Summary
Detta protokoll beskriver driften av ett vätskeflöde provhållare för avsökning transmissionselektronmikroskopi av AuNPs i vatten, som användes för observation av nanoskala dynamiska processer.
Abstract
Prover helt inbäddade i vätska kan studeras på en nanoskala rumsliga upplösning med Scanning transmissionselektronmikroskopi (STEM) med hjälp av en mikroflödeskammare monteras i provhållare för transmissionselektronmikroskopi (TEM) och STEM. Den mikroflödessystem består av två kiselmikrochips som stöder tunna kiselnitrid (SiN) membranfönster. Den här artikeln beskriver de grundläggande stegen för provladdning och datainsamling. Viktigast av allt är att säkerställa att vätskeavdelningen är korrekt monterad, vilket ger ett tunt vätskeskikt och en vakuumtätning. Detta protokoll innehåller också ett antal tester som behövs för att utföra under provladdning för att säkerställa korrekt montering. När provet laddas i elektronmikroskop, behöver den vätskeformiga tjockleken som skall mätas. Felaktig montering kan leda till en alltför tjock vätska, medan en alltför tunn vätska kan tyda på avsaknad av vätska, till exempel när en bubbla bildas. Slutligen protokolletförklarar hur bilder tas och hur dynamiska processer kan studeras. Ett prov innehållande AuNPs avbildas både i rent vatten och i saltlösning.
Introduction
Konventionell Scanning transmissionselektronmikroskopi (STEM) är begränsat av intervallet av prover lämpliga för analys, specifikt de torra och fasta prover som är lämpliga för placering i ett högt vakuum. Men många vetenskapliga och tekniska frågor rör nanomaterial och processer i flytande miljö. Prover fullständigt inbäddade i vätska kan nu studeras med STEM med användning av ett koncept som innebär en mikroflödeskammare monterad i provhållaren för transmissionselektronmikroskopi (TEM) och STEM 1. Denna nyutvecklade tekniken har blivit allt populärare, eftersom det ger nya insikter i viktiga processer i olika forskningsområden, inklusive tillväxt, upplösning och aggregering processer nanopartiklar 2, 3, 4, 5, 6. Inte bara metaller, men också biominerals 7 och biologiska system kan studeras 8, 9, 10, 11. Provet lastning och bild förvärv för flytande fas STEM är annorlunda än för STEM av torra prover och innebär ett protokoll som kräver dedikerade utbildning.
Den mikroflödessystem består av två kiselmikrochips som stöder Kiselnitrid (SiN) membran fönster öppna för elektronstrålen vid 200 keV energi 12 (se figur 1A). Närmare uppgifter om de dimensioner och av hanteringen av dessa mikrochips kan hittas någon annanstans 12, 13. Provet innehåller vanligtvis nanoobjekt. I denna uppsats observerade vi guldnanopartiklar (AuNPs). De AuNPs är immobiliserade på det övre fönstret (med avseende på en nedåt reser elektronstråle) eller flyta i flytande tvid. Nanoskala rumsliga upplösningen i STEM erhålls genom avsökning av elektronstrålen över AuNPs och samla sänds spridda elektroner med hjälp av ringformiga mörka fält (ADF) detektor 9. De två mikrochips är placerade i en liten slits i spetsen av vätskeflödet TEM hållaren 1 (hållaren fungerar för både STEM och TEM men benämnes TEM hållaren). En av mikrochips innehåller ett distansorgan, så att en vätskeavdelningen bildas mellan mikrochips. O-ringarna på båda sidor av de två mikrochips ger vakuumförslutning av vätskeavdelningen 13 (se figur 1B).
Syftet med denna artikel är att visa de grundläggande stegen för provladdning och datainsamling så att intresserade användare kan finna enkel tillgång till denna framväxande nya tekniken. Ett system tillgängligt från ett visst företag används, men protokollet är också giltiga för system av andra företag. Tekniken ärmer komplex än konventionella TEM och STEM, och ett antal praktiska aspekter måste beaktas när man arbetar med en flytande hållare systemet 13. Viktigast av allt är att säkerställa att vätskeavdelningen är korrekt monterad, vilket ger ett tunt vätskeskikt och en vakuumtätning. Därför är det mycket viktigt att arbeta rent och för att förhindra dammbildning under beredning och montering av vätskeflödet TEM hållare. I synnerhet O-ringarna och två kiselmikrochips måste vara fri från all kontaminering. Även små partiklar av damm på ett av de mikrochips kan allvarligt öka tjockleken på den monterade cellen, vilket kan hindra uppnåendet av en användbar spatial upplösning. En vakuumtätning är viktigt så att ingen kontaminering eller skada kommer att vara kvar i elektronmikroskop efter experimentet. Detta protokoll beskriver laddningsproceduren och flera nödvändiga tester. Driften av elektronmikroskopet är okomplicerad, but det kräver några extra steg jämfört med mikroskopi av fasta prover. Med ökande vätsketjocklekar, fler elektroner absorberas och sprids av vätskan; en mätning av den vätskeformiga tjockleken är väsentlig. Slutligen förklarar protokollet hur bilder tas och hur dynamiska processer kan studeras.
