Summary
يصف هذا البروتوكول تشغيل حامل العينة تدفق السائل لمسح انتقال المجهر الإلكتروني من AuNPs في الماء، كما تستخدم لمراقبة العمليات الحيوية النانوية.
Abstract
عينات جزءا لا يتجزأ تماما في السائل يمكن دراستها في القرار المكانية النانو مع الضوئي نقل المجهر (STEM) باستخدام غرفة ميكروفلويديك تجميعها في حامل العينة لنقل المجهر الإلكتروني (تيم) وSTEM. ويتكون النظام ميكروفلويديك اثنين من رقائق السيليكون دعم رقيقة السيليكون نتريد (الخطيئة) نوافذ الغشاء. توضح هذه المقالة الخطوات الأساسية للعينة التحميل والحصول على البيانات. الأهم من ذلك كله هو ضمان أن تكون مقصورة السائلة يتم تجميعها بشكل صحيح، وبالتالي توفير طبقة السائل رقيقة وختم فراغ. ويشمل هذا البروتوكول أيضا عددا من الاختبارات اللازمة لأداء خلال تحميل عينة من أجل ضمان التجميع الصحيح. مرة واحدة يتم تحميل العينة في المجهر الإلكتروني، يحتاج إلى قياس سماكة السائل. قد يؤدي التجميع غير صحيح في السائل أيضا سميكة، في حين أن السائل أيضا رقيقة قد يشير إلى عدم وجود السائل، مثل عندما يتم تشكيل فقاعة. وأخيرا، فإن البروتوكوليشرح كيف يتم أخذ الصور وكيف عمليات ديناميكية يمكن دراستها. وتصوير عينة تحتوي على AuNPs على حد سواء في المياه النقية وفي المياه المالحة.
Introduction
التقليدية الضوئي نقل المجهر (STEM) يقتصر من قبل مجموعة من العينات المناسبة للتحليل، وتحديدا في العينات الجافة والصلبة مناسبة لوضعها في فراغ عالية. ومع ذلك، العديد من الأسئلة العلمية والتكنولوجية وتتعلق المواد والعمليات في البيئة السائلة النانوية. ويمكن الآن عينات جزءا لا يتجزأ تماما في السائل أن تدرس مع الجذعية باستخدام المفهوم الذي ينطوي على غرفة ميكروفلويديك تجميعها في حامل العينة لنقل المجهر الإلكتروني (تيم) وSTEM 1. وقد أصبحت هذه التقنية المطورة حديثا شعبية متزايدة، كما أنه يقدم رؤية جديدة في العمليات الهامة في مختلف الموضوعات البحثية، بما في ذلك النمو، وانحلال، وعمليات تجميع الجسيمات النانوية 2، 3، 4، 5، 6. لا المعادن فقط، ولكن أيضا biominerals 7 والنظم البيولوجية يمكن دراستها 8، 9، 10، 11. تحميل العينة والتقاط صور للمرحلة السائل STEM يختلف عن STEM العينات الجافة وتنطوي على البروتوكول الذي يتطلب تدريب خاصة.
ويتكون النظام ميكروفلويديك اثنين من رقائق السيليكون دعم السيليكون نتريد النوافذ (الخطيئة) غشاء شفافة لشعاع الالكترون على 200 كيلو من الطاقة 12 (انظر الشكل 1A). تفاصيل الأبعاد والتعامل مع هذه الرقائق يمكن العثور عليها في أي مكان آخر 12 و 13. عادة ما كانت العينة تحتوي على الأجسام النانوية. في هذه الورقة لاحظنا النانوية الذهبية (AuNPs). وثبتوا على AuNPs في الإطار العلوي (مع الاحترام لشعاع الإلكترون السفر إلى الأسفل) أو تطفو في LIQUهوية شخصية. يتم الحصول على قرار المكاني النانو في STEM عن طريق مسح شعاع الالكترون على AuNPs وجمع الإلكترونات المبعثرة التي تنتقل عن طريق استخدام حلقي الميدان الظلام (ADF) كاشف 9. يتم وضع الرقائق اثنين في فتحة صغيرة في طرف السائل حامل تدفق تيم 1 (حامل يعمل لكلا STEM وتيم ولكن يشار إليها على أنها حامل تيم). واحدة من الرقائق يحتوي على فاصل بحيث يتم تشكيل حجرة السائلة بين الرقائق. O-خواتم على كلا الجانبين من الرقائق اثنين توفر ختم فراغ المقصورة السائلة 13 (انظر الشكل 1B).
والهدف من هذه المقالة هو لشرح الخطوات الأساسية للعينة التحميل والحصول على البيانات بحيث يمكن للمستخدمين المهتمين قد تجد سهولة الوصول إلى هذه التقنية الجديدة الناشئة. ويستخدم النظام المتوفرة من شركة معينة، ولكن البروتوكول هو أيضا صالح لأنظمة الشركات الأخرى. هذه التقنية هيأكثر تعقيدا من تيم التقليدية والهندسة والرياضيات، وعدد من الجوانب العملية يجب مراعاتها عند العمل مع نظام حامل السائل 13. الأهم من ذلك كله هو ضمان أن تكون مقصورة السائلة يتم تجميعها بشكل صحيح، وبالتالي توفير طبقة السائل رقيقة وختم فراغ. وبالتالي، فمن المهم للغاية للعمل نظيفة ومنع تشكيل الغبار أثناء إعداد وتجميع حامل تدفق تيم السائل. على وجه الخصوص، في حاجة إلى حلقات يا والرقائق السيليكون اثنان في أن يكون حرا من كل تلوث. حتى جزيئات صغيرة من الغبار على واحدة من الرقائق قد تزيد بشدة من سمك الخلية تجميعها، والتي قد تحول دون تحقيق القرار المكانية مفيد. وختم فراغ من الأهمية بمكان بحيث لا تلوث أو الضرر سيترك في المجهر الإلكتروني بعد التجربة. يصف هذا البروتوكول إجراء التحميل والعديد من الاختبارات اللازمة. تشغيل المجهر الالكتروني واضح ومباشر، بور أنها تتطلب بعض الخطوات الإضافية مقارنة المجهري لعينات الصلبة. مع زيادة سمك السائلة، يتم امتصاص المزيد من الإلكترونات ومتفرقة عن طريق السائل. قياس سماكة السائل أمر ضروري. وأخيرا، يوضح البروتوكول كيف يتم أخذ الصور وكيف عمليات ديناميكية يمكن دراستها.
