Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

Published: April 26, 2017 doi: 10.3791/54967
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University
* These authors contributed equally

Summary

דו"ח זה מתאר שיטת Bioengineering לתכנן ולבנות גורמי שחבור מלאכותיים רומן (ASFs) כי דווקא לווסת את השחבור של גני המטרה בתאי יונקים. שיטה זו ניתן להרחיב עוד להנדס גורמים מלאכותיים שונים כדי לתפעל היבטים אחרים של חילוף החומרים RNA.

Abstract

העיבוד של רוב RNAs איקריוטיים מתווכת על ידי RNA מחייב חלבונים (RBPs) עם תצורות מודולרי, כולל מודול הכרה RNA, אשר דווקא נקשר היעד הרנ"א הראשוני תחום מפעיל. בעבר, נקטנו היתרון של מצב מחייב רנ"א ייחודי של תחום PUF ב האנושי Pumilio 1 כדי ליצור פיגום לתכנות RNA מחייב, אשר שימש מהנדס RBPs מלאכותית שונים כדי לתפעל את חילוף החומרים RNA. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לבנות גורמי שחבור Engineered (ESFs), אשר תוכננו במיוחד כדי לווסת את השחבור החלופי של גני המטרה. הפרוטוקול כולל איך לתכנן ולבנות פיגום PUF אישית עבור מטרה RNA ספציפי, כיצד לבנות פלסמיד ביטוי ESF ידי פיוזינג תחום PUF מעצב תחום מפעיל, וכיצד להשתמש ESFs לתפעל את שחבור של גני מטרה. בתוצאות הנציג של שיטה זו, יש לנו גם תארו את המבחנים הנפוציםפעילויות ESF באמצעות כתבי שחבור, היישום של ESF בתאים אנושיים בתרבית, ואת ההשפעה הבאה של שינויי שחבור. על ידי ביצוע פרוטוקולים מפורטים בדוח זה, אפשר לעצב וליצור ESFs להסדרת סוגים שונים של שחבור חלופי (AS), מתן אסטרטגיה חדשה ללמוד תקנה שחבור והפונקציה של isoforms שחבור שונים. יתר על כן, על ידי פיוזינג תחומים פונקציונליים שונים עם תחום PUF מעוצב, חוקרים יכולים להנדס גורמים מלאכותיים כי למקד RNAs הספציפי כדי לתפעל צעדים שונים של עיבוד RNA.

Introduction

רוב הגנים האנושיים עוברים רישוי אלטרנטיבי (AS) כדי לייצר מספר איסופורמים עם פעילויות נפרדות, אשר הגדילו מאוד את המורכבות של קידוד הגנום 1 , 2 . AS מספקת מנגנון מרכזי להסדרת תפקוד הגן, והוא מוסדר בחוזקה באמצעות מסלולים מגוונים בשלבים שונים של ההתפתחות הסלולרית והתפתחותית 3 , 4 . בגלל שחילוף שגוי הוא גורם שכיח למחלות אנוש 5 , 6 , 7 , 8 , מיקוד שחבור תקנה הופך נתיב טיפולי אטרקטיבי.

על פי מודל פשוט של רגולציה שחבור, AS נשלטת בעיקר על ידי שחבור רגולטורית CIS- אלמנטים (SREs) ב מראש mRNA שפועלים כמו משפרי שיפורים או משתיקי קול של אקסונים חלופיים. תEse SREs מגייסים באופן ספציפי גורמים שונים לחילוק גורמים לחילופין ( כלומר, גורמים שחבור) המקדמים או מדכאים את התגובה לחבור 3 , 9 . רוב transact גורמים שחבור יש רצף נפרד ספציפי RNA מחייב תחומים לזהות את המטרות שלהם תחומים אפקט לשלוט שחבור. הדוגמאות המפורסמות ביותר הן בני משפחת החלבון של SRine / arginine, המכילים מוטיבות זיהוי RNA (RRM) N-Terminal RNMs, המחייבים חיבורי שחבור אקסוני ותחנות RS-Term-RS, המקדמים את אקסון הכללה 10 . לעומת זאת, hnRNP A1 נקשר לשתיקי שחיקה אקזוטיים באמצעות דומיינים של RRM ומעכב הכללת אקסון באמצעות תחום C-Termin-glycine עשיר 11 . באמצעות תצורות מודולריות כאלה, החוקרים צריכים להיות מסוגלים להנדס גורמים שחבור מלאכותי על ידי שילוב של RNA ספציפי מחייב תחום (RBD) עם effec שוניםתחומים המפעילים או מעכבים שחבור.

המפתח של עיצוב כזה הוא להשתמש RBD שמזהה מטרות נתון עם RNA לתכנות ספציפיות מחייב, אשר מקביל למצב מחייב DNA של תחום הסיפור. עם זאת, רוב הגורמים שחבור ילידים מכילים RRM או K הומולוגיה (KH) תחומים, אשר לזהות אלמנטים קצרים RNA עם זיקה חלשה ולכן חסר ניבוי RNA חלבון הכרה "קוד" 12 . RBD של חלבונים PUF חוזרים ( כלומר תחום PUF) יש מצב הכרה ייחודית RNA, המאפשר לעצב מחדש של תחומים PUF לזהות באופן ספציפי מטרות RNA שונים 13 , 14 . תחום PUF הקנוני מכיל שמונה חזרות של שלושה α-סלסלות, שכל אחת מהן מזהה בסיס בודד ביעד RNA 8-nt. שרשראות הצד של חומצות אמינו בתנוחות מסוימות של השני α- סליל טופס קשרי מימן ספציפיים עם הקצה ווטסון קריק של tהוא RNA בסיס, אשר קובע את הספציפיות RNA מחייב של כל חוזר (איור 1A). הקוד להכרת בסיס RNA של חוזרי PUF הוא פשוט להפליא (איור 1A), המאפשר את הדור של תחומי PUF שמזהים כל שילוב 8-בסיס אפשרי (נבדק על ידי ויי ו וואנג 15).

עיקרון עיצוב המודולרי מאפשר לדור של גורם שחבור Engineered (ESF) שמורכב תחום PUF ומותאם תחום אפנון שחבור (כלומר תחום SR או תחום גלאי עשירי). ESFs אלה יכול לשמש גם ממריצי שחבור או כמו מעכבים לשלוט סוגים שונים של אירועי שחבור, והם הוכיחו שימושים ככלים כדי לתפעל את השחבור של גני אנדוגניים הקשורים למחלות אנושיות 16, 17. כדוגמה, בנינו PUF-גלאי-סוג ESFs לשנות את שחבור במיוחד של הגן Bcl-x, המרת איזופורם ארוך אנטי אפופטוטיים (Bcl-XL) כדי איזופורם קצר פרו-אפופטוטיים (Bcl-XS). העברת היחס של איזופורם Bcl-x הייתה מספיק כדי לרגש תאי מספר סרטן לתרופות כימותרפיות אנטי-סרטני מרובות 16, דבר המצביע על כך גורמים המלאכותיים אלה עשויים להיות שימושיים כמו ריאגנטים טיפולי פוטנציאל.

