurch Scientific | 1570 | |
| Plastic Replaceable tips Tweezers | |||
| (Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips) | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
| Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
| Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
| Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR) | Hamilton | 81323 | |
| Clean room tissue Sontara Micropure AP (224 x 224mm) | DuPont | Sontara MicroPure |
References
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
- Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
- Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
- Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
- de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
- Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
- Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
- Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
- de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
- Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
- Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
- Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
- Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
- Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
- Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
- Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346 (2004).
- Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
- Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
- Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
- Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
- Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
- Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
- Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
- Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
- Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).