الشكل 1: السائل خلية تدفق لالضوئي نقل المجهر (STEM). (أ) توضيح تخطيطي لخلية السائلة تجميعها. يتم وضع اثنين من رقائق السيليكون مع السيليكون نتريد (الخطيئة) نوافذ الغشاء بين اثنين من الحلقات. ومرفق طيه السائل بين الغشاء الخطيئة وبالتالي فصلها عن فراغ في المجهر الإلكتروني. وتركز مسح شعاع الالكترون على عينة. يتم الحصول على النقيض من الإلكترونات متناثرة. ويجمد جزيئات الذهب (AuNPs) داخل السائل في الغشاء الخطيئة ولكن يمكن أيضا أن تتحرك فيالسائل. (ب) تخطيطي عرض الجانب المقطع العرضي كومة من اثنين من رقائق مع الحلقات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
الشكل 2: إجراء تنظيف والرقائق سي. تمتلئ (A) اثنين من الأكواب مع 40-60 مل من الأسيتون والايثانول لكل منهما. توضع رقائق (ب) سي في كوب مملوء الأسيتون. الجانب مع غشاء الخطيئة يجب ان يواجه صعودا. انعكاس اثنين من رقائق سي يظهر بوضوح في أخدود على مساعدات من اثنين من الرقائق. (C) بعد 2 دقيقة، يتم نقل الرقائق سي إلى الدورق الثاني مليئة الايثانول. بعد 2 دقيقة أخرى، يتم نقل الرقائق سي إلى الأنسجة غرف الأبحاث للتجفيف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تدفق السائل نقل الكترون هيئة التصنيع العسكريroscopy (تيم) حامل المعدات. (أ) حامل تدفق تيم السائل مع أنابيب بلاستيكية وحقنة لتدفق السائل. (ب) غيض من صاحب تدفق تيم السائل إزالة من حامل رمح، وغطاء مقصورة السائلة الخلايا والحلقات، واثنين من رقائق السيليكون. أنابيب يبرز من الجانب الأيسر من طرف. (ج) حجرة خلية السائل تظهر واحدة يا الدائري، وفتحة لوضع رقاقة. (D) ملاقط مختلفة على سطح خالية من الغبار (رقائق الألومنيوم). (E) وغطاء مقصورة خلية السائل مع لO-الحلقتين. (F) اثنين من رقائق السيليكون مع ويندوز غشاء الخطيئة. اليسار: رقاقة عينة من دون فاصل. الحق: غطاء رقاقة مع فاصل 200 ميكرون. (G) نظام مضخة ميكروفلويديك. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا فيقوإعادة.
1. إعداد الرقائق
1. تنظيف والرقائق
- إعداد مساحة العمل مع مستوى الغبار انخفاض في غطاء الصفحي تدفق الهواء مع فلتر الغبار الجسيمات.
- تنظيف شريحة المجهر والزجاج الخفيفة بمنديل خالية من الألياف والإيثانول النقي لالتنسيب والنقل من الرقائق. وضع شريحة زجاجية على النسيج غرف الأبحاث في طبق بيتري.
ملاحظة: تجنب استخدام الايثانول الفني في جميع الأوقات. - اختيار 5 الرقائق قاعدة (بدون فاصل) لعينة التنسيب و5 الرقائق مع فاصل 200 نانومتر سميكة.
ملاحظة: أبعاد نافذة هي 20 × 400 ميكرون (2) وسمك الخطيئة هو 50 نانومتر. ولما كان هناك بعض التسامح من أبعاد، فمن المستحسن للتحقق من أبعاد باستخدام المجهر الضوئي. - استخدام ملاقط الكربون المغلفة لإزالة الرقائق من صندوق التخزين ووضعها على شريحة زجاجية. الاستيلاء على الرقائق بحزم ولكن بعناية على لو بهمالجانبين نانوغرام. التعامل مع رقاقة مثل أن الجانب غشاء الخطيئة يواجه دائما نحو الأعلى.
ملاحظة: تجنب لمس الغشاء الخطيئة الهش على الجانب العلوي. أيضا كن حذرا من التعامل مع رقائق لتجنب تكسير حوافها حادة، الذي يمكن أن يسبب مشاكل بسبب جزيئات السيليكون المقيمين على رقاقة أو التسرب في وقت لاحق.
ملاحظة: تدريب لإجراء العملية لإزالة الرقائق من سطح لزجة لا يمكن أن يؤديها على (رخيصة) الرقائق وهمية. - وضع الرقائق على نسيج غرف الأبحاث في طبق بتري. إغلاق طبق وتحويلها إلى غطاء الدخان.
يتم تنفيذ الخطوات التي تنطوي على الأسيتون في غطاء الدخان للسلامة الكيميائية: ملاحظة. - يستغرق عامين 120 مل الأكواب الزجاجية. شطف كوب واحد مع الأسيتون والآخر مع الإيثانول لتنظيفها. شغل أول واحد مع 40-60 مل من الاسيتون والآخر مع 40-60 مل من الايثانول.
ملاحظة: من المهم استخدام سوائل HPLC الصف أيضا لهذه الخطوة في البروتوكول. - تحويلوالرقائق في الكأس مع الأسيتون لإزالة الحماية تقاوم طبقة. تحرك بلطف الكأس باليد لشطف بشكل فعال الرقائق، ولكن يجب الحرص على عدم تحويل الرقائق رأسا على عقب - انظر الشكل 2.
- بعد 2 دقيقة، وإزالة الرقائق وبسرعة نقلها إلى الدورق مع الايثانول. تحرك بلطف الكأس باليد مع الإيثانول لمدة 2 دقيقة لإزالة أي بقايا للمقاومة الطبقة. تغطية كأس برقائق الألومنيوم وتحويلها إلى طاولة العمل الصفحي تدفق الهواء.
ملاحظة: لا تدع الرقائق تجف خلال نقل لتجنب ترسب الحطام. - إزالة الرقائق من الكأس ووضعها على نسيج غرف الأبحاث الجديدة. السماح لهم الجافة لبضع دقائق ونقل الرقائق على شريحة المجهر والزجاج الخفيفة في طبق بيتري.
ملاحظة: يمكن للرقائق الرطب الوجه بسهولة حولها، وتتحول رأسا على عقب، أو التمسك ملاقط عند إطلاق سراحهم. ويمكن تجنب ذلك عن طريق بريهغناء الرقائق بهدوء على ورقة الترشيح وسحب ملاقط بعيدا في الاتجاه الأفقي. - إغلاق طبق بتري ونقل الرقائق إلى نظافة البلازما.
- وضع شريحة زجاجية مع رقائق في نظافة البلازما. تشغيل برنامج التنظيف 5 دقائق لجعل سطح الغشاء محبة للماء نيتريد السيليكون وإزالة المواد الهيدروكربونية.
ملاحظة: إعدادات مناسبة بطلب للحصول على نظافة البلازما لدينا هي: 70 mTorr، تدفق الغاز من 11.5 SCCM لO 2 و 35.0 SCCM لهارون، 50 W إلى الأمام ترددات الراديو (RF) هدف، 5 W نطاق الترددات اللاسلكية، والحد الأقصى يعكس RF. أي البلازما قادرة على إحداث تهمة سطح مناسب. - وضع شريحة زجاجية مع رقاقة مرة أخرى في طبق بتري، إغلاق الغطاء، وتحويلها إلى ضوء المجهر.