Figur 1: Vätska Flow Cell för skanning transmissionselektronmikroskopi (STEM). (A) Schematisk illustration av den sammansatta vätske cellen. Två kiselmikrochips med kiselnitrid (SiN) membranfönster är placerade mellan två O-ringarna. Vätskan är innesluten mellan den SiN membranet och är således separerade från vakuumet i elektronmikroskop. En fokuserad elektronstråleskanningar över provet. Kontrast erhålls från spridda elektroner. Guldnanopartiklar (AuNPs) immobiliseras inuti vätskan vid SiN membranet men kan även röra sig iflytande. (B) Schematisk sidovy tvärsnitt av stapeln av två mikrochips med O-ringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Figur 2: Rengöring rättegångs Si mikrochips. (A) Två bägare fylls med 40-60 ml aceton och etanol vardera. (B) Den Si mikrochips placeras i bägare fylld med aceton. Sidan med SiN membranet ska vara vänd uppåt. Reflektionen av de två Si mikrochips visar tydligt spåret på baksidan av två mikrochips. (C) Efter 2 min, är Si mikrochips överförts till den andra bägare fylld med etanol. Efter ytterligare 2 minuter, är Si mikrochips överfördes till ett renrum vävnad för torkning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Liquid Flow Transmission Electron Microscopy (TEM) Holder utrustning. (A) Vätskeflödet TEM hållare med plastslang och en spruta för vätskeflöde. (B) Spetsen av vätskeflödet TEM hållaren bort från hållaren axeln, locket på vätskecellavdelningen, O-ringar, och två kiselmikrochips. Slangen skjuter ut från den vänstra sidan av spetsen. (C) Den flytande cellutrymmet som visar ett O-ring, facket för mikrochip placering. (D) Olika pincett på en dammfri yta (aluminiumfolie). (E) Locket på den flytande cellavdelningen med sina två O-ringar. (F) Två kiselmikrochips med SiN membran fönster. Vänster: provet mikrochip utan spacer; höger: täck mikrochip med en 200 nm spacer. (G) Ett mikroflödespumpsystem. Klicka här för att se en större version av denna Figure.
1. Framställning av de Mikrochips
1. Rengöring av mikrochips
- Förbered en arbetsyta med en låg dammnivå i en laminärt luftflöde huva med en damm partikelfilter.
- Rengöra en ljusmikroskopi glasskiva med en fiberfri vävnad och ren etanol för placering och transport av mikrochips. Placera objektglaset på ett renrum vävnad i en petriskål.
OBS: Undvik att använda teknisk etanol vid alla tidpunkter. - Välj 5 bas mikrochip (utan spacer) för prov placering och 5 mikrochips med en distans 200 nm tjockt.
OBS: Fönstret mått är 20 x 400 pm 2 och SiN tjocklek är 50 nm. Eftersom det finns viss tolerans på dimensionerna, rekommenderas att kontrollera dimensioner med hjälp av ett ljusmikroskop. - Använd kolbelagda pincett för att avlägsna mikrochips från lagringslådan och placera dem på objektglaset. Ta tag i mikrochips stadigt men försiktigt på deras long sidor. Hantera mikrochip så att SiN membransidan alltid är vänd uppåt.
OBS: Undvik att vidröra den bräckliga SiN membran på ovansidan. Också vara försiktig med hanteringen av mikrochips för att undvika sprickbildning sina skarpa kanter, vilket kan orsaka problem på grund av kiselpartiklar som bor på mikrochip eller senare läckage.
OBS: Utbildning för förfarandet för att ta bort mikrochips från den klibbiga ytan kan utföras på (billiga) dummy mikrochips. - Placera mikrochips på en renrums vävnad i en petriskål. Stänga skålen och överföra den till dragskåpet.
OBS: Stegen omfattar aceton utförs i ett dragskåp för kemikaliesäkerhet. - Ta två 120 ml-glasbägare. Skölj en bägare med aceton och den andra med etanol för att rengöra dem. Fylla den första en med 40-60 ml aceton och den andra med 40-60 ml etanol.
OBS: Det är viktigt att använda HPLC-grade vätskor också för detta steg i protokollet. - Överföramikrochips i bägaren med aceton för att ta bort skydds resistskiktet. Rör försiktigt bägaren för hand för att effektivt skölja mikrochips, men vara noga med att inte vända mikrochips upp och ner - se figur 2.
- Efter två minuter, ta bort mikrochips och snabbt överföra dem i bägaren med etanol. Rör försiktigt bägaren för hand med etanol i 2 min för att avlägsna eventuella rester av resistskiktet. Täck bägaren med aluminiumfolie och överför den till laminärt luftflöde bänken.
OBS: Låt inte mikrochips torka ut under överföringen för att undvika deponering av avfall. - Ta bort mikrochips från bägaren och placera dem på en ny renrums vävnad. Låt dem torka i några minuter och överföra mikrochips på ljusmikroskop glasskiva i petriskålen.
OBS: De våta mikrochips kan enkelt bläddra runt, vända upp och ner, eller hålla sig till de pincett när de släpps. Detta kan undvikas genom pressjunga mikrochips mjukt på filterpapper och dra pincetten bort i horisontell riktning. - Stäng petriskål och överföra mikrochips till plasma renare.
- Placera glasskiva med mikrochips in i plasma renare. Köra en 5 min rengöringsprogram för att göra ytan av kiselnitriden membranet hydrofil och för att avlägsna kolväten.
OBS: Lämpliga inställningar som används för vår plasma renare är: 70 mTorr, gasflödet av 11,5 sccm för O2 och 35,0 sccm för Ar, 50 W framåt Radio Frequency (RF) mål, 5 W RF-området, och max reflekterade RF. Alla plasma förmåga att inducera en ytladdning är lämplig. - Sätt glasskiva med mikrochip tillbaka i petriskålen, stäng locket och överför den till ljusmikroskop.