בנוסף לשליטת שחבור עם תחומי מפעיל שחבור ידועים (למשל, תחום RS או גלאי עשירי), גורמי PUF המהונדסים יכולים לשמש גם כדי לבחון את פעילות גורמי שחבור חדשים. לדוגמא, באמצעות גישה זו, אנו הוכחנו כי תחום C- מסוף של חלבונים כמה SR יכול להפעיל או לעכב שחבור כאשר מחייבים לאזורים תעתיקי רנ"א ראשוני שונים 18, כי המוטיב עשיר-אלנין של RBM4 יכול לעכב שחבור 19, וכי מוטיב עשיר פרולין של DAZAP1 יכול לשפר שחבור 20, 21 </ Sup>. תחומים פונקציונליים חדשים אלה יכולים לשמש לבניית סוגים נוספים של גורמים מלאכותיים שחבור לכוונן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בניית פיגום PUF עם מותאם RNA מחייב ספציפיות ידי חופפים PCR

  1. עליו להגדיר שורה של פריימרים PCR המכילים רצפי PUF שמזהים נוקלאוטידים RNA שונים במיוחד בכל עמדה 12 (ראה טבלה 1 עבור רצפי פריימר ראה איור 1 א 'ה- RNA: קוד זיהוי PUF). לכל חוזרים PUF, עיצוב ארבעה צבעי יסוד שונים להכיר בסיס שונה על כל עמדה.
    הערה: צבעי יסוד אלה ישמשו בסדרה של ארבעה סיבובים של תגובות PCR כדי ליצור שברי PUF כי הם חברו יחד (איור 1 ב ').
  2. בחר את אתר ההכרה של גן המטרה ליד אתר שחבור האלטרנטיבה.
    הערה: אתר זה יכול להיות מוכרע על ידי המשתמש, והוא נבחר בדרך כלל תוך 10 - 50 NT מן אתרי שחבור האלטרנטיבה.
  3. Round 1: צור קידוד רצפיםעבור 4 חזרות PUF, שברי גשר אוניברסליים, ושברי כובע.
    1. השתמש באתר היעד להגדיר קוד זיהוי לכל חוזרות של PUF אישית. בחרו בקבוצת פריימרים PCR עבור PUF חוזר 1 - סיבובים רצופים 8. ארבעה ההתנהגות של PCR לייצר תחום PUF אישית, כמתואר להלן (B באיור 1).
    2. בסיבוב הראשון של ה- PCR, להגדיר תערובות התגובה PCR תקן (המכיל 2.5 μL של 10x חיץ, 0.5 μL של 10 מ"מ dNTPs, 0.5 μL של 10 מיקרומטר קדימה לאחור תחל, 50 ננוגרם של תבנית ה- DNA (cDNA אדם או וקטור הביטוי של תחום PUF WT), ו 0.5 DNA פולימרז באיכות הגבוהה U בנפח 25 μL סופי).
      הערה: תגובות אלה יפיקו רצפי DNA המתאים לכל אחד חוזר PUF, כדי שברי גשר אוניברסלי, וכדי שני שברי כובע עם אתרי הגבלה שונים (איור 1 ב '). רשימה קצרה של תבניות, פריימרים, ומוצרים PCR שנוצר בשימוש בשלב זה מוצגים בטבלה 2 .
    3. הגדר את תוכנית ה- PCR כדלקמן: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 28 מחזורים של 30 s ב 95 מעלות צלזיוס, 30 s ב 55 מעלות צלזיוס, ו 15 ב 72 מעלות צלזיוס; ו 5 דקות הדגירה על 72 מעלות צלזיוס. השתמש ב- DNA פולימראז נאמנות גבוהה כדי למזער מוטציות נקודה במהלך PCR.
  4. סיבוב 2: צור רצפי קידוד עבור R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) ו- R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
    1. להפריד את מוצרי ה- PCR שהתקבלו בשלב 1.3.3 באמצעות אלקטרופורזה עם ג'ל agarose 1.5% (25 דקות במתח קבוע של 120 V). ג 'ל לטהר את כל המוצרים בגודל הצפוי באמצעות ערכת טיהור ג' ל. השתמש בתערובת שונה של מוצרים אלה כתבנית בסיבובים הבאים של PCR.
      הערה: ערבבו את שלושת מוצרי ה- PCR בערך ביחס של 1: 1: 1. הם בדרך כלל לא צריך להיות לכמת, כל עוד את העוצמה של כל מוצר נראה דומה בג'ל.
    2. מערבבים כ 5% של מוצרי ה- PCR מטוהרים כמו טמפרטורהצלחת בסבב הבא של PCR. לחלופין, לכמת את המוצרים PCR מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis ולהשתמש 15 ng של כל מוצר PCR בתערובת תבנית.
    3. השתמש במוצרי PCR מטוהר R1 / R2, R3 / R4, ואת גשר 2/3 תבניות מעורבות כמו ו R1-F ו R4-R כמו פריימרים. הגדרת התגובה PCR כפי שמתואר בשלב 1.3 להשיג חופפים R1 המוצר PCR - 4.
    4. השתמש במוצרי PCR מטוהרים R5 / R6, R7 / R8, ואת גשר 6-7 כתבניות מעורבות R5-F ו- R8-R כמו פריימרים להשיג חופפים PCR המוצר R5-8 (איור 1 ב '). הגדר את תוכנית ה- PCR כדלקמן: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 28 מחזורים של 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 55 מעלות צלזיוס, ו 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס; ו 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. ג'ל-לטהר R1-4 ו R5-8.
  5. Round 3: ליצור רצפים קידוד עבור R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 בלי אותיות רישיות).
    1. בסיבוב השלישי של PCR, באמצעות R1-4 המטוהר, R5-8, ואת הגשר 4/5 תבניות מעורבות כמו ו R1-F וR8-R כמו primers, להגדיר את התגובה PCR כמתואר בשלב 1.3 כדי להשיג מוצר PCR חופפים R1-8 ללא כובעים.
    2. הגדר את תוכנית ה- PCR כדלקמן: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 28 מחזורים של 30 s ב 95 מעלות צלזיוס, 30 s ב 55 מעלות צלזיוס, ו 55 של 72 מעלות צלזיוס; ו 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. ג'ל לטהר את R1-8 ללא כובעים.
  6. סיבוב 4: יצירת רצפי קידוד עבור תחומים PUF מלאה.
    1. בסבב האחרון של PCR, באמצעות מטוהרים R1-8 ללא כובעים ו 5'-end ו -3 'סוף כמוסות כמו תבניות מעורבת ו- Cap-F ו- Cap-R כמו primers, להגדיר את התגובה PCR כמתואר בשלב 1.3 כדי לקבל את תחומים PUF הסופי מוטציה.
    2. הגדר את תוכנית ה- PCR כדלקמן: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 28 מחזורים של 30 s ב 95 מעלות צלזיוס, 30 s ב 55 מעלות צלזיוס, ו 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; ו 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס.
    3. ג'ל לטהר את מוצרי ה- PCR של תחומים PUF הסופי תכנות מחדש. השתמש במוצרים אלה לבניית ביטוי ESF פלסמיד בשלבים הבאים. סקוEnce את המבנה הסופי כדי לאמת את sequences רצף של תחומים PUF.
      הערה: Cap-F מקודד את NLS (PPKKKRKV) בין אתרי BAMH I ו- XBA I ו- Cap-R מקודד קודון עצירה ואתר ה- I I (אתרי הגבלה נועדו לבניית וקטורי ביטוי של ESF, איור 1 ג ).