- دراسة الرقائق تحت المجهر الخفيف لتمزقات غشاء المحتملة أو جزيئات الأوساخ المتبقية. عناية خاصة مع المناطق النافذة والتحقق من وجود بقع صغيرة تشير عupture من الغشاء. رفض الرقائق مع الأغشية التالفة.
- إغلاق طبق بتري وتخزينه في طاولة العمل الصفحي تدفق الهواء.
2. إعداد العينة على الرقائق
- يعد حل AuNP مائي (استقرت سيترات) عن طريق خلط كميات صغيرة من الحلول الأسهم تحتوي على 30 نانومتر القطر، AuNPs استقرت سترات بتركيز ~ 3 م.
- وضع الرقائق على سطح نظيف، لزجة في مربع نقل عن قطرة التطبيق / عينة الترسيب.
- وضع قطرة (1-2 ميكرولتر) من محلول العينة على الجانب غشاء خطيئة رقاقة تنظيفها بلازما طازجة (استخدام رقاقة من دون فاصل)، واسمحوا الجافة الحل في طاولة العمل الصفحي تدفق الهواء.
ملاحظة: يمكن أن يتكرر هذا الإجراء من أجل زيادة تركيز AuNPs على الغشاء الخطيئة. - تطبيق 1 ميليلتر من الماء منزوع الأيونات إلى رقاقة لإزالة الملح و / أو السطحي. بعد 30 ثانية، بعنايةإزالة قطرات من الماء مع ورق الترشيح. دع الرقائق تجف في الهواء في طاولة العمل الصفحي تدفق الهواء.
ملاحظة: وهناك عدد كبير بما فيه الكفاية من AuNPs انضمت إلى رقاقة ولن جرفت في الماء بعد الآن. - استخدام الرقائق عينة مستعدة في 4 ساعات، كما يفقد الخطيئة خصائص سطح المقدمة ماء على مر الزمن، والتي قد تسبب السائل تتصرف بشكل مختلف خلال التجربة. ملاحظة: يرجى الرجوع إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل.
- استخدام مربع نقل مغلقة لتخزين ونقل الرقائق.
2. إعداد حامل تدفق السائل تيم
- تنظيف حامل تيم تدفق السائل
- تنظيف جميع الأدوات (ملاقط وسائق المسمار) التي من شأنها أن تكون على اتصال مع أجزاء فراغ باستخدام الأسيتون والايثانول في حمام بالموجات فوق الصوتية ووضعها على سطح خالية من الغبار التي تقدمها قطعة من رقائق الألومنيوم الجديد وضعت على مقاعد البدلاء العمل. العمل مع قفازاتلتجنب التلوث من صاحب تدفق تيم السائل.
ملاحظة: أدوات لا بد من تنظيفها على نطاق واسع إذا كان أحد من المؤكد أن تكون نظيفة للعمل مع أجزاء فراغ. قفازات يمكن تجنبها لو واحد هو قادرة على التعامل مع المعدات دون لمس أجزاء فراغ. - وضع حامل تدفق تيم السائل تحت المجهر ضوء مجهر في مثل هذه الطريقة التي غيض من صاحب تحتوي على غرفة السائلة يمكن ملاحظتها. انظر الشكل 3.
- إزالة الغطاء من طرف صاحب ووضعه على سطح خالية من الغبار.
ملاحظة: غطاء التيتانيوم حساسة للخدوش التي تسببها أصعب المواد مثل ملاقط. فمن المستحسن استخدام ملاقط المغلفة البوليمر للمواد الحساسة. - إعداد على الأقل 1-2 مل من الماء النقي (HPLC الصف).
ملاحظة: إذا كان أحد لا تستخدم HPLC الصف السائل، ثم فمن المستحسن للتحقق من أن السوائل المستخدمة لا تحتوي على جزيئات متناهية الصغر التي يمكن ان تؤدي الى انسداد في نظام التدفق. FILTإيه السائل حسب الحاجة مع فلتر المسام الدقيقة. - استخدام حقنة زجاجية (1 مل) لطرد نظام تدفق كله مع 0.5 مل من الماء النقي. فمن المستحسن استخدام نظام ضخ حقنة ميكروفلويديك. استخدام ماصة و / أو ورق الترشيح لإزالة السائل طرده في المقصورة الخلية السائلة. اختبار جميع الأنابيب لتدفق السائل. تجفيف طرف حامل بعد ذلك باستخدام ورق الترشيح و / أو ماصة.
- استخدام المجهر الضوئي للتأكد من أن غيض من صاحب نظيف وجاف. إذا لزم الأمر، وغسل غيض من حامل مع الماء أو الإيثانول لإزالة أي مخلفات الصلبة التي قد تكون خلفها حل المجففة. إزالة قطعة من الغبار أو بقايا من الألياف أيضا. إزالة بعناية هذه القطع مع ملاقط، وبالتالي تجنب خدش سطح التيتانيوم. تحقق أيضا داخل الأخاديد يا الدائري وإزالة بقايا السائل مع قطعة صغيرة من نسيج غرف الأبحاث.
ملاحظة: إذا لم يكن صاحب تصبح نظيفة مع هذا الإجراء، ثم فمن المستحسنلإزالة غيض من صاحب وتنظيفه في الأسيتون لمدة 2 دقيقة وفي الإيثانول لمدة 2 دقيقة أخرى باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية. - تفتيش جميع أجزاء أخرى من طرف (O-حلقات، غطاء، ومسامير) تحت المجهر الضوئي وإزالة الغبار والألياف، الخ ...
ملاحظة: أحيانا، قطع صغيرة تنشأ من مسامير أو الرقائق سي يجب إزالة كذلك. إذا لزم الأمر، وتنظيف لفترة وجيزة على أجزاء فراغ مع الإيثانول HPLC الصف. ويمكن تنظيف الغطاء ومسامير باستخدام الموجات فوق الصوتية، كما أوضح للمعلومات. تجنب وضع الحلقات في كثير من الأحيان في الإيثانول، كما أنها قد تجعل حلقات يا هشة مع مرور الوقت، وتناقص ضيق فراغ بهم. ويتم تشغيل النظام دون الشحوم فراغ، ولكن في حالة حدوث مشاكل ختم فراغ الشحوم يمكن استخدامها. - أعد حلقات O في الأخاديد كل من حامل وتأكد من أنها تناسب ولا تبرز في أي جانب من الأخدود.
- حافظ على حامل تيم تدفق السائل خالية من الغبار حتى تحميل عينة (على سبيل المثال.، بتغطيته بورق الألمنيوم).