- Undersök mikrochips under ett ljusmikroskop för eventuella membranbrott eller kvarvarande smutspartiklar. Var särskilt försiktig med fönsterytor och kontrollera små fläckar indikerar arupture av membranet. Avfärda mikrochips med skadade membran.
- Stäng petriskål och förvara den i laminärt luftflöde bänken.
2. Beredning av provet på mikrochips
- Bered en vatten AuNP lösning (citrat stabiliseras) genom att blanda små mängder av stamlösningarna innehållande 30 nm diameter, citrat stabiliserade AuNPs vid en koncentration av ~ 3 M.
- Placera mikrochips på en ren, klibbig yta i en transportlåda för dropp application / prov nedfall.
- Placera en liten droppe (1-2 mikroliter) av provlösningen på SiN membransidan av den färskt plasma-rengjorda mikrochip (använd ett mikrochip utan en spacer) och låt lösningen torka i laminärt luftflöde arbetsbänken.
OBS: Denna procedur kan upprepas för att öka koncentrationen av AuNPs på SiN membranet. - Applicera 1 mikroliter avjoniserat vatten för att mikrochipet för avlägsnande av salt och / eller ytaktiva medel. Efter 30 sekunder, nogaavlägsna droppen av vatten med filterpapper. Låt mikrochips torka i luft i laminärt luftflöde arbetsbänken.
OBS: Ett tillräckligt stort antal AuNPs kommer att ha anslutit sig till mikrochip och kommer inte att tvättas bort i vatten längre. - Använd det beredda provet mikrochips inom 4 timmar, som SiN förlorar sina hydrofila utförda ytegenskaper över tiden, vilket kan leda till att vätskan beter sig annorlunda under ett experiment. Obs: Se till diskussionsavsnittet för mer information.
- Använd en låda sluten transport för lagring och överföring av mikrochips.
2. Beredning av vätskeflödet TEM Holder
- Rengöring av vätskeflödet TEM hållare
- Rengör alla verktyg (pincett och en skruvmejsel) som kommer att vara i kontakt med vakuum delar med aceton och etanol i ett ultraljudsbad och placera dem på dammfri yta försedd med en bit av ny aluminiumfolie placeras på arbetsbänken. Arbetet med handskarför att undvika kontaminering av vätskeflödet TEM hållare.
OBS: De verktyg behöver inte vara stor utsträckning rengöras om en är säker på att de är rena för arbete med vakuum delar. Handskar kan undvikas om en är i stånd att hantera utrustningen utan att röra vakuumdelar. - Placera vätskeflödet TEM hållaren under binokulärt ljusmikroskop på ett sådant sätt som kan observeras spetsen på hållaren innehållande vätskekammaren. Se figur 3.
- Ta bort locket på hållaren spetsen och placera den på dammfri yta.
OBS: Locket titan är känslig för repor som orsakas av hårdare material som pincett. Det rekommenderas att använda polymerbelagda pincett för känsliga material. - Förbereda minst 1-2 ml rent vatten (HPLC-kvalitet).
OBS: Om man inte använder HPLC-kvalitet vätska, då är det rekommenderat att kontrollera att vätskor som används inte innehåller mikropartiklar som möjligen skulle kunna leda till träskor av flödessystemet; filter vätskan som behövs med en mikro por filter. - Använda en glasspruta (1 ml) för att spola hela flödessystemet med 0,5 ml rent vatten. Det rekommenderas att använda en mikroflödessprutpumpsystem. Använd en pipett och / eller filterpapper för att avlägsna den vätska som sprutas ut i vätskecellfacket. Testa alla slangar för vätskeflöde. Torka hållaren spetsen efteråt med användning av filterpapper och / eller en pipett.
- Använda ljusmikroskop för att kontrollera att spetsen av hållaren är ren och torr. Om det behövs, tvätta spets hållare med vatten eller etanol för att avlägsna eventuella fasta rester som kan ha lämnats kvar av den torkade lösningen. Ta bort bitar av damm eller rester av fibrer också. Försiktigt bort dessa bitar med pincett, och därmed undvika att repa titanytan. Kontrollera även inuti O-ringspåren och ta bort rester av vätska med en liten bit av renrum vävnad.
OBS: Om innehavaren inte blir ren med detta förfarande är det rekommenderatför att ta bort spetsen från hållaren och rengör den i aceton under 2 min och i etanol under ytterligare 2 minuter med användning av ett ultraljudsbad. - Inspektera alla ytterligare delar av spetsen (O-ringar, lock och skruvar) under ljusmikroskop och ta bort damm, fibrer, osv ...
OBS: Ibland måste små bitar som härrör från skruvar eller Si mikrochips tas bort också. Om det behövs, i korthet rengöra vakuum delar med HPLC-grade etanol. Locket och skruvar kan rengöras med hjälp av ultraljud, som förklarade för tipset. Undvik att placera O-ringarna ofta i etanol, eftersom det kan göra O-ringarna sköra med tiden, vilket minskar deras vakuumtäthet. Systemet drivs utan vakuum fett, men om tätningsproblem uppstår, kan vakuum fett användas. - Sätt O-ringarna i respektive spår i hållaren och kontrollera att de passar och inte sticker ut på någon sida av spåret.
- Håll vätskeflödet TEM hållare fri från damm tills provladdning (t.ex.., Genom att täcka den med aluminiumfolie).
- Rengör alla verktyg (pincett och en skruvmejsel) som kommer att vara i kontakt med vakuum delar med aceton och etanol i ett ultraljudsbad och placera dem på dammfri yta försedd med en bit av ny aluminiumfolie placeras på arbetsbänken. Arbetet med handskarför att undvika kontaminering av vätskeflödet TEM hållare.