2. בניית מודול פונקציונלי של ESFs

  1. שתי אסטרטגיות משמשות לשכפול מודולים תפקודיים של ESF (תחומים RS או Gly- תחומים עשירים): כדי להגביר את תחומים אלה על ידי PCR באמצעות cDNA האנושי הכולל כתבנית (שלב 2.2) או ישירות לסנתז את שברי ה- DNA כי קוד RS שונים או דומיינים עשירים (שלב 2.3).
  2. השתמש ב- PCR כדי לשכפל שדות RS משאריות 123 - 238 מתוך 9G8 (NP001026854), שאריות 180-272 של SRP40 (NP008856), או שאריות 117 - 221 של SC35 (NP003007). שכפול גלאי עשיר תחומים מן שאריות 195 - 320 של hnRNP A1 (NP_002127), שאריותים 203 - 353 hnRNP A2 (NP112533), או שאריות 211 - 378 hnRNP A3 (NP919223).
    1. השתמש בכלי עיצוב פריימר צמח השדה (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) או Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) לתכנן פריימרים עבור שיבוט תחומים RS או תחומים עתירי גלאי (מודול תפקודית של ESFs).
      הערה: פריימר קדימה מכיל תג FLAG N-terminal לאחר שהאתר Nhe לי. פריימר הפוכה מכילה אתר שאני BamH עבור שיבוט לתוך וקטורי ביטוי (איור ג 1).
    2. הגדרת תגובת PCR הסטנדרטית, כפי שמתואר בשלב 1.3, כדי להגביר את RS או תחומים עתירים גלאי. הגדר את תוכנית ה- PCR כדלקמן: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 28 מחזורים של 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 55 מעלות צלזיוס, ו 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס; ו 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס.
  3. RS Clone תחומים או תחומי גלאים עשירים באמצעות סינתזת DNA ישירה. במקום לייצר מוצרים PCR המקודדים לדומיינים מפעיל בשלב 2.2, Syntheגודל oligonucleotide המקודד תחום RS קצר שבר (RSRSRSRSRSRS) או תחום גלאי עשירי (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) באמצעות מקור מסחרי של oligonucleotides DNA.

3. בניית פלסמידים ביטוי ESF

  1. Construct פלסמידים ביטוי ESF באמצעות כל וקטור ביטוי.
    הערה: ביטוי לבנות PGL-גלאי-MS2 (מתנה מד"ר ר Breathnach ממכון דה Biologie-CHR 11) שימש במקור, אשר מקודד מן N- אל C-סופני, אפיטופ דגל, גלאי תחום -rich של hnRNP A1, ואת החלבון מעיל MS2. לכן, לבנות ביטוי זה משמש כדוגמה בשלב הבא.
    הערה: וקטורים ביטוי אחרים עם אתרי שיבוט מרובים יכול לשמש גם, ואת הצעדים שיבוט התקן ייושם להצטרף שברי יחד.
  2. תקציר 1.5 מיקרוגרם של פלסמידים הביטוי (PGL-גלאי-MS2) כאמור בשלב 3.1 להסיר את מקטעי חלבון מעיל MS2. השתמש restricTion endonucleases BAMH אני סאל אני עבור 1 שעה ב 37 ° C. לעכל את מודול הכרה של ESFs (קידוד NLS ו תכנות מחדש תחומים PUF, שנוצר בשלב 1.5) עם BamH אני סאל אני באותו מצב.
  3. הוסף צבע 5x טוען לתגובות digest להגביל electrophorese לאט נפח כולל עם ג'ל agarose 1.5% המכיל כתם ג'ל דנ"א במשך 40 דקות ב 120 V. ג'ל לטהר את המוצרים מתעכל.
  4. הכן 10 תגובות קשירת μL עם מודול הכרה מטוהרים של ESF מוסיף וקטור ביטוי וקטור DNA ביחס 3: 1, 1 μL של ליגז DNA, ו 1 μL של חיץ קשירת 10x. דגירה תגובות קשירת לילה ב 4 מעלות צלזיוס; את המבנה שנוצר מבטא סוג Gly-PUF ESF (pGL-Gly-PUF) תחת שליטה של ​​האמרגן CMV ( איור 1 ג ).
  5. הסר את קטע קידוד הדגל / Gly- עשירים עם תחום Nhe אני ו BamH אני אכול במשך שעה 1 ב 37 ° C. החלף אותו עם קטע שקודד את תחום ה- RS (שנוצר בשלב 2.2, מתעכל גם על ידי Nhe I ו- BAMH I); את מבנה וכתוצאה מכך מבטא RS-PUF מסוג ESF ( איור 1 ג ).