- تنظيف جميع الأدوات (ملاقط وسائق المسمار) التي من شأنها أن تكون على اتصال مع أجزاء فراغ باستخدام الأسيتون والايثانول في حمام بالموجات فوق الصوتية ووضعها على سطح خالية من الغبار التي تقدمها قطعة من رقائق الألومنيوم الجديد وضعت على مقاعد البدلاء العمل. العمل مع قفازاتلتجنب التلوث من صاحب تدفق تيم السائل.
- تجميع حامل تيم تدفق السائل
ملاحظة: يصف الإجراء التالي الإجراء تحميل الرقائق في حامل العينة مع التوجه الأمثل لSTEM. في هذا التكوين، فإن رقاقة قاعدة مع العينة أن يكون رقاقة العليا مرة واحدة نقلها إلى المجهر. انظر الشكل 4. لتيم، ويتم الحصول على أعلى دقة المكاني في الجزء السفلي من الخلية السائلة فيما يتعلق شعاع الالكترون النزولي-السفر. وبالتالي، فإن الرقائق يتم تنظيمها على العكس من ذلك.- استخدام ملاقط منحنية للاستيلاء على رقاقة عينة على الجانب البعيد ووضعه داخل فتحة (جيب) في طرف صاحب تدفق تيم السائل. حافظ على الجانب الخطيئة التي تواجه صعودا. تحقق من موضع الصحيح للرقاقة في الفتحة باستخدام مجهر ضوء مجهر.
ملاحظة: إذا لم يتم وضع خاتم O دون رقاقة بشكل صحيح، ورقاقة قد تبرز وROM الفتحة. - وضع قطرة من 0.3 ميكرولتر من السائل المصفى للتجربة على رقاقة عينة باستخدام micropipette. إذا لزم الأمر، وتحديد الرقائق الدقيقة في المكان مع ملاقط، والقوات الشعرية الحبرية قد سحب رقاقة من جيبها.
- استخدام ملاقط رأسا على عقب منحنية لاتخاذ رقاقة الثانية (واحد مع طبقة هل). بدوره بعناية رقاقة رأسا على عقب. وضع رقاقة هل على رقاقة قاعدة في الفتحة.
ملاحظة: يحتاج هذا الإجراء إلى أن يتم بسرعة بما فيه الكفاية لتجنب جفاف الحبرية على رقاقة العينة. - تفقد وضع الصحيح باستخدام المجهر ضوء مجهر بينما تتحرك قطعة من المواد التي تعكس الضوء أدناه غيض من صاحب العينة. يجب أن تكون محاذاة كل من الرقائق بالضبط موازية لتحقيق أفضل تداخل النوافذ الخطيئة.
ملاحظة: في حالة النوافذ لا تتداخل، والرقائق يمكن تعديل أوضاعها عن طريق دفع في جانب واحد مع طرف منملاقط، ولكن تجنب تحريك الرقائق كثيرا، كما يمكن أن تتلف غشاء الخطيئة بسهولة. بعض الرقائق تأتي مع تكوين عبرت (نافذة رقاقة واحدة هو عمودي على نافذة في رقاقة أخرى)؛ هذا التكوين يسهل المواءمة بين رقائق اثنين بعد أيضا يقلل من مجال الرؤية في المجهر الإلكتروني. - أخذ الجانب الأمامي من غطاء غرفة عينة مع ملاقط وتحويلها رأسا على عقب. دون لمس الرقائق، ووضع الجانب الخلفي من غطاء على طرف. ببطء فتح ملاقط في مثل هذه الطريقة التي غطاء يرتكز فقط على فرع السفلي من ملاقط. خفض بعناية الغطاء حتى يستقر على الرقائق اثنين. إزالة ملاقط.
- إعادة فحص محاذاة النوافذ كل من الرقائق. إذا لزم الأمر، وإزالة الغطاء، وضبط المواقع من الرقائق، ووضع غطاء مرة أخرى.
- وضع مسامير واصلاحها في الأماكن المعتادة. تحقق المواءمة بين الإطارين. أناو لزم الأمر، إزالة مسامير من جديد وضبط الرقائق.
ملاحظة: لا إصلاح مسامير محكم جدا، لأن هذا قد يسبب الضرر. ويتحقق ختم فراغ عندما الخناق تشديد فقط. - تحقق الختم من قبل بدء تدفق السائل من خلال نظام باستخدام معدل تدفق 4 ميكرولتر / دقيقة. إذا لوحظ أي تسرب على جانبي الحافة، وهذا يعتبر مؤشرا جيدا لضيق فراغ.
- نقل صاحب لمحطة ضخ فراغ والتحقق من ضيق فراغ. مستوى فراغ ينبغي أن تصل إلى 10 -5 ما لا يقل عن مليبار خلال 5 دقائق من الضخ.
ملاحظة: من المستحسن لاختبار محطة ضخ مع حامل وهمية قبل الاستخدام. - نقل صاحب لالمجهر الالكتروني في الضميمة لمنعها من جمع الغبار.
ملاحظة: كل حامل التجاري يأتي مع العلبة.
- استخدام ملاقط منحنية للاستيلاء على رقاقة عينة على الجانب البعيد ووضعه داخل فتحة (جيب) في طرف صاحب تدفق تيم السائل. حافظ على الجانب الخطيئة التي تواجه صعودا. تحقق من موضع الصحيح للرقاقة في الفتحة باستخدام مجهر ضوء مجهر.
3. STEM من العينة في السائل
- ضبط المجهر الالكتروني لSTEM ملاحظة: تشغيل المجهر الالكتروني الموصوفة في هذا البروتوكول على أساس الإجراءات القياسية التي يمكن العثور عليها في دليل المستخدم. يصف بروتوكول التفاصيل المطلوبة وراء إجراءات موحدة للحصول على البيانات على عينات السائل.
- بدء تشغيل المجهر مع وضع STEM الانحياز. في حامل العينة، اضافة الى وجود عينة الاختبار يتكون من فيلم الكربون رقيقة مع AuNPs. ضبط إعدادات المجهر STEM على النحو التالي: تعيين التحقيق الحالي إلى 0.18 غ والتقارب شبه زاوية شعاع الإلكترون إلى 20 مراد عن طريق اختيار حجم البقعة من 4C وفتحة موضوعية من 30 ميكرون. تحديد طول كاميرا 8 سم.
- جعل علما كثافة التيار أشار قياس في شاشة مضان بينما يتم إدخال كشف ADF. إزالة حامل العينة.
ملاحظة: هناك حاجة إلى هذه القيمة الحالية في وقت لاحق لتقدير سمك السائل. - بدء تدفق السائل مع الماء النقي. لا تتجاوز تدفق من 2ميكرولتر / دقيقة.
- تضاف حامل تدفق تيم السائل في المجهر الإلكتروني والبدء في إخلاء. تحقق كلا من مؤشر فراغ الغرفة prevacuum ومدة الإخلاء. إذا كان مستوى الفراغ هو المعيار ومدة الإجراء الضخ لا تتجاوز الساعة إخلاء العادي (حوالي 1 دقيقة) من قبل عامل من اثنين، تضاف حامل.