- Montering av vätskeflödet TEM hållare
OBS: Nedan beskrivs laddningsproceduren av mikrochips i en provhållare med optimal orientering för STEM. I denna konfiguration, kommer basen mikrochip med provet vara den övre mikrochip gång överföras till mikroskop. Se figur 4. För TEM, är den högsta spatiala upplösningen erhållen i botten av den flytande cellen med avseende på en nedåttraveelektronstråle. Sålunda skulle de mikrochips monteras tvärtom.- Använd böjda pincett för att ta provet mikrochip på långsidan och placera den i spåret (pocket) i spetsen av vätskeflödet TEM hållare. Hålla SiN sidan vänd uppåt. Kontrollera korrekt placering av mikrochip i spåret med hjälp av en kikare ljusmikroskop.
OBS: Om O-ringen under mikrochip inte är korrekt placerad, kan mikrochip skjuta from slitsen. - Placera en droppe av 0,3 mikroliter av den filtrerade vätskan för experimentet på prov mikrochip med hjälp av en mikropipett. Om det är nödvändigt, fixera mikrochip på plats med pincett, eftersom kapillärkrafterna av droppen kan dra mikrochip ur sin ficka.
- Använd upp och ner böjda pincett för att ta den andra mikrochip (den med distansskiktet). Vänd försiktigt mikrochip upp och ned. Placera distans mikrochip på basen mikrochip i spåret.
OBS: Denna procedur måste göras tillräckligt snabbt för att undvika torkning av droppen på prov mikrochip. - Inspektera korrekt placering med hjälp av ett binokulärt ljusmikroskop medan du flyttar en bit av Ijusreflekterande material under spetsen på preparathållaren. Båda mikrochips måste anpassas exakt parallellt för att uppnå bästa överlappning av SiN fönster.
OBS: Om fönstren inte överlappar varandra, mikrochips kan flyttas genom att trycka på en sida med en spetspincetten, men undvika att flytta mikrochips för mycket, eftersom SiN membranet kan lätt skadas. Vissa mikrochips kommer med en korsad konfiguration (fönstret på ett mikrochip är vinkelrät mot fönstret i andra mikrochip); denna konfiguration underlättar inriktning av de två mikrochips ännu minskar också synfältet i elektronmikroskop. - Ta framsidan av locket provkammaren med pincett och vänd den upp och ned. Utan att vidröra mikrochips, placera den bakre sidan av locket på spetsen. Långsamt öppna pincett på ett sådant sätt att locket enbart vilar på den nedre grenen av pincett. Sänk försiktigt locket tills det vilar på de två mikrochips. Ta bort pincett.
- Kontrollera igen inriktningen av fönstren i båda mikrochips. Om det behövs, ta bort locket, justera placeringen av mikrochips, och placera locket igen.
- Placera skruvarna och fixera dem i sina vanliga platser. Kontrollera inriktningen av de två fönstren. jagf nödvändigt, ta bort skruvarna igen och justera mikrochips.
OBS: Fäst inte skruvarna för hårt, eftersom det kan orsaka skada. En vakuumtätning uppnås när skruvarna bara dra. - Kontrollera tätnings genom att initiera ett vätskeflöde genom systemet med användning av en flödeshastighet av 4 ml / min. Om ingen läcka observeras på ömse sidor om spetsen, är detta en bra indikation på vakuum täthet.
- Överför innehavaren till vakuumpumpen stationen och kontrollera vakuum täthet. Vakuumnivån bör nå åtminstone 10 -5 mbar inom 5 minuter av pumpning.
OBS: Det rekommenderas att testa pumpstation med en dummy hållare före användning. - Överför igar till elektronmikroskop i sin inhägnad för att förhindra det från att samla damm.
OBS: Varje kommersiell hållare kommer med ett hölje.
- Använd böjda pincett för att ta provet mikrochip på långsidan och placera den i spåret (pocket) i spetsen av vätskeflödet TEM hållare. Hålla SiN sidan vänd uppåt. Kontrollera korrekt placering av mikrochip i spåret med hjälp av en kikare ljusmikroskop.
3. STEM av en Specimen i Liquid
- Justering av elektronmikroskop för STEM OBS: Driften av elektronmikroskop som beskrivs i detta protokoll är baserad på standardförfaranden som kan hittas i bruksanvisningen. Protokollet beskriver erforderlig detalj bortom standardprocedurer för datainsamling på vätskeprover.
- Starta mikroskop med STEM läge i linje. I provhållaren, sätt ett testprov bestående av en tunn kolfilm med AuNPs. Justera inställningarna för STEM mikroskop enligt följande: ställ in sondströmmen till 0,18 nA och konvergenshalvvinkel av elektronstrålen till 20 mrad genom att välja en plats storlek 4C och målet öppning av 30 um. Välj en 8 cm kamera längd.
- Anteckna den angivna strömtätheten mätt vid fluorescens skärmen medan ADF detektorn införas. Ta bort preparathållaren.
OBS: Det behövs Detta nuvärde senare för att uppskatta tjocklek av vätskan. - Starta vätskeflödet med rent vatten. Inte överskrider ett flöde av 2mikroliter / min.
- Sätt vätskeflödet TEM hållare i elektronmikroskop och börja evakuering. Kontrollera både vakuum indikation på förvakuum kammaren och varaktigheten av evakuering. Om vakuumnivån är standard och varaktigheten av den pumpningsförfarandet inte överstiger den normala utrymningstiden (av omkring 1 min) med en faktor av två, för in hållaren.