4. בניית כתב החבורות

  1. לסנתז oligonucleotides המכיל רצפים המועמד ( כלומר רצפים היעד של תחומים PUF) מוקף Xho אני ו Apa אני אתרים או Xho אני ו EcoR אני אתרים. Enal oligonucleotides במשך 5 דקות על 55 מעלות צלזיוס כדי לקבל כפול תקועים מוסיף המכילים את אתרי ההכרה של תחומים PUF מוקף הקצוות מלוכדת של Xho אני ו Apa אני או Xho אני ו EcoR אני האתרים.
  2. התחל מ שפורסם בעבר מודולרי שחבור כתב 22 , pGZ3, אשר מכיל שני אקסונים של GFP מופרדים על ידי אקסון הבדיקה (אקסון 12 של IGF2BP האדם האנושי, מזהה Ensembl ENSG00000159,217) ו אינטרונים איגוף שלה.
    הערה: אקסון המבחן תוכנן עם Xho שאני אופו שאני אתרים, אשר ניתן להשתמש בם כדי להכניס oligonucleotides מסונתז המכיל רצפי המועמד (רצפי יעד של תחומי PUF). כתב שחבור מודולרית זו (pGZ3) מסופק באמצעות מאגר פלסמיד Add-גן.
  3. לעכל את כתב בסיס pGZ3 (מוכן בשלב 4.2) עם endonucleases הגבלת Xho שאני אופו לי עבור 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. ג'ל-לטהר את המוצרים מתעכלים כפי שמתואר בשלב 3.3.
  5. כן 10 μL של תגובות קשירה עם הוסיף הפעמים התקועות שנוצר בשלב 4.1 ואת וקטור pGZ3 מתעכל שנוצר בשלב 4.4 בתוך 3: יחס טוחנת 1, 1 μL של אנזים דנ"א, ו 1 μL של חיץ קשירת 10x. דגירת תגובות קשירת הלילה בשעת 4 ° C כדי להשיג את pGZ3 וקטור כתב שחבור בניין.
  6. הכנס את מוסיף פעמיים תקועים שנוצר בשלב 4.1 לתוך בעברשפורסמו, pEZ-1B (באמצעות Xho I ו EcoR I אתרים) ו pEZ-2F (באמצעות Xho אני ו Apa אני אתרים) 23 , כדי לקבל את המתחרה 5 s כתב הכתב מתחרה 3 ss, כמתואר בשלבים 4.3-4.5.
    הערה: שני סוגים של כתבים שחבור יהיה זמין דרך Add-gen.

5. בניית וקטור הביטוי Lentiviral עבור ESF

  1. הגדר את התגובה PCR סטנדרטי כמתואר בשלב 1.3 כדי להגביר את ESFs באורך מלא מן וקטורים הביטוי המקורי (pGL-Gly-PUF או pGL-RS-PUF) עם primers המכילים Mlu אני / אני אתרי אני. הגדר את תוכנית ה- PCR כדלקמן: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 28 מחזורים של 30 s ב 95 מעלות צלזיוס, 30 s ב 55 מעלות צלזיוס, ו 1.5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; ו 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס.
  2. באמצעות תגובה העיכול, טיהור ג'ל, תגובת קשירת, לשלב את ESFs לתוך וקטור הביטוי lentiviral, pWPXLd, בין Mlu SPE, כמתואר בשלבי 3.2-3.4.
  3. השתמש בשיטה משקעים סידן פוספט סטנדרטי, כפי שדווח בעבר 24, כדי ליצור lentiviruses ידי cotransfecting תאים HEK293T ידי אריזת וקטורים, psPAX2 ו pMD2.G, עם או pWPXLd-גלאי-PUF (Bcl-x), pWPXLd-גלאי-PUF ( WT) (כביקורת ספציפית), או pWPXLd-GFP (מדומה).
    1. זרע 5x10 6 תאים HEK293T לתוך 10 מנות ס"מ ולגדול התאים לילה 10 מ"ל של מדיום של הנשר Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) לכל צלחת בתוך חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 . בצע את transfection כאשר התאים הם 70 - 90% ומחוברות.
    2. מכינים את תערובת הפלסמיד על ידי הוספת שלושה פלסמידים (7.5 מיקרוגרם של וקטור אריזה, psPAX2; 2.5 מיקרוגרם של pMD2.G; ו 10 מיקרוגרם של או pWPXLd-גלאי-PUF (Bcl-x), pWPXLd-גלאי-PUF (WT) , או pWPXLd-GFP) לצינור מ"ל 2.
    3. הוספת 560 μL של 0.25 M CaCl2 ו 560 μL של פתרון 2x BBS אל הצינור 2-מ"ל. מערבבים בעדינות מספר פעמים לדגור זה עבור 15 דקות ב RT להכין את התערובת transfection.
    4. מוסיפים את כל תערובות transfection אל הכלים 10 ס"מ. לערבל את הכלים בעדינות דגירה אותם בן לילה ב 3% CO 2 ו 37 מעלות צלזיוס.
    5. הסר את המדיום, להוסיף 10 מ"ל של DMEM טרי עם FBS 2% לכל מנה, ו דגירה אותם 10% CO 2 ו 37 ° CO / N.
    6. איסוף supernatant הראשון מן המנות. להוסיף 10 מ"ל של DMEM טרי עם FBS 2% על כל מנה. דגירה מנות O / N ב 10% CO 2 ו 37 מעלות צלזיוס. אחסן את supernatant על 4 מעלות צלזיוס.
    7. איסוף supernatant השני מן המנות. פינה את supernatant מן היבול הראשון ושני. נקה את supernatant של פסולת תא על ידי סינון דרך מסנן 0.4 מיקרומטר. השתמש supernatant פינה ישירות או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.
  4. לקבוע את כייל של lentivirus על ידי הדבקת HEK293T תאים עם דילולים סדרתיים של הכנה וירוס, כפי שדווח בעבר 25 .

6. באופן ספציפי Modulation הכללת אקסון ואת השימוש האלטרנטיבי של אתרי ספליט עם ESFs