- فتح صمام الشعاع عند الفراغ من حجرة العينة الرئيسية هي في النطاق الذي يسمح افتتاحه. إدراج كاشف ADF عن طريق الضغط على زر ADF.
ملاحظة: هذا البروتوكول يشير إلى كشف ADF وضعه فوق الشاشة الفوسفور من المجهر الالكتروني. - تعيين المجهر في وضع التقاط صور المستمر باستخدام حجم الصورة 512 × 512 بكسل، وهو وقت بكسل يسكن من 2 ميكرو ثانية، والتكبير من 20000. بحث عن نافذة الخطيئة بترجمة المرحلة في العاشر والاتجاهات ذ.
ملاحظة: إن الرقائق كتلة أي الالكترونات التي تمر عبر العينة نحو الكشف عنأو؛ إشارة غير مرئية فقط في الموقع من الخطيئة. انظر الشكل 5. في بعض الأحيان، يكون من الأسهل العثور على نافذة الخطيئة عن طريق عرض شاشة مضان. - مرة واحدة وقد تم العثور على النافذة، وضبط إعدادات التباين والسطوع (باستخدام المقابض منها) بحيث حافة النافذة تصبح مرئية. نقل حافة نحو منتصف مجال الرؤية عن طريق الضغط على X- وذ الترجمة أزرار للمرحلة العينة. اضغط على زر إعادة الضبط من العدسة الشيئية.
ملاحظة: يجب أن يتم خفض سطوع إلى حد كبير مقارنة على عينة فراغ بسبب تشتت قوي في السائل. - المضي قدما من خلال التركيز الخشنة الزاوية الحادة على حافة النافذة الخطيئة عن طريق ضبط الوضع الرأسي (ض الترجمة) للمرحلة العينة. تحقق من أن موقف العينة في ذروة eucentric عن طريق تناوب المرحلة من 5 درجات وتناوب مرة أخرى. ملامح من عينة وركن من نافذة الخطيئة لا ينبغي أن يتحول في تكبير منخفضة.
- إعادة ضبط الوضع الرأسي حسب الحاجة لوضع حافة النافذة في منتصف مساحة العرض مرة أخرى. تخزين موقف المرحلة باستخدام زر للبرنامج وتخزينها.
- الانتقال إلى الموضع الذي قطع صغيرة من الحطام أو غيرها من الأشياء من التباين العالي (على سبيل المثال، AuNPs) موجودة بترجمة المرحلة في العاشر والاتجاهات ذ. ضبط بؤرة العدسة موضوعية حتى يتسنى لجميع الأشياء تبدو حادة في التركيز.
- جعل علما الكثافة الحالية قياس في شاشة الفوسفور واضحة من خلال برنامج التشغيل، مما يدل على تنتقل الحالية من خلال حامل السائل وخلال الجلسة الافتتاحية للكشف عن ADF. حساب سمك الخلية السائلة باستخدام المعادلة 1. المضي قدما إلا إذا تم تحديد سماكة السائل ولا يتجاوز 3 ميكرون.
14
المعادلة 1
مع تي الخطيئة سمك غير متبلور غشاء نيتريد السيليكون والماء ر سمك طبقة المياه. متوسط المسار الحر أطوال تصل إلى حد ل الخطيئة = 0.79 ميكرون من الخطيئة، و= لتر ماء = 3.0 ميكرون من المياه للكشف عن فتح شبه زاوية من 35 مراد 14. - بعناية مراقبة السائل في تكبير السفلى لضمان فقاعات الغاز ليست موجودة. ويمكن منع فقاعات الغاز باستخدام تدفق السائل المستمر وتحقيق الحالية أقل من 0. 5 غ.
- ترجمة المرحلة في العاشر والاتجاهات ذ حتى منطقة تحتوي على 20 على الأقل AuNPs هكتارالصورة تم العثور عليها. ضبط حجم الصورة إلى 1024 X 1024 بكسل، وهي المرة بكسل يسكن إلى 19 ميكرو ثانية، والتكبير إلى 400،000. الحصول على صور من AuNPs انضمت إلى غشاء الخطيئة عن طريق الضغط على زر الشراء.
ملاحظة: مرة واحدة وقد تم الحصول على الصور التي وAuNPs مرئية مع تباين قوي والحواف الحادة (انظر الشكل 6)، ويمكن للمرء أن يكون على يقين من أن التجربة تم تعيين بشكل صحيح حتى. في حالة حدوث مشاكل غير متوقعة، لا المضي قدما في التجربة ولكن التأكد من حل هذه القضية.
- STEM من حل AuNPs
- إزالة حامل تدفق تيم السائل من المجهر ووقف تدفق السائل.
- إعداد لا يقل عن 1 مل من محلول 0.1 M من كلوريد الصوديوم في الماء HPLC الصف في حقنة زجاجية.
- ضبط نظام التدفق إلى سرعة 20 ميكرولتر / دقيقة، وتدفق نظام تدفق كله مع 0.3 مل من محلول ملحي. استخدام ورق الترشيح لجمع السائل طرده علىالطرف الآخر من الأنبوب. بعد ذلك، إعادة ضبط نظام التدفق إلى 2 ميكرولتر / دقيقة.
- التحقق من سلامة الإطار الخطيئة باستخدام المجهر الضوئي مجهر. إذا لوحظ أي تسرب، أعد حامل تدفق تيم السائل إلى المجهر.
- تحقق إشارة فراغ الغرفة قبل الفراغ ومدة الإخلاء. إذا كان مستوى الفراغ هو المعيار ومدة الإجراء ضخ لا يتجاوز وقت إخلاء العادي (حوالي 1 دقيقة) من قبل عامل من اثنين، تضاف حامل
- حرك الجزء الخلفي مرحلة من مراحل المجهر إلى وضعها السابق باستخدام موقف المرحلة المخزنة. تعيين المجهر في وضع التقاط صور المستمر باستخدام حجم الصورة 512 × 512 بكسل، وهو وقت بكسل يسكن من 2 ميكرو ثانية، والتكبير من 20،000X. ضبط التباين والسطوع، والتركيز، وارتفاع eucentric، كما هو موضح في الخطوات 3.1.7-3.1.9.
- العثور على موقع مصلحة بترجمة المرحلة في العاشر والاتجاهات ذ. ضبط حجم الصورةإلى 1024 X 1024 بكسل، وهي المرة بكسل يسكن إلى 2 ميكرو ثانية، والتكبير إلى 500،000. تسجيل سلسلة من الصور STEM عن طريق الضغط على زر الشراء يدويا مرة واحدة وقد تم تسجيل الصورة السابقة.
ملاحظة: إن AuNPs تبدأ بحل بمجرد تفحص شعاع الالكترون على عينة. الجسيمات خارج المنطقة المعرضة للإشعاع ليست المتضررة ويمكن ملاحظة على الفور بعد. يتم تخزين الطابع الزمني في رأس الصورة. ومن الممكن أيضا استخدام البرمجيات لجمع الآلي من سلسلة من الصور إلى فيلم.