- Öppna strålen ventilen när vakuumet i huvudprovkammaren är i området som gör att dess öppning. Sätt ADF detektorn genom att trycka på ADF-knappen.
OBS: Detta protokoll avser en ADF detektor placerad ovanför fosforskärmen för elektronmikroskop. - Ställ mikroskopet i kontinuerlig bildtagning läge med en bildstorlek på 512 x 512 pixlar, en pixel uppehållstid av 2 ps, och en förstoring av 20.000. Söka efter SiN fönster genom att översätta scenen i x- och y-riktningarna.
OBS: De mikrochips blockera elektroner som passerar genom provet mot upptäckaeller; signal är endast synlig vid platsen för SiN. Se figur 5. Ibland är det lättare att hitta den SiN fönster genom att titta på fluorescensskärmen. - När fönstret har befunnits, justera kontrast och ljusstyrka (med respektive vred) så att kanten på fönstret blir synligt. Flytta kanten mot mitten av synfältet genom att trycka på x- och y-translations knappar av preparatsteget. Tryck på återställningsknappen på objektivet.
OBS: Ljusstyrkan skall till stor del reduceras jämfört med ett vakuumprov på grund av en stark spridning i vätskan. - Fortsätt genom grov fokusera skarpt hörn vid kanten av SiN fönster genom att justera den vertikala positionen (z-translation) av provet scenen. Kontrollera att provposition är i eucentric höjd genom att vrida på scenen med 5 ° och vrida den tillbaka. Funktioner av provet och hörnet av SiN fönster ska inte flyttas vid låga förstoringar.
- Justera den vertikala positionen som behövs för att placera fönsterkanten i mitten av visningsområdet igen. Lagra positionen på scenen med hjälp av butiken knappen av programvaran.
- Flytta till en position där små bitar av skräp eller andra objekt med hög kontrast (t.ex. AuNPs) är närvarande genom att översätta scenen i x- och y-riktningarna. Justera fokus för objektivet så att alla objekt skarpa i fokus.
- Anteckna strömtätheten mätt på fosforskärmen synlig via operativprogrammet, vilket indikerar den överförda strömmen genom vätskehållaren och genom öppnandet av ADF detektorn. Beräkna tjockleken av vätske cellen med användning av ekvation 1. Fortsätt endast om vätsketjocklek har bestämts och inte överstiger 3 | j, m.
14
ekvation 1
med t Sin tjockleken hos det amorfa kiselnitrid-membran och t vatten tjockleken av vattenskiktet. Den genomsnittliga fria banlängder uppgår till l SiN = 0,79 um av SiN, = och l vatten = 3,0 pm av vatten för detektorn öppna halvvinkel på 35 mrad 14. - Noggrant observera vätskan vid lägre förstoringsgrader för att säkerställa att gasbubblor inte är närvarande. Gas bubblor kan förebyggas med hjälp av kontinuerlig vätskeflöde och sond ström lägre än 0. 5 nA.
- Översätta scenen i x- och y-riktningarna tills ett område med åtminstone 20 AuNPs has påträffats. Ställ in bildstorleken till 1024 x 1024 pixlar, pixel uppehållstid till 19 ps, och förstoringen till 400.000. Förvärva bilder av AuNPs anslutit sig till SiN membranet genom att trycka på förvärvs knappen.
OBS: När bilderna har erhållits i vilka AuNPs är synliga med stark kontrast och skarpa kanter (se figur 6), kan man vara säker på att experimentet är korrekt inställd. Vid oväntade problem uppstår, inte fortsätta med experimentet men se till att lösa orsaken.
- STEM av upplösningen av AuNPs
- Ta bort vätskeflödet TEM hållaren från mikroskopet och stoppa vätskeflödet.
- Förbereda minst 1 ml av en lösning av 0,1 M natriumklorid i HPLC-kvalitet vatten i en glasspruta.
- Justera flödessystemet till en hastighet av 20 | il / min och spola hela systemet flöde med 0,3 ml av saltlösning. Använd filterpapper för att samla upp vätskan matas ut påandra änden av slangen. Efteråt kan du justera flödessystemet till två mikroliter / min.
- Kontrollera integriteten av SiN fönstret med användning av ett binokulärt ljusmikroskop. Om inget läckage observeras, sätt i vätskeflödet TEM hållaren i mikroskop.
- Kontrollera vakuum indikation på pre-vakuumkammaren och varaktigheten av evakuering. Om vakuumnivån är standard och varaktigheten av den pumpningsförfarandet inte överstiger den normala utrymningstiden (av omkring 1 min) med en faktor av två, för in hållaren
- Flytta scenen baksidan av mikroskopet tillbaka till sin tidigare position med hjälp av lagrade scenen läget. Ställ mikroskopet i kontinuerlig bildtagning läge med en bildstorlek på 512 x 512 pixlar, en pixel uppehållstid av 2 ps, och en förstoring av 20.000. Justera kontrast, ljusstyrka, fokus och eucentric höjd, som beskrivs i steg 3.1.7-3.1.9.
- Hitta en plats av intresse genom att översätta scenen i x- och y-riktningarna. Ställ in bildstorlekentill 1024 x 1024 pixlar, pixel uppehållstid till 2 us, och förstoringen till 500.000. Spela in en serie av STEM bilder genom att manuellt trycka på förvärvsknappen en gång föregående bild har spelats in.
OBS: De AuNPs börja lösas upp så snart som elektronstrålen skannas över provet. Partiklar utanför det bestrålade området påverkas inte och kan observeras direkt efter. Tidstämpeln lagras i bildhuvudet. Det är också möjligt att använda programvara för automatisk insamling av en serie bilder till en film.
- Demontering och rengöring av TEM hållaren efter experimentet
- När vätskefasen TEM experiment avslutade och hållaren dras tillbaka från elektronmikroskop, rengör slangen, vätskekammaren och dess komponenter för att avlägsna eventuella fasta partiklar eller återstående salt som kan påverka framtida experiment.
- Lossa bakre skruven något så att det fortfarande är fasti sitt spår men locket kan enkelt tas bort. Lossa den främre skruven, ta bort den och placera den i en dammfri miljö.
- Ta av locket och placera den i dammfri miljö för förvaring.
- Ta bort de två mikrochips från fickan. Separera dem genom att doppa dem omsorgsfullt i vatten eller i den kvarvarande lösningen av experimentet. Placera mikrochips på mjukpapper med SiN membransidan uppåt och låt dem torka i luft för vidare analys.
- Ta bort O-ringarna och rengör respektive spår med HPLC-kvalitet vatten. Förvara O-ringar i en dammfri miljö.
- Använda en glasspruta (5 ml) för att spola alla slangar (ingång och utgång), var och en med 5 ml av HPLC-kvalitet vatten. Samla vätskan med en liten bägare placeras under TEM hållaren spets. Efter spolning, använd en pipett och / eller filterpapper för att avlägsna den återstående vätskan från vätskeutrymmet.
- Inspektera spetsen på TEM hållaren och ta bort rester som brutna kanterna av kiselmikrochips, fibrer eller damm. Om salt är fortfarande synliga, upprepa rengöringen. Avkastning O-ringarna till sina spår.
- Lagra TEM hållaren och dess komponenter i en dammfri miljö.
- Förfarande alternativ till 3,2: STEM rörliga guldnanopartiklar
OBS: Ett annat monteringsförfarande krävs för att studera rörelse AuNPs i vätska.- Hoppa över steg 1,2. Ladda AuNPs på kisel mikrochip omedelbart innan du sätter dem i TEM Holder i steg 2,2. Hålla provet täckt av ett vätskeskikt vid alla tidpunkter för att undvika en stark fastsättning av AuNPs till SiN membranet. De andra stegen i protokollet är desamma. En serie STEM bilder erhålls i steg 3.2.6.
ekvation 1 
Figur 4: Montering av vätskeflöde TEM Holder. (A) Den flytande kyvettutrymme med the mindre O-ring placerad i sitt spår. Den infällda bilden visar toppvyn. (B) Basen mikrochip placeras i respektive uttag. Den infällda bilden visar en sidovy i sådan vinkel att mikrochip är synlig från ljusreflektion. (CD) En droppe av lösningen tillsätts till mikrochipet. (EG) Placering av locket mikrochip. (HI) Placering av locket av den flytande cellavdelningen. (J) Fixering av locket med de två skruvarna. (K) Monterad vätskeflöde TEM hållare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Start Positionering och fokusering med STEM Mikro. (A) för att hitta SiN fönstret är scenen flyttas mot den ljus sigNal. Kisel mikrochip är tillräckligt tunn för vissa elektroner att passera genom nära fönstret. (B) kant fokuserade SiN fönster som visar några AuNPs förekommer ljus på den mörka (mindre spridning) SiN membranfönster. Kanten av mikrochip är ljus på grund av alltför spridning. (C) Fokusering sker vid hörnet av SiN fönster. Bilderna visar enligt fokuserade, i fokus, och över fokuserade situationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Vätskeflödet TEM hållare användes för att studera beteendet hos AuNPs i vätska. AuNPs stabilt immobiliserat på SiN membranet i rent vatten och avbildades med nanoskala upplösning med användning av flytande-fas STEM (Figur 6). Utmärkt kontrast erhölls på starkt spridande guld. Strömtätheten på fosforskärmen mätt för ett torrt prov var 20 pA / cm, medan den uppgick till 8 pA / cm med vätskeflödet TEM hållare införas. Användning av ekvation 1, t vatten = 2,4 ± 0,5 | j, m, mycket större än vad som förväntades baserat på distanstjocklek av 200 nm. Icke desto mindre, är tjockleken inte är alltför stor för att avbilda de AuNPs med nanometer rumslig upplösning. Den flytande tjocklek var tjockare än 200 nm bestäms av distans grund av utbuktning av Sin membran, icke-planhet av mikrochips och skräp som bor på mikrochips.
16, även om reaktiva radiolysprodukters (e - aq, H • H +, OH •) med ursprung från interaktionen mellan elektronstrålen med vatten kan oxidera enkla guld atomer, vilket leder till en förändring av formen på AuNPs 15. Men när systemet vätskeflödet användes för att införa kloridjoner i ett andra experiment, stabiliteten hos de AuNPs förändrats. Kloridjoner är i stånd att stabilisera oxiderade guld atomer i form av tetrachloroaureat, AuCl 4 -. Figur 7 visar att AuNPs lösta långsamt under en STEM imaging tidsförlopp serie, liknande resultat rapporterats tidigare 16. För den använda elektron dosering, tog det ~ 300 s för att lösa upp 30 nm-storlek AuNPs.