  1. זרע 2 x10 5 תאים HEK293T לתוך כל היטב של צלחת 24 גם. לגדל את התאים לילה μL 500 של DMEM בתוספת FBS 10% ב חממה humidified ב 37 ° C ו 5% CO 2 .
  2. מערבבים את מגיב transfection liposomal ידי הפיכת בעדינות את הבקבוקים לפני השימוש. לדלל 2 μL של מגיב transfection ליפוזומלי μL 50 של בינוני בסרום מופחת. מערבבים בעדינות דגירה אותם 5 דקות ב RT.
  3. לדלל 0.04 מיקרוגרם של pGL-Gly-PUF וקטורים ביטוי 0.2 מיקרוגרם של פלסמידים כתב pGZ3 μL 50 של המדיום בסרום מופחת בצינור סטרילי. מדולל 0.4 מיקרוגרם של וקטורים ביטוי pGL-RS-PUF ו 0.2 מיקרוגרם של פלסמידים הכתב pGZ3 μL 50 של המדיום בסרום מופחת בצינור סטרילי. דIlute 0.4 מיקרוגרם של וקטורים ביטוי pGL-RS-PUF ו 0.2 מיקרוגרם של pEZ-1B או pEZ-2F פלסמידים כתב μL 50 של המדיום בסרום מופחת בצינור סטרילי.
  4. לאחר 5 דקות הדגירה ב RT, לערבב בעדינות את מגיב transfection מדולל liposomal מוכן בשלב 6.2 עם פלסמידים מדולל מוכן בשלב 6.3. לדגור את התערובת במשך 20 דקות ב RT.
  5. הוסף את תערובות transfection כולו המכיל את וקטורים הביטוי מגיב transfection מוכן בשלב 6.4 לכל היטב דגירה של לפחות 12 שעות חממה humidified ב 37 ° C ו 5% CO 2 .
  6. לאחר 12 שעות חממה humidified ב 37 ° C ו 5% CO 2 , להשליך את המדיום מכל היטב ולשטוף אותם עם 500 μL של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS) / טוב.
  7. מחק את PBS ולהוסיף 200 μL של טריפסין לכל טוב. לדגור את הצלחת בחממה humidified ב 37 ° C ו 5% CO 2 במשך 5 דקות. הוסף 1 מ"ל של המדיום כדי לעצור את diGestion ולהעביר את התאים לצינור 1.5 מ"ל סטרילי.
  8. בצנטריפוגה צינורות עבור 3 דקות ב 5000 XG וזורקים את המדיום. להוסיף 0.5 מ"ל של מיצוי חיץ RNA לכל צינור כדי lyse התאים על ידי pipetting חוזרות. דגירה דגימות הומוגני במשך 5 דקות.
  9. עבור מדגם חיץ שטופלו מיצוי RNA, להוסיף 0.1 מ"ל של כלורופורם לכל 0.5 מ"ל של מיצוי חיץ RNA. להפוך את הצינורות עבור 15 s דגירה אותם במשך 3 דקות ב RT.
  10. בצנטריפוגה צינורות עבור 15 דקות ב XG 12,000 ו 4 מעלות צלזיוס. מעביר את השלב המימי לצינור טרי. להוסיף 0.25 מ"ל של isopropanol לכל 0.5 מ"ל של מיצוי חיץ RNA המשמש הומוגניזציה הראשונית.
  11. מערבבים על ידי vortexing ו דגירה אותם RT עבור 10 דקות. בצנטריפוגה צינורות ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 °. לאחר צנטריפוגה, משקע RNA הוא בדרך כלל גלוי על החלק התחתון של הצינור.
  12. בטל supernatant ולשטוף גלולה RNA עם 0.5 מ"ל של אתנול 75% לכל 0.5 מ"ל של מיצוי חיץ RNA.
  13. וורטקס במרץ צנטריפוגות אותו 7500 XG במשך 5 דקות ב 4 °. הסר את supernatant ומייבשים גלולה RNA. ממיסים את RNA ב 50 μL של RNase ללא מים.
  14. להוסיף 2 μL של 5U / μL DNase אני, 7 μL של 10x חיץ, ו 11 μL של H 2 O לכל פתרון 50-μL RNA. דגירת הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. מחממים אותם 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להשבית DNase.
  15. עבור כל דגימה, מוסיפים את הרכיבים הבאים אל צינור nuclease- חופשית 0.2 מ"ל: 1 μL של 50 מיקרומטר אוליגו dT, 5 μL של 400 ng / μL RNA (2 מיקרוגרם), 1 μL של 10 מ"מ dNTP, ו 3 μL של H 2 O. בצע ההפך PCR.
    1. מחממים את התערובת עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו דגירה אותו על קרח דק 2 לפחות כדי למנוע את הרפורמציה של המבנה המשני. מוסיפים את הרכיבים הבאים לאותו צינור: 4 μL של 5x חיץ הראשון גדיל, 1 μL של 0.1 M DTT, 1 μL של 200 U / μL הפוכה טרנסקריפטאז, ו 4 μL של H 2 </ Sub> O. מערבבים על ידי pipetting בעדינות למעלה ולמטה ו דגירה על 50 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. עצור את התגובה על ידי חימום אותו ב 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  16. עבור כל מדגם, להוסיף את המרכיבים הבאים לצינור PCR על מנת להשלים את הגוף שכותרתו PCR: 2.5 μL של חיץ PCR 10x, 0.5 μL של 10 dMTP mM לערבב, 1 μL של 10 מיקרומטר קדימה תחל, 1 μL של 10 מיקרומטר פריימר הפוך, 0.25 μL של 5 U / μL פולימרז DNA Taq, 0.5 μL של 25 ננומטר Cy5-dCTP, ו 2 μL של cDNA מוכן בשלב 6.15.
    1. מחממים את התגובה ל 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי להכחיש את המולקולות, לבצע 25 מחזורים של PCR (94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס 30 שניות, ו 72 מעלות צלזיוס 30 שניות), לשמור על התגובה ב 72 מעלות צלזיוס עבור 7 דקות, ולאחר מכן להשאיר אותו ב 4 ° C להחזיק.
  17. לפתור את מוצרי ה- PCR על ידי אלקטרופורזה באמצעות ג'ל polyacrylamide 10% עם בסיס Tris 1x, חומצה בורית, חיץ EDTA (TBE). בצע סריקה באמצעות סורק פלואורסצנטי. למדוד אתהסכום של כל איזופורם שחבור באמצעות תוכנת צפיפות.