- تفكيك وتنظيف حامل تيم بعد التجربة
- عندما يتم الانتهاء من التجارب تيم المرحلة السائلة وتراجع حامل من المجهر الالكتروني، وتنظيف أنابيب، غرفة السائلة، ومكوناته من أجل إزالة أي جزيئات صلبة أو بقايا الملح العالق التي قد تؤثر التجارب المستقبلية.
- قم بفك المسمار الخلفي قليلا بحيث انها لا تزال ثابتةفي فتحة ولكن الغطاء يمكن إزالتها بسهولة. قم بفك المسمار الأمامي، إزالته، ووضعه في بيئة خالية من الغبار.
- إزالة الغطاء ووضعه في بيئة خالية من الغبار للتخزين.
- إزالة الرقائق اثنين من جيب. تفصلهم عن طريق غمس فيها بعناية في الماء أو في حل ما تبقى من هذه التجربة. وضع الرقائق على المناديل الورقية مع الجانب غشاء الخطيئة أعلى والسماح لهم الجافة في الهواء لمزيد من التحليل.
- إزالة الحلقات وتنظيف الأخاديد منها مع الماء HPLC الصف. تخزين حلقات O في بيئة خالية من الغبار.
- استخدام حقنة زجاجية (5 مل) لطرد جميع أنابيب (المدخلات والمخرجات)، مع كل 5 مل من الماء HPLC الصف. جمع السائل مع كوب صغير يوضع تحت طرف صاحب تيم. بعد التنظيف، واستخدام ماصة و / أو ورق الترشيح لإزالة السائل المتبقي من مقصورة السائلة.
- تفقد غيض من صاحب تيم وإزالة المخلفات مثل حواف كسر من الدقيقة السيليكونرقائق، والألياف، أو الغبار. إذا الملح لا تزال واضحة، كرر إجراء التنظيف. إعادة الحلقات إلى الأخاديد الخاصة بهم.
- تخزين حامل تيم ومكوناته في بيئة خالية من الغبار.
- بديل الإجراء إلى 3.2: STEM الانتقال جزيئات الذهب
ملاحظة: مطلوب إجراءات التجميع مختلفة لدراسة حركة AuNPs في السائل.- حذف الخطوة 1.2. تحميل AuNPs على رقاقة السيليكون مباشرة قبل إدراجها في حامل تيم في الخطوة 2.2. نأخذ عينة من طبقة سائلة في جميع الأوقات تغطيتها من أجل تجنب بارتباط قوي من AuNPs إلى غشاء الخطيئة. الخطوات الأخرى من البروتوكول هي نفسها. يتم الحصول على سلسلة من الصور STEM في الخطوة 3.2.6.
المعادلة 1 
الشكل 4: تجميع حامل تدفق السائل تيم. (A) ومقصورة الخلية السائلة مع الالبريد أصغر وضعت في أخدود لها يا الدائري. يظهر أقحم في رأي كبار. يتم وضع (ب) رقاقة قاعدة في المقبس منها. يظهر أقحم عرض الجانب في هذه الزاوية أن رقاقة مرئيا من انعكاس الضوء. (CD) وتضاف قطرة من حل رقاقة. (EG) التنسيب للغطاء رقاقة. (مرحبا) موضع غطاء مقصورة الخلية السائلة. (J) التثبيت من الغطاء مع المسمارين. (K) تجمع السائل حامل تدفق تيم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (5): لتحديد المواقع الأولي والتركيز باستخدام الميكروسكوب STEM. (A) لتحديد موقع نافذة الخطيئة، يتم نقل مرحلة نحو ألمع سيجنال. رقاقة السيليكون رقيقة بما فيه الكفاية لبعض الإلكترونات بالمرور بالقرب من النافذة. (ب) على حافة النافذة الخطيئة تركيزا تظهر بعض AuNPs تظهر مشرق في الظلام (أقل نثر) نافذة غشاء الخطيئة. حافة رقاقة هو مشرق بسبب تشتت المفرط. (ج) التركيز يتم في زاوية النافذة الخطيئة. وتظهر الصور تحت تركز، في التركيز، وحالات الإفراط في التركيز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
تم استخدام حامل تدفق تيم السائل لدراسة سلوك AuNPs في السائل. وقد ثبتوا AuNPs مستقر على الغشاء الخطيئة في الماء النقي وتم تصوير لقرار النانوية باستخدام المرحلة سائل STEM (الشكل 6). تم الحصول على النقيض من ممتازة على الذهب نثر بقوة. كانت الكثافة الحالية على الشاشة الفوسفور قياس لاختبار عينة الجافة 20 PA / سم ²، في حين بلغت 8 السلطة الفلسطينية / سم ² مع حامل تدفق تيم السائل المدرجة. باستخدام المعادلة 1، التخليص الماء = 2.4 ± 0.5 ميكرون، أكبر بكثير مما كان متوقعا على أساس سمك هل من 200 نانومتر. ومع ذلك، فإن سماكة ليست كبيرة جدا للتصوير من AuNPs مع نانومتر القرار المكانية. وكان سمك السائل أكثر سمكا من 200 نانومتر التي وضعتها هل يرجع ذلك إلى انتفاخ الأغشية الخطيئة وعدم التسطيح للرقائق، والحطام المقيمين على الرقائق.
ther.within الصفحات = "1"> للمياه نقية، وAuNPs حفاظ على شكلها أثناء التصوير 16، على الرغم من أن منتجات الإنحلال الإشعاعي على رد الفعل (ه - عبد القدير، H •، H +، OH •) التي تنشأ من تفاعل شعاع الالكترون مع المياه قد أكسدة ذرات الذهب واحدة، مما يؤدي إلى تغيير شكل AuNPs 15. ومع ذلك، عندما تم استخدام نظام تدفق السائل إلى إدخال أيونات الكلوريد في التجربة الثانية، تغيرت استقرار AuNPs. أيونات الكلوريد قادرة على تحقيق الاستقرار في ذرات الذهب المؤكسد في شكل tetrachloroaureat، AuCl 4 -. ويبين الشكل 7 أن AuNPs حل ببطء خلال STEM التصوير سلسلة مرور الزمن، على غرار النتائج ذكرت في وقت سابق 16. لاستخدام معدل الجرعة الإلكترون، استغرق ~ 300 ق حل 30 AuNPs نانومتر الحجم.