Rörelser AuNPs i wate r studerades i ett tredje experiment (figur 8). Före experimentet, var vätskeflödet TEM hållaren rengöras för att avlägsna alla spår av salt. Som skiljer sig från det första experimentet var en alternativ provberedning metod som används för att uppnå en svagare fastsättning av AuNPs till SiN membranet 14. I detta experiment var den AuNP lösning placerades på kisel mikrochip och monteras i vätskeflödet TEM hållaren utan att låta lösningen torka ut. På detta sätt, de AuNPs lätt lösgöras från SiN membranet vid avbildning vid dosen som används. Några av de AuNPs flyttas bort från synfältet in i bulklösningar, medan de återstående AuNPs förblev inom synfältet i nära anslutning till SiN-fönstret. Transport av dessa AuNPs observerades, och så småningom de agglomererade. Efter ett tag, dessa agglomerat fristående även från SiN membranet och flyttade ut ur synfältet och i lösningen.
ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 6: Scanning transmissionselektronmikroskopi (STEM) Micrograph av AuNPs 30 nm i diameter vid toppen av en rent vatten lager. Bilden som visas är ett valt område av den ursprungliga bilden. Bildstorleken var 1,024 x 1024 pixlar, tidspixeluppehålls var 19 ps, pixelstorleken var 0,73 nm, och förstoringen var 400,000X. Elektron dosen var således 7,1 x 10 4 e - / nm². Strömtätheten mätt på fosforskärmen var 8 pA / cm 2, så det flytande tjocklek beräknades uppgå till 2,4 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Time-lapse-serienstammikrofotografier av AuNPs i Saline. (AD) Bilder extraheras från tidsförlopp serie STEM bilder med 30 s intervaller. De AuNPs gradvis löser sig i vätskan som en följd av närvaron av kloridjoner. Pixel uppehållstid var 2 ^ s, ramtiden för time lapse serien var 1,75 s, pixelstorleken var 0,44 nm, och förstoringen var 500,000X. Elektron dos per bild var 1,2 x 10 4 e - / nm². Den flytande Tjockleken var 2,4 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: STEM mikroskop av AuNPs Moving i rent vatten. (A) SiN membran med AuNPs, varav flera är valda med pilar. (B) Förslag spårav de valda AuNPs (se A). Vissa AuNPs rör sig bort från synfältet under tiden för avbildning. De återstående AuNPs röra sig i sidled längs SiN membranet och börja att agglomerera. Vid en kritisk klusterstorlek, de sändningarna från membranet och röra sig bort från området view.The pixel uppehållstid var 1 ps, ramtiden var 0,52 s, pixelstorleken var 1,8 nm, och förstoringen var 120,000X. Elektron dos per bild var 3,5 x 10 2 e - / nm² och vätske tjocklek var 2,4 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det beskrivna protokollet möjliggör STEM av AuNPs i en vätska, innefattande observationen av dynamiska processer. Monteringen av innehavaren är en enkel att lära sig tekniken. Dock måste flera aspekter beaktas när man arbetar med vätskeflödet TEM hållare. Exempelvis kan brutna kanter av Si mikrochip eller stora partiklar på O-ringarna resulterar i läckage av den flytande cellen. Å andra sidan, stora partiklar (> 200 nm, t ex damm eller Si skräp) kan på SiN membranet resultera i en ökad tjocklek av den flytande cellen, vilket leder till en låg avbildning kontrast eller till en låg spatial upplösning och kan även orsaka SiN fönster att bryta. Viktigt kan rester av salt eller andra kemikalier påverka resultatet av experimenten på ett oönskat sätt. Därför är det viktigt att de olika stegen av provpreparering och hållarenheten utförs noggrant och i en ren och dammfri miljö.
Tjockleken av vätske cell bestämmer den uppnåbara upplösningen, såväl som kontrasten av de erhållna bilderna 17. Denna tjocklek kan justeras via distansorgan belägna på en av de två Si-mikrochips. Beroende på dimensionerna för provet, kan olika tjocklekar av den flytande cellen realiseras. För studier av AuNPs, är det möjligt att använda små distansorgan (200-500 nm), medan hela eukaryota celler behöver större distanser på upp till 5 ^ m. Tjockleken hos den flytande cellen påverkas vidare av utbuktning av de SiN membranfönster som resulterar från tryckskillnaden mellan vätskecellen och den omgivande vakuum. Denna effekt blir mer uttalad med större SiN membranfönster. Således, för att minimera tjockleken hos den flytande cell, är det rekommenderat att använda små SiN membran fönster. I fall det är svårt att hitta en överlappning mellan två små fönster, kan de monteras i en korsad konfiguration med hjälp av en annan bas mikrochip. Alternativa konfigurationer largely förhindra utbuktning och består av en monolitisk mikrochip 18 eller membranfönster stöds av pelare 19, men de uppvisar nackdelar när det gäller provbelastning. En av de mest utmanande aspekterna av den nuvarande tekniken är bristen på exakt kontroll över vätske tjocklek. Ofta är vätskan mycket tjockare än vad som förväntas av distans dimensioner som används, såsom visas här. Flera grupper använde slutna vätskekamrarna 4, 20, 21, 22; dessa system har vissa fördelar vad gäller spatial upplösning, som vätske tjocklek kan reduceras genom att inducera en bubbla i vätskan. Alternativt kan SiN fönstren tvingas att kollapsa, vilket leder till en tunnare vätskeskiktet. För det tredje finns höljet andra tunnare fönster (t.ex. grafen) 23, också resulterar i mycket tunnare vätskorän vad som är möjligt med det system som beskrivs i detta protokoll. Det är emellertid omöjligt att flöda vätskan i dessa system.
Som för alla med hög upplösning mikroskopi teknik måste ett antal experimentella aspekter beaktas. Den viktigaste aspekten är interaktionen av elektronstrålen med vätskan eller provet. Förutom strålningsskada, vilket begränsar den uppnåe rumsliga upplösningen för många fasta prover 24, är de flytande proverna påverkas även av elektronstrålegenererade radiolysprodukter 15, 25. Eftersom dessa produkter kan påverka experimentet noggranna tolkning av data och experimentell design är viktiga 26. Inställningarna mikroskop bör väljas i enlighet med målen för en viss studie. ADF STEM är mer kraftfull för avbildning nanopartiklar av ett högt atomnummer (Z) i större tjocklekar i den flytande cellen, while TEM ger bättre kontrast på låg-Z material och är typiskt snabbare men kräver tunnare vätskeskikt 3. Istället för att använda den automatiska dokumentmataren detektorn är Bright Field (BF) detektor används ibland för att avbilda flytande cellen, eftersom BF STEM är fördelaktig för att avbilda låg-Z material i tjocka lager 27. Med ökande tjocklek av vätske cell behövs mer aktuell. Detta ökar emellertid också koncentrationerna av radiolysprodukter och ökar strålningsskada. Det bör också noteras att en omkastning av kontrast observeras i ADF detektor för mycket tjocka vätskor (> 10 ^ m för vatten).
De flytande betingelser ändrades mellan våra experiment genom att ta bort hållaren från mikroskopet och utbyta både provet och vätskan. Förutom att ändra saltkoncentrationen, är det lätt möjligt att ändra andra egenskaper hos vätskan genom strömning i olika vätskor (t.ex. har enanvända buffertlösningar i syfte att skapa en viss pH 16 eller kan införa organiska lösningar eller andra tillsatser). Det är också möjligt att ändra vätskan medan hållaren fortfarande sitter i mikroskopet genom att flöda vätskor genom mikroflödessystem. Men i detta fall, är det okänt, vid vilken tidpunkt peka vätskan vid prov förändringar. Det är också värt att notera att mikrochips som stöder elektroderna är tillgängliga, så nanoelektrokemi experiment kan utföras 28.
Studieobjekten är inte begränsade till AuNPs i vatten, men kan studeras en stor mångfald av prover med användning av det protokoll som beskrivs ovan, innefattande kiseldioxid, titanoxid, och polymerer. Om rörelser föremålen är för snabbt för att fånga i en bild inom förvärvet kan viskositeten sänkas med en storleksordning genom att använda en blandning av 50% glycerol och 50% vatten.
Från ovanstående punkter,ett antal fördelar, möjligheter, och också nackdelar blivit uppenbart. När man arbetar med flytande fas STEM, de viktigaste nackdelarna att tänka på är att: 1) varje experiment påverkas av det dynamiska samspelet av elektronstrålen med hela provet (föremålet under observation, vätskan och SIN membran); 2) provhantering är omständlig, och det är ofta svårt att uppnå ett tunt vätskeskikt, eftersom provet eller de mikrochips innehåller vissa mikrometerstora partiklar; 3) vätske tjocklek skiljer sig vanligtvis till stor del från den avsedda tjockleken bestäms av distans; och 4) rumslig upplösning och skiljer sig starkt beroende av den vätskeformiga tjockleken och skillnaden mellan förändringen täthet hos ett föremål under observation och vätskan.
För närvarande finns det gott om metoder för mikroskopi av objekt i vätska med nanometer rumslig upplösning. Elektronmikroskopi i amorf is är en kraftfull teknik 29,men de inblandade experimentella procedurer är känsliga, inte alla experiment tillåter beredning av provet i is, och tidsupplösta experiment är omöjliga. Röntgenmikroskopi 30, kunde 31 i princip användas, men det har en begränsad rumslig upplösning och inte är allmänt tillgängliga i laboratorier. Atomkraftsmikroskopi i vätska har fastställts men är en yta teknik endast 32, 33, 34, 35. Ijusmikroskopi uppvisar inte tillräcklig rumslig upplösning. För närvarande, elektronmikroskopi i flytande verkar mest kraftfulla tekniken för direkt mikroskopi av nanoobjekt och processer i flytande.
Flytande fas TEM och STEM är ännu inte rutin analytiska tekniker men är fortfarande under utveckling. Antalet parametrar att ta hänsyn till är avsevärd, och det är often svårt att reproducera experimentella resultat. Dessutom är kvantitativa data svårt att erhålla eftersom effekterna är föremål för undersökningen är sammanflätade med processer som sker som ett resultat av elektronstrålen. Protokollet som beskrivs här syftar till att standardisera den experimentella protokollet, vari redovisning av alla relevanta base aspekter av experimentet. Vi hoppas att detta protokoll kommer att leda till bättre reproducerbarhet av experimentellt arbete i detta framväxande område.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular light microscope | Leica | M60 CMO | |
| Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector | JEOL | ARM200F | |
| Liquid flow TEM specimen holder | DENS Solutions | Ocean | |
| Microfluidic syringe pump | Harvard Scientific | PicoPlus | |
| Plasma cleaner | Gatan | Solarus950 | |
| Chemicals | |||
| Acetone, Rotisolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
| Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
| Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
| Materials | |||
| Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Microfluidic peek tubing | Upchurch Scientific | 1570 | |
| Plastic Replaceable tips Tweezers | |||
| (Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips) | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
| Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
| Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
| Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR) | Hamilton | 81323 | |
| Clean room tissue Sontara Micropure AP (224 x 224mm) | DuPont | Sontara MicroPure |
References
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
- Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
- Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
- Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
- de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
- Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
- Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
- Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
- de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
- Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
- Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
- Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
- Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
- Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
- Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
- Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346 (2004).
- Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
- Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
- Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
- Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
- Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
- Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
- Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
- Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
- Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).