7. השתמש ESF לווסת שחבור אנדוגני Bcl-x ומדוד השפעותיו על אפופטוזיס

  1. פלייט 2 x 10 5 תאים הלה היטב בכל צלחת 24-היטב. לגדל את התאים לילה 500 μL של DMEM בתוספת 10% FBS באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2.
  2. לאחר 12 שעות, transfect התאים עם 2 מיקרוגרם של PGL-גלאי-PUF (WT) או 0.2 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם, ו 2 מיקרוגרם של PGL-גלאי-PUF (531) (תחום PUF לתכנות מחדש שמכירה Bcl-x מראש mRNA עם זיקה גבוהה, ראה איור 2 א).
  3. 24 h מאוחר, לקצור את התאים. 1/3 של התאים הם עבור בידוד RNA וניתוח PCR (שלבי 6.8 - 6.17) ו 2/3 הם עבור בידוד החלבון.
  4. לניתוח כתם המערבי, להרתיח את כדורי תא סך 2X נתרן Dodecyl סולפט-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) חיץ טעינה עבור 10 דק ', ולאחר מכן לפתור את החלבונים בתוך ג'ל 12% SDS-PAGE. מעבירים את החלבונים על גבי קרום nitrocellulose.
  5. חסום את הממברנה עם חלב 5% עבור 1 ש 'ב RT דגירת הממברנה O / N עם caspase-3 (1: 1000), PARP (1: 1000), או יקטין בטא (1: 5000) נוגדנים ראשוניים (מדוללת 5% חלב) ב 4 ° C..
  6. לשטוף את הממברנה עם PBS המכיל 0.1% Tween 20 (PBS-T) עבור 5 דקות ב 3x RT על שייקר נדנדה. דגירה הממברנה עם נוגדנים צמודים HRP (1: 5000, מדולל בחלב 5%) עבור 1 ש 'ב RT.
  7. לשטוף את הממברנה עם PBS-T 3x ב RT, ולאחר מכן לפתח את הממברנה באמצעות ריאגנטים זיהוי סופג ECL המערב.
  8. הוספת 250 μL של פולי- L- ליזין (PLL) על coverslips, דגירה אותם במשך 15 דקות ב RT, וגם לשאוב את הנוזל. שטוף את coverslips הזכוכית PLL מצופה עם PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד. עבור assay immunofluorescence מדידת אפופטוזיס, זרע 5 x 10 5 תאים הלה על coverslips זכוכית פולי-מצופה-ליזין צלחת 6-היטב. Transfect pGL-גלאי-PUF (WT) או PGL-גלאי-PUF (531) פלסמידים לתוך תאים הלה באמצעות מגיב transfection liposomal (ראה שלבים 6.1 - 6.5).
  9. 24 שעות לאחר transfection, לתקן את התאים על coverslips עם 1 מ"ל של 4 paraformaldehyde% (PFA) ב 1x PBS עבור 20 דקות ב RT. זהירות: PFA רעיל; להתמודד עם זה בזהירות במנדף.
  10. לשטוף בעדינות את התאים על coverslips ידי הוספת 2 מ"ל של 1x PBS. דגירה אותם במשך 5 דקות. הסר את PBS עם טפטפות. חזור על לשטוף 3x.
  11. Permeabilize התאים עם 0.2% Triton X-100 ב 1x PBS עבור 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם 3x עם 1x PBS.
  12. חסום את התאים עם 3% שור סרום אלבומין (BSA) ב 1x PBS עבור 10 דקות ולשטוף אותם 3x עם 1x PBS.
  13. לדלל את הדגל נוגדן 1: 1000 ב 3% BSA / PBS ו pipet 30 μL של נוגדן FLAG מדולל על סדין parafilm.
  14. קח את coverslip עם תאים, בזהירות לייבש את עודפי חיץ עם מגבונים במעבדה, ולשים אותו הפוך (בצד התא למטה) על 30 μL אנטי-FLAG יםזהירות. דגירה זה במשך שעה 1 ב RT.
  15. הוסף כ 500 μL של 1x PBS לצד coverslip מודגרות עם הנוגדן העיקרי עד צף coverslip על גבי הפתרון. להחזיר אותו צלחת 6-היטב עם 1x PBS בבארות.
  16. לשטוף אותו 3x עם 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
  17. לדלל את נוגדנים אנטי עכבר משני (1: 500) ב 3% BSA / PBS; שוב, להשתמש 30 μL עבור כל coverslip. שים את coverslip הפוך הפוך על פתרון נוגדנים משני דגירה זה 15 דקות ב RT.
  18. הסר את coverslip מ parafilm, כמתואר בשלב 7.15. שים אותו בחזרה צלחת 6-היטב ולשטוף אותו עם 1x PBS 3x במשך 5 דקות כל אחד.
  19. הר coverslips עם המדיום גובר (עם DAPI), להסיר את המדיום עודף, ואת החותם את הקצה עם לק.
  20. דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (בהגדלה 100X) ולצלם אותם באמצעות מצלמה דיגיטלית.
    הערה: הביטוי של ESF הוא דמיינו על ידי פלואורסצנטי-labeleנוגדנים משני ד נגד תג הדגל, ואת הפיצול הגרעיני היא דמיינו באמצעות מכתים DAPI.

8. מדוד את אפופטוזיס של תאים סרטניים המביאים לידי ביטוי את ESF

  1. פיצול 2 x 10 6 תאים הלה, תאים מד"א- MB-231, ותאי A549 לתוך מנות 60 מ"מ עם 4 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2 לזהות אפופטוזיס עם Propidium מכתים יודיד (PI).
  2. 24 h מאוחר, לרענן את המדיום ולהכין את lentivirus, כפי שדווח בעבר 24.
  3. לדלל 10 x 10 6 lentivirus pWPXld-גלאי-PUF (WT), pWPXld-גלאי-PUF (531), או pWPXld-GFP מניות לתוך 4 מ"ל של מדיום חדש כדי להפוך את היחס של וירוס למספר התא שווה 5.
  4. שינוי המדיום הצלחות 4 מ"ל של מדיום המכיל וירוס מוכן בשלב 8.3 דגירה הצלחות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2. 12 שעות לאחר ההדבקה, לשנות את המדיום.
  5. לאחר 24 שעות של זיהום, לאסוף כתם התאים במשך 5 דקות ב PBS פתרון המכיל ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​PI.
  6. לנתח את תאים מוכתמים PI עם cytometer זרימה, כמתואר לעיל 16 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דו"ח זה מתאר את הפרוטוקול המלא לתכנון והבנייה של ESFs וכתבי שחבור. זה גם מתאר את היישום הנוסף של ESFs לעשות מניפולציה של AS של גני אנדוגניים 16. כדי להמחיש את תוצאות טיפוסיות של שינויי שחבור בתיווך ESF, אנחנו משתמשים בנתונים מהעבודה הקודמת שלנו כדוגמא. ESFs עם תחומים פונקציונליים שונים שניתן להשתמש בהם כדי לקדם או לעכב הכללת אקסון קלטת היעד (איור 1 D & E). ESFs יכול גם להשפיע על השימוש של 5' אלטרנטיבה ו 3' אתרי שחבור במערכת הכתב (איור 1 F & G).

השחבור החלופי של גן אנדוגני יכול גם להיות מוסדר באופן ספציפי עם ESFs מעצב. הוכחנו יישום זה על ידי המפרטifically מיקוד-x Bcl, אשר ניתן וארוג שני isoforms אנטגוניסטית עם 5' אלטרנטיבה אתרי השחבור. אנחנו עצבנו ESF, גלאי-PUF (531), שמכיר אלמנט RNA 8-NT בין אתרי שחבור 5' האלטרנטיבה. הגלאים-PUF (531) זה דווקא העביר את השחבור לקראת ההפקה של Bcl-XS (איור 2 א). לאחר transfecting הגלאי-PUF (531) לתאי הלה, רמת isoforms Bcl-XS ו Bcl-XS החלבונים מוגברים באופן תלוי מינון, ואילו ESF מלא, גלאי-PUF (WT), לא השפיע על היחס של Bcl-XS עד Bcl-XL (איור 2 B & C). בנוסף, ESF מעצב יכול לגרום המחשוף של caspase 3 ו פולי (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP), שני סמנים מולקולריים ידועים של אפופטוזיס (איור 2 ד). כצפוי, ESFs המעצב מרוכז בעיקר הגרעינים של תאי טרנספקציה, כמו הדגמהNstrated ידי מיקרוסקופ immunofluorescence ( איור 2 E ). באופן עקבי, שינוי החבורות על ידי גלאי- PUF (531) גרמה לפרגמנטציה של דנ"א גרעיני, דבר המעיד על כך שתאים אלה עוברים אפופטוזיס ( איור 2 ה ). הגידול של תאים אפופטוטיים אושרה עוד יותר על ידי בחינת יותר מ 200 תאים משדות שנבחרו באופן אקראי על ידי כימות אחוז התאים עם DNA גרעיני מקוטע ( איור 2 F ).