تحركات AuNPs في توفير المياه درست ص في التجربة الثالثة (الشكل 8). قبل التجربة، تم تنظيف حامل تدفق تيم السائل من أجل إزالة أي آثار للملح. تختلف عن التجربة الأولى، تم استخدام منهج إعداد عينة بديلة لتحقيق مرفق أضعف من AuNPs إلى غشاء الخطيئة (14). في هذه التجربة، تم وضع حل AuNP على رقاقة السيليكون وتجميعها في حامل تدفق تيم السائل دون السماح الحل تجف. في هذه الطريقة، وAuNPs الغواصين بسهولة من الغشاء الخطيئة على التصوير في معدل الجرعة المستخدمة. انتقل بعض AuNPs بعيدا عن مجال الرؤية إلى الحلول بكميات كبيرة، في حين بقي AuNPs المتبقية داخل مجال الرؤية على مقربة من النافذة الخطيئة. وقد لوحظت تحركات هؤلاء AuNPs، وأنها في نهاية المطاف مكتل. بعد فترة من الوقت، فصل هذه الكتل أيضا من الغشاء الخطيئة وانتقل من مجال الرؤية، وإلى حل.
ntent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 ">
الشكل 6: المسح الضوئي نقل المجهر (STEM) صورة مجهرية من AuNPs 30 نانومتر في القطر في الجزء العلوي من طبقة المياه النقية. الصورة المعروضة هي مساحة محددة من الصورة الأصلية. وكان حجم الصورة 1024 س 1024 بكسل، كانت المرة بكسل يسكن 19 ميكرو ثانية، كان حجم بكسل 0.73 نانومتر، وكان التكبير 400،000X. وكانت جرعة الإلكترون وبالتالي 7.1 × 10 4 ه - / nm². كانت كثافة التيار المقاسة على الشاشة الفوسفور 8 السلطة الفلسطينية / سم 2، لذلك تم حساب سماكة السائل ليصل إلى 2.4 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: سلسلة الوقت الفاصلمن الميكروسكوب STEM من AuNPs في المالحة. (AD) الصور المستخرجة من سلسلة الوقت الفاصل بين الصور STEM في الصورة فترات 30. وAuNPs تذوب تدريجيا في السائل نتيجة وجود أيونات الكلوريد. وكانت المرة بكسل يسكن 2 ميكرو ثانية، والإطار الزمني لسلسلة الفاصل الزمني كان 1.75 ثانية، كان حجم بكسل 0.44 نانومتر، وكان التكبير 500،000X. وكانت جرعة الإلكترون في صورة 1.2 × 10 4 ه - / nm². وكان سمك السائل 2.4 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8: STEM صورة مجهرية من AuNPs تتحرك في الماء النقي. (A) غشاء الخطيئة مع AuNPs، والتي يتم اختيار عدة مع السهام. (ب) مسارات الحركةمن AuNPs مختارة (انظر A). بعض AuNPs الابتعاد عن مجال الرؤية خلال فترة التصوير. وAuNPs المتبقية تتحرك أفقيا على طول الغشاء الخطيئة والبدء agglomerating. عند بلوغ حجم كتلة حرجة، وأنها ترسل من الغشاء والابتعاد عن مجال view.The الوقت بكسل يسكن كانت 1 ميكرو ثانية، كان الإطار الزمني 0.52 ثانية، كان حجم بكسل 1.8 نانومتر، وكان التكبير 120،000X. وكانت جرعة الإلكترون في صورة 3.5 × 10 2 ه - / nm² وكان سمك السائل 2.4 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يتيح بروتوكول صفها STEM من AuNPs في سائل، بما في ذلك مراقبة العمليات الحيوية. هو تجميع حامل تقنية سهلة لتعلم. ومع ذلك، يجب النظر في العديد من الجوانب عند العمل مع صاحب تدفق تيم السائل. على سبيل المثال، الحواف المكسورة من رقاقة سي أو الجزيئات الكبيرة على الحلقات قد يؤدي إلى تسرب الخلية السائلة. من ناحية أخرى، جزيئات كبيرة (> 200 نانومتر، على سبيل المثال، غبار أو الحطام سي) على الغشاء الخطيئة قد يؤدي إلى زيادة في سمك الخلية السائلة، مما يؤدي إلى تباين التصوير منخفض أو إلى القرار المكانية منخفضة وربما حتى سبب نوافذ الخطيئة لكسر. الأهم من ذلك، بقايا الملح أو المواد الكيميائية الأخرى قد تؤثر على نتائج التجارب بطريقة غير مرغوب فيها. لذا، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ الخطوات المختلفة لإعداد العينات والتجمع حامل بعناية وفي بيئة نظيفة وخالية من الغبار.
سمك م السائلتحدد ليرة لبنانية القرار قابلا للتحقيق، وكذلك على النقيض من الصور التي تم الحصول عليها 17. هذا السمك يمكن تعديلها عن طريق الفواصل التي تقع على واحد من اثنين من الرقائق سي. اعتمادا على أبعاد العينة، سمك مختلفة من الخلية السائلة يمكن أن تتحقق. لدراسة AuNPs، فمن الممكن استخدام الفواصل الصغيرة (200-500 نانومتر)، بينما تحتاج الخلايا حقيقية النواة كلها الفواصل أكبر تصل إلى 5 ميكرون. ويتأثر سمك الخلية السائلة مزيد من انتفاخ النوافذ غشاء الخطيئة الناتجة عن اختلاف الضغط بين الخلية السائلة والفراغ المحيطة بها. بهذا المعنى يصبح أكثر وضوحا مع أكبر الخطيئة النوافذ الغشاء. وبالتالي، من أجل تقليل سمك الخلية السائلة، فمن المستحسن استخدام صغيرة النوافذ غشاء الخطيئة. في حال فإنه من الصعب العثور على التداخل بين نافذتين صغيرة، فإنها يمكن تجميعها في تكوين عبرت باستخدام رقاقة قاعدة مختلفة. تكوينات بديلة لارجاعل منع انتفاخ وتتكون من متآلف رقاقة 18 أو غشاء النوافذ التي تدعمها أعمدة 19، ولكن تلك العيوب المعرض فيما يتعلق عينة التحميل. واحدة من أصعب جوانب التكنولوجيا الحالية هو عدم وجود مراقبة دقيقة على مدى سماكة السائل. في كثير من الأحيان، والسائل هو أكثر سمكا بكثير من ما هو متوقع من أبعاد هل المستخدمة، كما هو موضح هنا. استخدمت عدة مجموعات مغلقة غرف السائل 4، 20، 21، 22؛ هذه الأنظمة لها بعض المزايا فيما يتعلق بقرار المكاني، كما يمكن تقليل سماكة السائل عن طريق إحداث فقاعة في السائل. بدلا من ذلك، النوافذ الخطيئة يمكن أن يجبر على الانهيار، مما يؤدي إلى طبقة السائل أرق. ثالثا، الضميمة من النوافذ أرق أخرى موجودة (على سبيل المثال، الجرافين) 23، مما أدى أيضا في سوائل أرق بكثيرمما هو ممكن مع النظام المذكور في هذا البروتوكول. ومع ذلك، فإنه من المستحيل أن تدفق السائل في تلك النظم.
أما بالنسبة للأي تقنية المجهر ارتفاع القرار، ويجب النظر في عدد من الجوانب التجريبية. الجانب الأكثر أهمية هو تفاعل شعاع الالكترون مع السائل أو العينة. بالإضافة إلى أضرار الإشعاع، مما يحد من القرار المكانية تحقيقه للعديد من العينات الصلبة 24، وتتأثر العينات السائلة أيضا الإلكترون منتجات الإنحلال الإشعاعي ولدت شعاع 15 و 25. وبما أن هذه المنتجات قد تؤثر على التجربة، وتفسير البيانات دقيقة والتصميم التجريبي ضرورية 26. وينبغي اختيار الإعدادات المجهر وفقا لأهداف دراسة خاصة. STEM قوة الدفاع الاسترالية أقوى للجسيمات الدقيقة التصوير من العدد الذري عالية (Z) في سمك أكبر من الخلية السائلة، مبادرة الخوذ البيضاءلو تيم يعطي أفضل النقيض من ذلك على المواد المنخفض Z ويكون عادة أسرع ولكن يتطلب أرق طبقات السائل 3. بدلا من استخدام كاشف ADF، يتم استخدام (BF) كاشف الميدان برايت أحيانا إلى صورة الخلية السائلة، منذ BF STEM هو مفيد لتصوير المواد المنخفض Z في طبقات سميكة 27. مع زيادة سمك الخلية السائلة، هناك حاجة إلى مزيد الحالية. ومع ذلك، وهذا يزيد من تركيزات المنتجات الإنحلال الإشعاعي ويزيد من أضرار الإشعاع. كما تجدر الإشارة إلى أن انعكاس على النقيض من ذلك لوحظ في كشف قوة الدفاع الاسترالية للسوائل سميكة جدا (> 10 ميكرون للمياه).
تم تغيير شروط السائلة بين تجاربنا عن طريق إزالة حامل من المجهر وتبادل كل من العينة والسائل. بالإضافة إلى تغيير تركيز الملح، فمن الممكن بسهولة لتغيير خصائص أخرى من السائل المتدفق في سوائل مختلفة (على سبيل المثال، يمكن للمرءاستخدام المحاليل من أجل تحديد درجة الحموضة محددة 16 أو تقديم حلول العضوية أو غيرها من المواد المضافة). ومن الممكن أيضا لتغيير السائل في حين لا يزال إدراج حامل في المجهر من قبل تتدفق السوائل من خلال نظام ميكروفلويديك. ومع ذلك، في هذه الحالة، فإنه من غير المعروف في الوقت الذي تشير السائل في التغييرات العينة. ومن الجدير بالذكر أيضا أن الرقائق دعم أقطاب متوفرة، لذلك يمكن أن يتم تجارب الكيمياء الكهربائية النانو من 28.
الكائنات من الدراسة لا تقتصر على AuNPs في الماء، ولكن طائفة واسعة من العينات يمكن دراستها باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه، بما في ذلك والسليكا، وأكسيد التيتانيوم، والبوليمرات. إذا تحركات الكائنات سريعة جدا لالتقاط صورة في داخل الاستحواذ، اللزوجة يمكن تخفيض لحجم باستخدام خليط من 50٪ الجلسرين والماء 50٪.
من النقاط المذكورة أعلاه،عدد من المزايا، وإمكانيات، وأيضا مساوئ أصبحت واضحة. عند العمل مع مرحلة السائل STEM، وأهم السلبيات للنظر هي ما يلي: 1) يتأثر أي تجربة من التفاعل الديناميكي للشعاع الالكترون مع العينة بأكملها (الكائن تحت الملاحظة، السائل، والأغشية الخطيئة)؛ 2) التعامل مع العينة مملة، وغالبا ما يكون من الصعب تحقيق طبقة السائل رقيقة لأن عينة أو الرقائق تحتوي بعض الجسيمات ميكرون الحجم؛ 3) عادة ما يختلف سمك السائل إلى حد كبير من سمك المقصود وضعتها هل. و4) القرار المكانية وعلى النقيض تعتمد بشدة على سماكة السائل والفرق بين كثافة تغيير الكائن تحت الملاحظة والسائل.
في الوقت الحاضر، توجد طرق واسعة لالمجهر الكائنات في السائل مع نانومتر القرار المكانية. المجهر الإلكتروني في الجليد غير متبلور هي تقنية قوية 29،ولكن الإجراءات التجريبية المعنية حساسة، وليس كل التجارب تسمح إعداد العينة في الجليد، والتجارب وقت حل مستحيل. الأشعة السينية المجهري 30، 31 يمكن من حيث المبدأ أن تستخدم، لكنه لا يملك القرار المكانية محدود وغير متوفرة على نطاق واسع في المختبرات. تم تأسيس مجهر القوة الذرية في السائل ولكن هو أسلوب السطح فقط 32، 33، 34، 35. المجهر الضوئي لا يحمل القرار المكانية كافية. في الوقت الحاضر، المجهر الإلكتروني في السائل يبدو أن تقنية أقوى للفحص المجهري المباشر للأجسام النانوية والعمليات في السائل.
المرحلة السائلة تيم وSTEM ليست حتى الآن تقنيات تحليلية روتينية ولكن ما زالت تتطور. عدد المعلمات أن تأخذ في الاعتبار هو كبير، وأنه هو ofteن يصعب استنساخها النتائج التجريبية. وعلاوة على ذلك، البيانات الكمية من الصعب الحصول على البيانات لأن تتشابك الآثار تحت التحقيق مع العمليات التي تحدث نتيجة لشعاع الالكترون. ويهدف البروتوكول الموصوفة هنا لتوحيد بروتوكول تجريبي، مما يمثل جميع جوانب القاعدة ذات الصلة من التجربة. ونحن نأمل ان يكون هذا البروتوكول سوف يؤدي إلى استنساخ أفضل من العمل التجريبي في هذا المجال الناشئ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular light microscope | Leica | M60 CMO | |
| Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector | JEOL | ARM200F | |
| Liquid flow TEM specimen holder | DENS Solutions | Ocean | |
| Microfluidic syringe pump | Harvard Scientific | PicoPlus | |
| Plasma cleaner | Gatan | Solarus950 | |
| Chemicals | |||
| Acetone, Rotisolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
| Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
| Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
| Materials | |||
| Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Microfluidic peek tubing | Upchurch Scientific | 1570 | |
| Plastic Replaceable tips Tweezers | |||
| (Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips) | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
| Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
| Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
| Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR) | Hamilton | 81323 | |
| Clean room tissue Sontara Micropure AP (224 x 224mm) | DuPont | Sontara MicroPure |
References
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
- Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
- Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
- Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
- de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
- Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
- Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
- Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
- de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
- Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
- Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
- Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
- Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
- Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
- Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
- Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346 (2004).
- Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
- Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
- Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
- Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
- Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
- Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
- Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
- Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
- Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).