איור 1
איור 1 : עיצוב ESFs ופעילותם בוסתון אקסון. ( א ) מחייב ספציפיות בין תחום PUF לבין מטרות RNA מודגם עם מבנה RNA-PUF ותרשים סכמטי. קוד PUF מחייב עבור כל אחדארבעה בסיסי RNA, שמוצג בצד ימין עם צבעים שונים, משמש לעיצוב מוטציות PUF. ( B ) תרשים זרימה כדי להשיג תחום PUF מותאם אישית. PUF שמכיר "UGUAUAUA" שימש כדוגמה. 4-סיבוב אסטרטגיה PCR משמש להרכיב פיגום PUF עם ספציפיות RNA מחייב ספציפיות (צבע מקודד דומה פאנל א). בסבב הראשון, סדרה של primers PCR המשלבים את קודי זיהוי הרנ"א הרצוי עבור שני חזרות PUF סמוכים משמשים ליצירת ארבעה שברי הכוללים את שמונה קודי זיהוי RNA של חלבון PUF מלא (R1 / R2, R3 / R4 , R5 / R6, ו- R7 / R8). שברי כובע קידוד אותות לוקליזציה גרעיני מסוף N, קודון להפסיק C- מסוף, ואת שברי הגשר מיוצרים גם בנפרד (5'-end ו 3 'סוף שווי, גשר 2/3, גשר 4/5, ואת הגשר 6 / 7). בסיבוב השני, תבניות חדשות נוצרות על ידי ערבוב שברי חופפים המקודדים עם חזרות סמוכות עם הגשר המתאים ( לדוגמה, ערבוב R1 / R2,R3 / R4, ואת הגשר 2/3 מייצר את התבנית עבור R1 - 4) ולאחר מכן הארכת עם פולימראז DNA למלא את הפערים. באופן דומה, בסיבוב השלישי מצטרף R1-4, R5-8, ואת הגשר 4/5. לבסוף, את הסיבוב הרביעי מוסיף את סוף 5'ו -3 'סוף כובעים של תחום PUF יחד עם אתרי שיבוט עבור שיבוט הבאים כדי ביטוי וקטורים. ( ג ) ארגון תחום מודולרי של ESFs. ESFs מונעים על ידי מקדמי CMV (חץ) ומקודדים, מה- N- אל C- מסוף: epitope הדגל (לזיהוי ESFs), מודול פונקציונלי (תחום עשיר Gly או תחום RS), NLS (להקל על לוקליזציה הגרעיני של ESFs), ו RNA הכרה תחום (תחום PUF). NH אני ו BAMH אני נועדו להכניס מודול פונקציונלי, בעוד XBA אני סאל אני מתוכננים להכניס תחום הכרה RNA. ( ד ) ESFs Gly-PUF הם שיתוף הביע עם אקסון דילוג על כתבים, ואת דפוס שחבור assayed ידי RT-PCR. PUF שונה b לכבול באופן ספציפי את היעדים של 8-A ו- B, בהתאמה (באותם צבעים). כל השילובים משמשים, כך זוגות היעד PUF של צבע שונה לשמש את הפקדים. ההשפעות של RS-PUF על אקסון דילוג ( E ), המתחרים 5 'אתר ספליס ( F ), או המתחרה 3' כתם באתר התבנית ( G ) היו assayed על ידי שיטות דומות פאנל ד הנתונים של RT-PCR הם מ Wang et al. 16 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 : תקנה של אנדוגני Bcl-x מראש mRNA שחבור עם ESFs. ( א ) סכמטי של שחבור חלופי של אנדוגני Bcהרנ"א הראשוני LX. שני 5' אלטרנטיבה אחוי אתר אקסון 2 של Bcl-x משמש ליצירת שני isoforms בגדלים שונים, Bcl-XL ו Bcl-XS. UGUGCGUG רצף בין אתרי השחבור שני 5' נבחרה כיעד ESF, ו WT PUF חוזר 1, 3, ו 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) הם תוכנתו מחדש (כוכביות) להכיר רצף היעד הזה. ESF וכתוצאה המכיל תחום גלאי עשירי מעכב את השימוש ss 5' במורד הזרם (מסומן בחץ אדום). (ב) אפנון של Bcl-x 5' השימוש ss. כמויות שונות של מבנה ביטוי גלאי-PUF (531) הם transfected לתאי הלה. גלאים-PUF (WT) משמש כשלט. שני isoforms של-x Bcl מזוהה עם RT-PCR באמצעות פריימרים מתאימים אקסונים 1 ו 3 של גן Bcl-x. אחוז איזופורם Bcl-XS כימות המוצג בתחתית. (ג) ESFs להשפיע על רמות הביטוי של Bcl-XL ו Bcl-XS. דוגמאות נטענים באותו סדר כמו פאנל B, וכל החלבונים arE זוהה על ידי כתמים המערבי. הביטוי של ESFs מזוהה על ידי נוגדן אנטי דגל, ואת רמת tubulin משמש שליטה. ( D ) כמויות שונות של מבנים ביטוי ESF הם transfected לתוך תאים hella, וכתוצאה מכך את המחשוף של PARP ו caspase 3. דוגמאות מזוהים על ידי כתם המערבי 24 שעות לאחר transfection. רמת האקטין מזוהה כבקרה. ( ה ) לוקליזציה subcellular של ESFs בתאי hefa transfected מזוהה על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עם נוגדן אנטי דגל. התאים הם מוכתמים עם DAPI להראות את הגרעינים. גרעינים מסוימים, במיוחד בתאים transfected עם Gly-PUF (531), הם מקוטעת בשל אפופטוזיס. בר סולם: 5 מיקרומטר. ( F ) אחוז תאים אפופטוטיים ( כלומר תאים עם DNA גרעיני מקוטעת) נמדדים מתוך שדות שנבחרו באקראי של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הברים מציינים את הממוצע, בעוד הנקודות מציינות את הנתונים משני הניסויים. הצורהS שונה מהדוח הקודם שלנו על ידי Wang et al. 16 בהתאם למדיניות הוצאת הטבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דוח זה מספק תיאור מפורט לתכנון ובנייה של גורמים שחבור מלאכותי שיכולים לתמרן במיוחד את השחזור האלטרנטיבי של הגן היעד. שיטה זו מנצלת את מצב מחייב RNA ייחודי של PUF חוזר לייצר RNA מחייב פיגום עם סגוליות אישית. זה יכול לשמש או להפעיל או לדכא שחבור.

השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא הדור של תחום ה- PUF המתוקן המגדיר את הספציפיות של ESF. פרוטוקול תפירה PCR פותחה אופטימיזציה עבור הדור המהיר של הפיגום PUF. המפתח להצלחתו הוא להתאים את היחס בין תבניות חופפות שונות ל -1: 1: 1. הטיהור של מוצרי ה- PCR לאחר כל סיבוב הוא גם קריטי, כי מוצרים לא מזוקקים עשויים להיות זיהום פריימר מן הסיבוב האחרון. צעד חשוב נוסף הוא assay היחס שחבור באמצעות חצי כמותי RT-PCR. בדרך כלל, גם גבריש להימנע ממחזורי הגברה y, שכן הם עשויים להרוות את תגובת ה- PCR. בניסויים שלנו עם שיתוף ביטוי של כתב שחבור, 20 - 25 מחזורים היו בשימוש שגרתי, אבל זה עשוי להשתנות בהתאם לשפע של mRNA בעת מדידת שחבור של גנים אנדוגניים. כאשר לכמת את isoforms שחבור באמצעות זוג חדש של primers, אנו מציעים כיול ניסוי PCR בכל פעם, כפי שתואר לעיל 16 .

מגבלה פוטנציאלית עם ESFs מעצבים היא ההשפעה שלהם מחוץ היעד, כי הספציפיות נקבעת על ידי מספר חוזר ב פיגום PUF. Wildtype PUF מזהה אתר 8-nt, אשר ניתן להשוות את הספציפיות של siRNA שמזהה את היעד שלה באמצעות "זרע התאמה". עם זאת, מאז כל רצף 8-nt יכול להתרחש פעם במקרה בתמליל 65,000 nt ארוך (4 8 = 65,536), יהיו אחרים תמלילי מחוץ היעד מוכר על ידי המעצב PUF. יעד מחוץ היעדיכול להיות מופחת ect באמצעות PUFs עם חזרות נוספות; עם זאת, זה עדיין שימושי כדי להעריך את הספציפיות מחוץ יעד תופעות של ESFs. כדי למזער תופעות מחוץ יעד פוטנציאליים, את הביטוי של שילוב של ESFs מעצב המרובה ברמה נמוכה עשוי גם להתבצע. במקרה כזה, הגנים במיקוד את עלולים לא להיות מושפע מההיקף הנמוך של ESFs, ואילו השחבור של היעד האמיתי יהיה מושפע ESFs המרובה שפועל בסינרגיה. פתרון זה דומה למה שהחוקרים השתמשו להשתקת גנים עם RNAi, שבו siRNAs ונקווה (כל בריכוז מופחת) הממקדים לאתרים מרובים של mRNA אחת יכולה להקטין את השפעות חוץ-היעד.

השיטה העיקרית האחרת כדי לתפעל AS היא להשתמש אנטיסנס כי התאמה עם אזורים מסוימים של רנ"א הראשוני. לעומת שיטה קיימת זה, ESFs יכול לגרום לתופעות ממושכות בתאי transfected ביציבות. בנוסף, משלוח vivo של ESF יכול לנצל את ארסנל הגוברת של וקטורי ריפוי גנטי, ואילו משלוח in vivo של אנטיסנס קשה מאוד לשלוט. בנוסף, שיטה זו יכולה למנוע שינויים מורכבים ויקרים של oligonucleotides. באמצעות מקדמים שונים מושרים, שליטה מדויקת יותר של ביטוי ESF ב סוגי התאים הנכונים ובזמנים הנכונים עלולה גם להיות מושגת. החסרון העיקרי של שיטה זו הוא סגולי נמוכה יחסית (אתר הכרה 8-NT לעומת אתר הכרה 16 ​​עד 20-NT ב אנטיסנס הטיפוסי).

חוסר וויסות של שחבור חלופי גורם למחלות רבות, כולל סרטן 26, 27. הגנום כולו מחקרים חשפו יותר מ 15,000 וריאנטים אחוי הקשורים גידולים מסוגים שונים של סרטן 28, 29, 30. למשל, אינטרונייםמוטציות באתר של גנים מדכאי גידולים גורמות לעתים קרובות לאירועים מדלגים על אקסון ולייצר חלבונים חריגים העשויים לתרום לגידול בראשית 26 , 31 , 32 . יתר על כן, כמה גורמים שחבור נמצאו overexpressed בסוגי סרטן רבים, אשר תורמת לשינוי התא 33 , 34 , המציין כי גורמים שחבור יכול גם לשחק תפקידים חשובים ביוגנזה סרטן. לכן, בנוסף לספק כלי שימושי כדי לווסת את תפקוד הגן, מניפולציה של שחבור עם ESFs מעצב עשוי לשחזר אירועים שחבור misregulated סרטן, ובכך לספק כלי טיפולי פוטנציאלי. בנוסף, על ידי מיזוג של תחום PUF מעצב עם תחומים פונקציונליים שונים, גורמים מלאכותיים מרובים לתפעל תהליכים שונים של חילוף החומרים RNA יכול להיות מתוכנן. לדוגמה, היתוך של activator translational (GLD2) או נציג translational(CAF1) עם תחום PUF המיוצר גורמים חדשים שיכולים להפעיל או לעכב תרגום mRNA 27 . באמצעות המנהלת העיצוב אותו, שילבנו לא ספציפי RNA endonuclease תחום (PIN) עם סדרה של תחומים PUF מעצב לייצר מלאכותית באתר ספציפי RNA endonucleases (ASREs) הפונקציה אנלוגי באופן אנזימי הגבלת DNA 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01-CA158283 ו NSFC מענק 31400726 ל ZWYW ממומן על ידי תוכנית הכשרונות צעירים אלף הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מעניקה 31471235 ו 81422038). XY ממומן על ידי קרן המדע הפוסט-דוקטורט של סין (2015M571612).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732 (2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 122 גורמי מחייב RNA מלאכותיים הנדסת חלבונים גורמי שחבור שחבור חלופי פיגום PUF חלבוני RNA מחייבים סרטן
הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu,… More

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter