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Genetics

Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

Published: April 26, 2017 doi: 10.3791/54967
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Este informe describe un método bioingeniería para diseñar y construir nuevos factores de empalme artificiales (ASFS) que modulan específicamente el empalme de genes diana en células de mamífero. Este método se puede ampliar para diseñar diversos factores artificiales para manipular otros aspectos del metabolismo del RNA.

Abstract

El procesamiento de la mayoría de los ARN eucariotas está mediado por RNA Binding Proteins (RBPs) con configuraciones modulares, incluyendo un módulo de reconocimiento de ARN, que se une específicamente a la diana pre-mRNA y un dominio efector. Anteriormente, hemos aprovechado el único modo de unión a ARN del dominio PUF en Pumilio humano 1 para generar un andamio de enlace de ARN programable, que se usó para diseñar varias RBPs artificiales para manipular el metabolismo de ARN. Aquí, un protocolo detallado se describe para construir Engineered Splicing Factors (ESF) que están específicamente diseñados para modular el empalme alternativo de los genes diana. El protocolo incluye cómo diseñar y construir un andamio PUF personalizado para un objetivo de ARN específico, cómo construir un plásmido de expresión de ESF fusionando un dominio PUF diseñador y un dominio efector y cómo usar ESFs para manipular el empalme de genes diana. En los resultados representativos de este método, se han descrito también los ensayos comunesde las actividades del FSE utilizando la prensa de empalme, la aplicación de FSE en células humanas cultivadas, y el posterior efecto de los cambios de empalme. Siguiendo los protocolos detallados en este informe, es posible diseñar y generar ESFs para la regulación de los diferentes tipos de splicing alternativo (AS), que proporciona una nueva estrategia para estudiar la regulación de empalme y la función de diferentes isoformas de empalme. Por otra parte, mediante la fusión de diferentes dominios funcionales con un dominio PUF diseñado, los investigadores pueden diseñar factores artificiales que se dirigen a ARN específicos para manipular diversos pasos de procesamiento del ARN.

Introduction

La mayoría de los genes humanos se someten a splicing alternativo (AS) para producir múltiples isoformas con actividades distintas, que ha aumentado en gran medida la complejidad de codificación del genoma 1, 2. AS proporciona un mecanismo importante para regular la función de genes, y está estrechamente regulada a través de diversas vías en diferentes etapas celular y del desarrollo 3, 4. Debido misregulation empalme es una causa común de la enfermedad humana 5, 6, 7, 8, dirigido a la regulación de empalme está convirtiendo en una ruta terapéutica atractiva.

De acuerdo con un modelo simplificado de la regulación de empalme, AS está controlada principalmente por corte y empalme reguladores cis -Elementos (ERE) en pre-mRNA que funcionan como potenciadores de corte y empalme o silenciadores de exones alternativos. ThSREs ESE reclutan específicamente diversos factores de proteínas que actúan en trans (es decir, factores de empalme) que promueven o inhiben la reacción de corte y empalme 3, 9. La mayoría de los factores de empalme activo en trans tienen dominios de unión de ARN específico de secuencia separados de reconocer sus objetivos y dominios efectores para controlar empalme. Los ejemplos más conocidos son los miembros de la (SR) de la familia de proteínas serina / rico en arginina que contienen ARN de reconocimiento de motivos (EMRR), que se unen exonic splicing enhancers y RS C-terminales dominios N-terminales, que promueven la inclusión del exón 10 . A la inversa, hnRNP A1 se une a silenciadores exonic empalme a través de los dominios RRM e inhibe la inclusión del exón través de un dominio rico en glicina C-terminal 11. El uso de este tipo de configuraciones modulares, los investigadores deben ser capaces de diseñar los factores de empalme artificiales mediante la combinación de una específica de unión al ARN de dominio (RBD) con diferentes efecTor que activan o inhiben el empalme.

La clave de tal diseño es utilizar un RBD que reconoce dadas objetivos con ARN programable vinculante especificidad, que es análoga a la ADN vinculante modo de la TALE dominio. Sin embargo, la mayoría de los factores de empalme nativos contienen RRM o K Homología (KH) dominios, que reconocen los elementos cortos de ARN con afinidad débil y por lo tanto carecen de un predictivo de ARN-proteína de reconocimiento "código" 12 . El RBD de PUF proteínas de repetición ( es decir, el dominio PUF) tiene un único modo de reconocimiento de ARN, lo que permite el rediseño de PUF dominios para reconocer específicamente diferentes ARN objetivos [ 13 , 14] . El dominio PUF canónico contiene ocho repeticiones de tres hélices α, cada una de las cuales reconoce una única base en un objetivo de ARN de 8 nt. Las cadenas laterales de aminoácidos en ciertas posiciones de la segunda hélice-α forman enlaces de hidrógeno específicos con el borde de Watson-Crick de tél ARN base, que determina la especificidad de unión de ARN de cada repetición (Figura 1A). El código de reconocimiento de bases de RNA de la repetición PUF es sorprendentemente simple (Figura 1A), lo que permite la generación de dominios PUF que reconocen cualquier combinación posible 8-base (revisado por Wei y Wang 15).

Este principio de diseño modular permite la generación de un empalme Factor Engineered (FSE) que consiste en un dominio PUF personalizado y un dominio de modulación de empalme (es decir, un dominio de SR o un dominio Gly-ricos). Estos ESFs pueden funcionar ya sea como activadores de empalme o como inhibidores para controlar diversos tipos de eventos de empalme, y que han demostrado ser útiles como herramientas para manipular el empalme de genes endógenos relacionados con la enfermedad humana 16, 17. Como un ejemplo, hemos construido ESFs-de tipo Gly PUF para alterar específicamente el corte y empalme del gen Bcl-x, La conversión de la isoforma larga anti-apoptótica (Bcl-xL) a la pro-apoptótica isoforma corta (Bcl-xS). Desplazamiento de la relación de la Bcl-x isoforma era suficiente para sensibilizar a varias células cancerosas a múltiples fármacos de quimioterapia contra el cáncer 16, lo que sugiere que estos factores artificiales pueden ser útiles como reactivos terapéuticos potenciales.

Además de controlar el empalme con dominios de empalme efectoras conocidos (por ejemplo, una RS o Gly-rico de dominio), los factores de PUF ingeniería también se pueden utilizar para examinar las actividades de los nuevos factores de empalme. Por ejemplo, usando este enfoque, hemos demostrado que el dominio C-terminal de varias proteínas SR puede activar o inhibir empalme cuando la unión a diferentes regiones pre-ARNm 18, que el motivo rico en alanina de RBM4 puede inhibir de empalme 19, y que el motivo rico en prolina de DAZAP1 puede mejorar de empalme 20, 21 </ Sup>. Estos nuevos dominios funcionales se pueden utilizar para construir otros tipos de factores artificiales a splicing afinar.

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Protocol

1. Construcción de un andamio PUF con Customized Especificidad de unión al ARN por PCR de solapamiento

  1. Diseñar una serie de cebadores de PCR que contienen las secuencias PUF que reconocen específicamente diferentes nucleótidos de ARN en cada posición 12 (véase la Tabla 1 para las secuencias del cebador y vea la Figura 1 A para la ARN: código de reconocimiento PUF). Para cada repetición PUF, de diseño cuatro cebadores diferentes para reconocer una base diferente en cada posición.
    NOTA: Estos cebadores se utilizan en una serie de cuatro rondas de reacciones de PCR para generar fragmentos PUF que se unen (Figura 1 B).
  2. Seleccionar el sitio de reconocimiento del gen diana cerca del sitio de empalme alternativo.
    NOTA: Este sitio puede ser decidido por el usuario, y por lo general se elige dentro de 10 - 50 nt de los sitios de empalme alternativo.
  3. Ronda 1: Generar secuencias de codificaciónpara las repeticiones 4 PUF, fragmentos puente universales, y fragmentos de capitalización.
    1. Utilizar el sitio de destino para definir el código de reconocimiento para cada repetición de la PUF personalizado. Seleccione el conjunto de cebadores de PCR para PUF repite 1 - 8. Conducta cuatro rondas consecutivas de PCR para producir un dominio PUF personalizada, tal como se describe a continuación (Figura 1 B).
    2. En la primera ronda de PCR, configurar mezclas estándar de reacción de PCR (que contiene 2,5 l de 10x tampón, 0,5 l de dNTPs 10 mM, 0,5 l de 10? M de avance y cebadores, 50 ng de la plantilla de ADN (ADNc humano o vector de expresión revertir de WT dominio PUF), y 0,5 U de alta fidelidad de ADN polimerasa en un volumen final de 25! l).
      NOTA: Estas reacciones producirán secuencias de ADN correspondientes a cada repetición PUF, a fragmentos puente universales, y a dos fragmentos casquillo con diferentes sitios de restricción (Figura 1 B). Una breve lista de plantillas, cebadores, Los productos de PCR y generados usado en esta etapa se muestran en la Tabla 2.
    3. Ajuste el programa de PCR como sigue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, y 15 s a 72 ° C; y 5 min de incubación a 72 ° C. Utilice de alta fidelidad de ADN polimerasa para minimizar mutaciones puntuales durante la PCR.
  4. Ronda 2: generar secuencias de codificación para R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) y R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
    1. Separar los productos de PCR obtenidos en la etapa 1.3.3 utilizando electroforesis con un gel de agarosa al 1,5% (25 min a una tensión constante de 120 V). Gel-purificar todos los productos del tamaño esperado usando un kit de purificación de gel. Use una mezcla diferente de estos productos como molde en las siguientes rondas de PCR.
      NOTA: Mezclar los tres productos de PCR en aproximadamente una relación 1: 1: 1. Por lo general no deben ser cuantificados, siempre y cuando la intensidad de cada producto tiene una apariencia similar en el gel.
    2. Mezclar aproximadamente el 5% de los productos de PCR purificado como una temEn la siguiente ronda de PCR. Alternativamente, cuantifique los productos de PCR purificados usando un espectrofotómetro UV-Vis y utilice 15 ng de cada producto de PCR en la mezcla de molde.
    3. Utilizar productos de PCR purificados R1 / R2, R3 / R4 y Bridge 2/3 como plantillas mixtas y R1-F y R4-R como cebadores. Configure la reacción de PCR como se describe en el paso 1.3 para obtener el producto R1 - 4 de PCR solapado.
    4. Utilizar productos de PCR purificados R5 / R6, R7 / R8 y puente 6-7 como plantillas mixtas y R5-F y R8-R como cebadores para obtener el producto de PCR superpuesto R5-8 ( Figura 1 B ). Ajuste el programa de PCR de la siguiente manera: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C y 30 s a 72 ° C; Y 5 min a 72 ° C. Gel-purificar R1-4 y R5-8.
  5. Ronda 3: Generar secuencias de codificación para R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 sin tapas).
    1. En la tercera ronda de PCR, utilizando el purificado R1-4, R5-8 y Bridge 4/5 como plantillas mixtas y R1-F yR8-R como cebadores, estableció la reacción de PCR como se describe en el paso 1.3 para obtener la superposición de PCR producto R1-8 sin tapas.
    2. Ajuste el programa de PCR como sigue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, y 55 s a 72 ° C; y 5 min a 72 ° C. Gel-purificar el R1-8 sin tapas.
  6. Ronda 4: generar secuencias de codificación para dominios PUF completas.
    1. En la última ronda de PCR, utilizando el R1-8 purificado sin las tapas y las tapas de extremo 5 'y del extremo 3' como plantillas mixtos y Cap-F y Cap-R como cebadores, configurar la reacción de PCR como se describe en el paso 1.3 para obtener los dominios PUF mutados finales.
    2. Ajuste el programa de PCR como sigue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, y 1 min a 72 ° C; y 5 min a 72 ° C.
    3. Gel-purificar los productos de PCR de los dominios PUF reprogramadas finales. Usar estos productos para la construcción del plásmido de expresión FSE en las etapas subsiguientes. Sequrencia la construcción final para verificar las secuencias reprogramadas de dominios PUF.
      NOTA: Cap-F codifica NLS (PPKKKRKV) entre BamH I y los sitios Xba I y Cap-R codifica un codón de parada y el sitio Sal I (sitios de restricción fueron diseñados para la construcción de vectores de expresión de ESFs, Figura 1 C).

2. Construcción de un módulo funcional de ESF

  1. Dos estrategias se utilizan comúnmente para clonar módulos funcionales de ESFs (dominios RS o dominios Gly-ricos): para amplificar estos dominios mediante PCR utilizando ADNc humano total como plantilla (paso 2.2) o para sintetizar directamente los fragmentos de ADN que codifican para diferentes RS o dominios Gly-ricos (paso 2.3).
  2. Uso de PCR para clonar RS dominios desde los residuos 123 - 238 de 9G8 (NP001026854), residuos 180-272 de SRp40 (NP008856), o residuos 117 - 221 de SC35 (NP003007). Clonar dominios Gly-ricos de los residuos 195 a 320 de hnRNP A1 (NP_002127), residuos 203 - 353 de hnRNP A2 (NP112533), o residuos 211 - 378 de hnRNP A3 (NP919223).
    1. Utilice la herramienta de diseño de cebadores NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) o Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) para diseñar cebadores para la clonación de dominios RS o dominios Gly-ricos (módulo funcional de SESF).
      NOTA: El cebador directo contiene una etiqueta FLAG N-terminal después de que el sitio NheI. El cebador inverso contiene un sitio BamH I para la clonación en vectores de expresión (Figura 1 C).
    2. Configurar la reacción de PCR estándar, como se describe en el paso 1.3, para amplificar las RS o dominios Gly-ricos. Ajuste el programa de PCR como sigue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, y 30 s a 72 ° C; y 5 min a 72 ° C.
  3. Clon RS dominios o dominios Gly-ricos a través de la síntesis de ADN directa. En lugar de generar productos de PCR que codifican para los dominios efectores en el paso 2.2, Synthetamaño de un oligonucleótido que codifica un dominio de fragmento corto RS (RSRSRSRSRSRS) o un dominio Gly-rico (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) usando una fuente comercial de oligonucleótidos de ADN.

3. Construcción de plásmidos de expresión FSE

  1. Construir FSE plásmidos de expresión utilizando cualquier vector de expresión.
    NOTA: una construcción de expresión pGL-Gly-MS2 (un regalo de Dr. R. Breathnach del Instituto de Biologie-CHR 11) se utilizó originalmente, que codifica a partir de la N- al C-terminal, un epítopo FLAG, un Gly dominio rico en de hnRNP A1, y la proteína de cubierta de MS2. Por lo tanto, esta construcción de expresión se utiliza como un ejemplo en la siguiente etapa.
    NOTA: Otros vectores de expresión con sitios de clonación múltiple también se puede utilizar, y los pasos de clonación estándar será aplicado para unir los fragmentos juntos.
  2. Digerir 1,5 g de los plásmidos de expresión (pGL-Gly-MS2) mencionados en el paso 3.1 para eliminar el fragmento de proteína de cubierta de MS2. Usar la restricEndonucleasas BamH I y Sal I durante 1 h a 37 ° C. Digerir el módulo de reconocimiento de ESFs (codificación de un NLS y reprogramado PUF dominios, generados en el paso 1.5) con BamH I y Sal I en la misma condición.
  3. Añadir 5 x colorante de carga a las reacciones de digestión de restricción y electroforer lentamente el volumen total con un gel de agarosa al 1,5% que contiene una tinción de gel de ADN durante 40 minutos a 120 V. Purificar con gel los productos digeridos.
  4. Preparar 10 μL de reacciones de ligación con un módulo de reconocimiento purificado de insertos de ESF y ADN de vector de expresión en una relación de 3: 1, 1 μl de ADN ligasa y 1 μl de tampón de ligación 10x. Incubar las reacciones de ligación durante una noche a 4ºC; El constructo resultante expresa una ESF de tipo Gly-PUF (pGL-Gly-PUF) bajo el control de un promotor CMV ( Figura 1C ).
  5. Se elimina el fragmento que codifica el dominio rico en FLAG / Gly con digestión con Nhe I y BamH I durante 1 h a 3ºC7 ° C. Sustitúyala por un fragmento que codifique el dominio RS (generado en el paso 2.2, también digerido por Nhe I y BamH I); La construcción resultante expresa un ESF de tipo RS-PUF ( Figura 1C ).

4. Construcción del reportero de empalme

  1. Sintetizan oligonucleótidos que contienen las secuencias candidatas ( es decir, secuencias diana de dominios PUF) flanqueadas por sitios Xho I y Apa I o sitios Xho I y EcoR I. Se recubren los oligonucleótidos durante 5 min a 55ºC para obtener insertos de doble cadena que contienen los sitios de reconocimiento de los dominios PUF flanqueados por los extremos cohesivos de los sitios Xho I y Apa I o Xho I y EcoR I.
  2. Comience con un reportero de empalme modular 22 previamente descrito, pGZ3, que contiene dos exones de GFP separados por un exón de prueba (exón 12 del IGF2BP1 humano, Ensembl ID ENSG00000159217) y sus acompañamiento intrones.
    NOTA: El exón prueba fue diseñado con los sitios Xho I y Apa I, que pueden ser utilizados para insertar los oligonucleótidos sintetizados que contienen las secuencias candidatas (secuencias diana de dominios PUF). Este reportero empalme modular (pGZ3) se proporciona a través del plásmido repositorio Add-gen.
  3. Digerir el reportero de base pGZ3 (preparado en la etapa 4.2) con las endonucleasas de restricción Xho I y Apa I para 1 h a 37 ° C.
  4. Gel-purificar los productos digeridos tal como se describe en el paso 3.3.
  5. Preparar 10 l de reacciones de ligación con los insertos de doble hebra generados en la etapa 4.1 y el vector digerido pGZ3 generados en la etapa 4.4 en una relación molar 3: 1, 1 l de ADN ligasa, y 1 l de 10x tampón de ligación. Se incuban las reacciones de ligación durante la noche a 4 ° C para obtener el constructing empalme reportero vector pGZ3.
  6. Insertar los insertos de doble hebra generados en la etapa 4.1 en el anteriormente(Utilizando sitios Xho I y EcoR I) y pEZ-2F (usando sitios Xho I y Apa I) 23 , para obtener el reportero 5 'ss competitivo y el reportero 3' ss competidor, como se describe en los pasos 4.3-4.5.
    NOTA: Los dos tipos de reporteros de empalme estarán disponibles a través de Add-gene.

5. Construcción de vectores de expresión lentivirales para el FSE

  1. Establecer la reacción de PCR estándar como se describe en el paso 1.3 para amplificar los ESFs de longitud completa de los vectores de expresión originales (pGL-Gly-PUF o pGL-RS-PUF) con cebadores que contienen sitios Mlu I / Spe I. Ajuste el programa de PCR de la siguiente manera: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C y 1,5 min a 72 ° C; Y 5 min a 72 ° C.
  2. A través de una reacción de digestión, purificación en gel y reacción de ligación, integrar los ESFs en el vector de expresión lentiviral, pWPXLd, entre el Mlu Spe I, tal como se describe en los pasos 3.2-3.4.
  3. Utilice el método de precipitación con fosfato de calcio estándar, como se informó anteriormente 24, para generar los lentivirus mediante cotransfección de células HEK293T por el envasado de los vectores, psPAX2 y pMD2.G, ya sea con pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF ( en peso) (como un control de especificidad), o pWPXLd-GFP (mock).
    1. Seed 5x10 6 células HEK293T en placas de 10 cm y crecer las células durante la noche en 10 ml de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) por placa en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 . Realizar la transfección cuando las células son un 70 - 90% de confluencia.
    2. Preparar la mezcla de plásmido mediante la adición de los tres plásmidos (7.5 g del vector de embalaje, psPAX2; 2,5 g de pMD2.G; y 10 g de o bien pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (en peso) o pWPXLd-GFP) a un tubo de 2 ml.
    3. Añadir 560! L de 0,25 M CaCl2 y 560 μl de 2x solución de BBS al tubo de 2 ml. Se mezcla suavemente varias veces y se incuba durante 15 minutos a TA para preparar la mezcla de transfección.
    4. Añadir todas las mezclas de transfección a los platos de 10 cm. Agitar suavemente los platos e incubarlos durante la noche al 3% de CO 2 y 37 ° C.
    5. Eliminar el medio, agregar 10 mL de DMEM fresco con 2% de FBS a cada plato, e incubarlos a 10% de CO 2 y 37 ° CO / N.
    6. Recoger el primer sobrenadante de los platos. Añadir 10 ml de DMEM fresco con 2% de FBS a cada plato. Incubar los platos O / N a 10% de CO 2 y 37 ° C. Guarde el sobrenadante a 4 ° C.
    7. Recoger el segundo sobrenadante de los platos. Reúna el sobrenadante de la primera y segunda cosecha. Limpiar el sobrenadante de los desechos celulares filtrando a través de un filtro de 0,4 μm. Utilice el sobrenadante limpiado directamente o guárdelo a -80 ° C.
  4. Determinar el título del lentivirus infectando HEK2Células 93T con diluciones en serie de la preparación de virus, como se informó anteriormente 25.

6. Específicamente modulación de inclusión del exón y el uso alternativo de los sitios de empalme con ESFs

  1. Seed 2 x10 5 células HEK293T en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Cultivar las células durante la noche en 500! L de DMEM suplementado con 10% FBS en una incubadora humidificada a 37 ° C y 5% de CO2.
  2. Mezclar el reactivo de transfección liposomal invirtiendo suavemente las botellas antes de su uso. Diluir 2 l de reactivo de transfección liposomal en 50 l de medio de suero reducido. Mezclar suavemente y se incuba durante 5 min a TA.
  3. Diluir 0,04 g de vectores de expresión de pGL-Gly-PUF y 0,2 g de plásmidos informadores pGZ3 en 50 l de medio de suero reducido en un tubo estéril. Diluir 0,4 g de vectores de expresión PGL-RS-PUF y 0,2 g de plásmidos informadores pGZ3 en 50 l de medio de suero reducido en un tubo estéril. reSe obtuvieron 0,4 μg de vectores de expresión pGL-RS-PUF y 0,2 μg de plásmidos reporter pEZ-1B o pEZ-2F en 50 μl de medio de suero reducido en un tubo estéril.
  4. Después de 5 min de incubación a TA, mezclar suavemente el reactivo de transfección liposomal diluido preparado en la etapa 6.2 con los plásmidos diluidos preparados en la etapa 6.3. Incubar la mezcla durante 20 minutos a TA.
  5. Añadir todas las mezclas de transfección que contienen los vectores de expresión y el reactivo de transfección preparados en el paso 6.4 a cada pocillo e incubar durante al menos 12 h en un incubador humidificado a 37ºC y 5% de CO2.
  6. Después de 12 h en una incubadora humidificada a 37ºC y 5% de CO2, desechar el medio de cada pocillo y lavarlos con 500 mu l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) / pocillo.
  7. Deseche el PBS y añada 200 μl de tripsina a cada pocillo. Incubar la placa en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 5 min. Añadir 1 ml del medio para detener el diAdministrar y transferir las células a un tubo estéril de 1,5 ml.
  8. Centrifugar los tubos durante 3 min a 5.000 xg y descartar el medio. Añadir 0,5 ml de tampón de extracción de ARN por tubo para lisar las células mediante pipeteo repetitivo. Incubar las muestras homogeneizadas durante 5 min.
  9. Para cada muestra tratada con tampón de extracción de ARN, añadir 0,1 ml de cloroformo por 0,5 ml de tampón de extracción de ARN. Invertir los tubos durante 15 s e incubarlos durante 3 min a RT.
  10. Centrifugar los tubos durante 15 min a 12.000 xg y 4 ° C. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo. Añadir 0,25 ml de isopropanol por 0,5 ml de tampón de extracción de ARN utilizado para la homogeneización inicial.
  11. Se mezclan agitando vorticialmente y se incuban a RT durante 10 min. Centrifugar los tubos a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, el precipitado de ARN es usualmente visible en el fondo del tubo.
  12. Desechar el sobrenadante y lavar el sedimento de ARN con 0,5 ml de etanol al 75% por 0,5 ml de tampón de extracción de ARN.
  13. Vórtice vigorosamente y centrifugar a 7,500 xg durante 5 min a 4 ° C. Se retira el sobrenadante y se seca la pastilla de ARN. Disolver el ARN en 50 μl de agua libre de RNasa.
  14. Añadir 2 μl de 5U / μL de DNasa I, 7 μL de tampón 10x y 11 μl de H2O a cada solución de 50 μl de ARN. Incubar los tubos a 37 ° C durante 1 h. Calentar a 70 ° C durante 15 min para inactivar la DNasa.
  15. Para cada muestra, añada los siguientes componentes a un tubo sin nucleasa de 0,2 ml: 1 μl de 50 μM de oligo dT, 5 μl de 400 ng / μL de ARN (2 μg), 1 μl de dNTP 10 mM y 3 μl de H 2 O. Realizar la PCR inversa.
    1. Calentar la mezcla a 65 ° C durante 5 min e incubar en hielo durante al menos 2 min para evitar la reforma de la estructura secundaria. Se añaden los siguientes componentes al mismo tubo: 4 μl de tampón de primera cadena 5x, 1 μl de DTT 0,1 M, 1 μL de 200 U / μL de transcriptasa inversa y 4 μL de H2 </ Sub> O. Mezclar pipeteando suavemente arriba y abajo y se incuba a 50 ° C durante 60 min. Detener la reacción por calentamiento a 70 ° C durante 15 min.
  16. Para cada muestra, añadir los siguientes componentes a un tubo de PCR con el fin de completar el etiquetado cuerpo-PCR: 2,5 l de 10x tampón de PCR, 0,5 l de 10 mezcla de dNTP mM, 1 l de cebador directo 10? M, 1 l de 10? M cebador inverso, 0,25 l de 5 ADN Taq U / l polimerasa, 0,5 l de 25 nM Cy5-dCTP, y 2! l del ADNc preparado en la etapa 6.15.
    1. Se calienta la reacción a 94 ° C durante 2 min para desnaturalizar las moléculas, lleve a cabo 25 ciclos de PCR (94 ° C durante 30 s, 60 ° C 30 s, y 72 ° C 30 s), mantener la reacción a 72 ° C durante 7 min, y luego dejarlo en un mantenimiento a 4ºC.
  17. Resolver los productos de PCR por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 10% con una base 1x Tris, ácido bórico, y tampón de EDTA (TBE). Realizar un análisis usando un escáner de fluorescencia. Medir laCantidad de cada isoforma de empalme usando un software de densitometría.

7. Utilizar ESF para modular el empalme Bcl-x endógeno y medir sus efectos sobre la apoptosis

  1. Placa 2 x 105 células HeLa a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Cultivar las células durante la noche en 500 μ l de DMEM suplementado con 10% de FBS en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 .
  2. Después de 12 h, se transfectan las células con 2 μg de pGL-Gly-PUF (WT) o 0,2 μg, 1 μg y 2 μg de pGL-Gly-PUF (531) (un dominio PUF reprogramado que reconoce Bcl-x pre- MRNA con alta afinidad, véase la Figura 2 A ).
  3. 24 h más tarde, cosecha las células. 1/3 de las células son para el aislamiento de ARN y análisis de PCR (pasos 6.8 - 6.17) y 2/3 son para el aislamiento de proteínas.
  4. Para el análisis de transferencia de Western, hervir los gránulos de células totales en tampón de carga 2X Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) durante 10 min, Y luego resolver las proteínas en un 12% SDS-PAGE gel. Transferir las proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa.
  5. Bloquear la membrana con leche al 5% durante 1 h a RT e incubar los anticuerpos primarios de membrana O / N con Caspase-3 (1: 1.000), PARP (1: 1.000) o beta-actina (1: 5.000) 5% de leche) a 4 ° C.
  6. Lavar la membrana con PBS conteniendo 0,1% de Tween 20 (PBS-T) durante 5 minutos a RT 3x en un agitador de balanceo. Incubar la membrana con anticuerpos unidos a HRP (1: 5.000, diluidos en leche al 5%) durante 1 h a RT.
  7. Lavar la membrana con PBS-T 3x a RT, y luego desarrollar la membrana utilizando reactivos de detección Western Blot de ECL.
  8. Añadir 250 μL de poli-L-lisina (PLL) sobre cubreobjetos, incubarlos durante 15 minutos a RT y sifonar el líquido. Lavar los cubreobjetos de vidrio recubiertos con PLL con PBS 3x durante 5 minutos cada uno. Para el ensayo de inmunofluorescencia que mide la apoptosis, siembra 5 x 105 células HeLa sobre cubreobjetos de vidrio revestidos con poli-lisina en una placa de 6 pocillos. Transfect pGLF-Gly-PUF (WT) o pGL-Gly-PUF (531) en las células HeLa usando un reactivo de transfección liposomal (véanse los pasos 6.1 a 6.5).
  9. 24 h después de la transfección, fijar las células en los cubreobjetos con 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x PBS durante 20 min a RT. PRECAUCIÓN: La PFA es tóxica; Manejarlo con cuidado en una campana extractora.
  10. Lavar suavemente las células en los cubreobjetos mediante la adición de 2 ml de 1x PBS. Incubarlos durante 5 min. Retire el PBS con pipetas. Repita el lavado 3x.
  11. Permeabilizar las células con 0,2% de Triton X-100 en 1x PBS durante 10 min, y luego lavarlas 3x con 1x PBS.
  12. Bloquear las células con albúmina de suero bovino al 3% (BSA) en 1x PBS durante 10 min y lavarlas 3 veces con 1x PBS.
  13. Diluir el anticuerpo FLAG 1: 1.000 en BSA al 3% / PBS y pipetear 30 μl del anticuerpo FLAG diluido sobre una lámina de parafilm.
  14. Saque el cubreobjetos con las células, seque cuidadosamente el exceso de tampón con toallitas de laboratorio y colóquelo boca abajo (lado de la celda hacia abajo) sobre los 30 μL anti-FLAG solución. Incubar durante 1 h a TA.
  15. Añadir aproximadamente 500 l de 1x PBS a un lado del cubreobjetos se incubaron con el anticuerpo primario hasta que el cubreobjetos flota en la parte superior de la solución. Volver a la placa de 6 pocillos con 1x PBS en los pocillos.
  16. Lavar 3x con 1x PBS durante 5 min cada uno.
  17. Diluir el anticuerpo secundario anti-ratón (1: 500) en 3% BSA / PBS; de nuevo, utilizar 30 l para cada cubreobjetos. Ponga el cubreobjetos al revés en la solución de anticuerpo secundario e incubar durante 15 min a TA.
  18. Retire el cubreobjetos de la parafina, como se describe en el paso 7,15. Poner de nuevo en la placa de 6 pocillos y se lava con 1x PBS 3x durante 5 min cada uno.
  19. Montar los cubreobjetos con medio (con DAPI) de montaje, eliminar el exceso de medio, y sellar el borde con esmalte de uñas.
  20. Visualizar las células utilizando un microscopio de fluorescencia (con un aumento de 100X) y fotografiarlos usando una cámara digital.
    NOTA: La expresión del FSE se visualiza mediante la fluorescencia de labeled anticuerpo secundario contra la etiqueta FLAG, y la fragmentación nuclear se visualizaron usando tinción con DAPI.

8. Medir la apoptosis de las diferentes células cancerosas que expresan FSE

  1. Dividir 2 x 10 6 células HeLa, células MDA-MB-231, y las células A549 en placas de 60 mm con 4 ml de DMEM suplementado con 10% FBS en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 para detectar la apoptosis con propidio yoduro (PI) tinción.
  2. 24 h más tarde, volver a cargar el medio y preparar el lentivirus, como se informó anteriormente 24.
  3. Diluir (WT), pWPXld-Gly-PUF (531), o pWPXld-GFP stocks-Gly-PUF pWPXld 10 x 10 6 lentivirus en 4 ml de medio fresco para hacer que la relación de virus al número de células igual a 5.
  4. Cambiar el medio en las placas a 4 ml de medio que contiene virus preparado en la etapa 8.3 y se incuban las placas en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2. 12 h después de la infección, cambiar el medio.
  5. Después de 24 h de infección, recoger y teñir las células durante 5 min en una solución de PBS que contenía una concentración final de 2 mg / ml PI.
  6. Analizar las células PI-teñidas con un citómetro de flujo, como se ha descrito previamente 16.

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Representative Results

Este informe describe el protocolo completo para el diseño y construcción de ESF y reporteros de empalme. También describe la aplicación adicional de ESFs en la manipulación del AS de genes endógenos 16. Para ilustrar los resultados típicos de empalme cambios FSE mediada, se utilizan los datos de nuestro trabajo anterior como un ejemplo. El SESF con diferentes dominios funcionales se pueden utilizar para promover o inhibir la inclusión del exón casete de destino (Figura 1 D & E). ESFs también puede afectar el uso de los sitios 5' y 3' de corte y empalme alternativos en el sistema indicador (Figura 1 F y G).

El corte y empalme alternativo del gen endógeno también puede regularse específicamente con ESFs de diseño. Hemos demostrado esta aplicación por espectrometríaifically orientación Bcl-x, que puede ser empalmado en dos isoformas antagónicos con sitios 5' de corte y empalme alternativos. Hemos diseñado un FSE, Gly-PUF (531), que reconoce un elemento de RNA 8-nt entre los sitios alternativos 5' de empalme. Este Gly-PUF (531) cambió específicamente el empalme hacia la producción de Bcl-xS (Figura 2 A). Después de la transfección de la Gly-PUF (531) en células HeLa, el nivel de las isoformas de Bcl-Xs y proteínas Bcl-Xs aumento de una manera dependiente de la dosis, mientras que el FSE control, Gly-PUF (WT), no afectó a la relación de Bcl-xS a Bcl-xL (Figura 2 B y C). Además, el FSE diseñador puede inducir la escisión de la caspasa 3 y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), dos marcadores moleculares conocidos de la apoptosis (Figura 2 D). Como se esperaba, el SESF de diseño se localizan predominantemente en los núcleos de las células transfectadas, como DemoPor microscopía de inmunofluorescencia ( Figura 2 E ). Consistentemente, el cambio de empalme por Gly-PUF (531) causó la fragmentación del ADN nuclear, lo que indica que estas células están sufriendo apoptosis ( Figura 2 E ). El aumento de las células apoptóticas se confirmó aún más mediante el examen de más de 200 células de campos seleccionados al azar y por la cuantificación del porcentaje de células con el ADN nuclear fragmentado ( Figura 2 F ).

Figura 1
Figura 1 : Diseño de los FSE y su actividad en la modulación de saltos de Exón. ( A ) La unión específica entre el dominio PUF y los dianas ARN se ilustra con la estructura ARN-PUF y un diagrama esquemático. El código de unión PUF para cada uno de losCuatro bases de ARN, que se muestra a la derecha con diferentes colores, se utiliza para el diseño de mutaciones PUF. ( B ) Diagrama de flujo para obtener un dominio PUF personalizado. El PUF que reconoce "UGUAUAUA" fue utilizado como ejemplo. Se utiliza una estrategia de PCR de 4 rondas para ensamblar un armazón PUF con una especificidad de unión a ARN personalizada (codificada por color similar al panel A). En la primera ronda, se utilizan una serie de cebadores de PCR que incorporan los códigos de reconocimiento de ARN deseados para dos repeticiones PUF adyacentes para generar cuatro fragmentos que incluyen los ocho códigos de reconocimiento de ARN de una proteína PUF completa (R1 / R2, R3 / R4 , R ^ {5} / R ^ {6}, y R ^ {7} / R ^ {8}). Los fragmentos de tapa que codifican una señal de localización nuclear N-terminal, un codón de terminación C-terminal y fragmentos de puente también se producen por separado (extremo 5 'y extremo 3', puente 2/3, puente 4/5 y puente 6 / 7). En la segunda ronda, se generan plantillas nuevas mezclando fragmentos superpuestos que codifican repeticiones adyacentes con el puente apropiado ( por ejemplo, mezclando R1 / R2,R3 / R4 y el puente 2/3 genera la plantilla para R1 - 4) y luego se extiende con ADN polimerasa para llenar los vacíos. De manera similar, la tercera ronda se une a R1-4, R5-8 y puente 4/5. Finalmente, la cuarta ronda agrega los extremos 5 'y 3' del dominio PUF junto con los sitios de clonación para la posterior clonación a vectores de expresión. ( C ) Organización del dominio modular de los FSE. Los ESFs son impulsados ​​por promotores de CMV (flecha) y codifican, desde el terminal N al C: un epítopo FLAG (para la detección de ESFs), un módulo funcional (un dominio rico en Gly o un dominio RS), un NLS (Facilitando la localización nuclear de ESFs), y un dominio de reconocimiento de ARN (un dominio PUF). Nhe I y BamH I están diseñados para insertar un módulo funcional, mientras que Xba I y Sal I están diseñados para insertar un dominio de reconocimiento de ARN. ( D ) Los ESF de Gly-PUF se co-expresan con reporteros de salto de exón, y el patrón de empalme se ensaya mediante RT-PCR. El PUF modificado b se unen específicamente a los objetivos 8-mer A y B, respectivamente (en los mismos colores). Todas las combinaciones se usan, por lo que los pares PUF-objetivo de diferentes colores sirven como controles. Se ensayaron los efectos de RS-PUF sobre el salto de exón ( E ), el sitio de empalme 5 'competidor ( F ) o el informador de sitio de empalme 3' competidor ( G ) por métodos similares al panel D. Los datos de la RT-PCR Son de Wang et al. 16 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2 : Regulación de Bcl-x endógena pre-mRNA Splicing con FSE. ( A ) Esquema del empalme alternativo de Bc endógenolx pre-mRNA. Dos sitio 5' de corte y empalme alternativo en el exón 2 de Bcl-x se utilizan para generar dos isoformas de diferentes tamaños, Bcl-xL y Bcl-xS. El UGUGCGUG secuencia entre los dos sitios de empalme 5' se selecciona como el objetivo FSE, y WT PUF repite 1, 3, y 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) se reprograman (asteriscos) para reconocer esta secuencia diana. El FSE resultante que contiene un dominio Gly-rico inhibe el uso de la ss 5' de aguas abajo (indicado por la flecha roja). (B) Modulación de uso ss Bcl-x 5' . Diferentes cantidades de la construcción de expresión Gly-PUF (531) se transfectan en células HeLa. Gly-PUF (WT) se utiliza como un control. Dos isoformas de Bcl-x se detectan con RT-PCR usando cebadores correspondientes a los exones 1 y 3 del gen Bcl-x. El porcentaje de la isoforma de Bcl-xS se cuantifica y se muestra en la parte inferior. (C) ESFs afectan a los niveles de expresión de Bcl-xL y Bcl-xS. Las muestras se cargan en el mismo orden como en el panel B, y todas las proteínas arE detectado por Western blots. La expresión de ESFs es detectada por el anticuerpo anti-FLAG, y el nivel de tubulina se utiliza como control. ( D ) Se transfectan diferentes cantidades de constructos de expresión de ESF en células HeLa, dando como resultado la escisión de PARP y caspasa 3. Las muestras se detectan mediante transferencia Western 24 h después de la transfección. El nivel de actina se detecta como un control. ( E ) La localización subcelular de ESFs en células HeLa transfectadas se detecta mediante microscopía de inmunofluorescencia con el anticuerpo anti-FLAG. Las células son co-teñidas con DAPI para mostrar los núcleos. Algunos núcleos, especialmente en células transfectadas con Gly-PUF (531), están fragmentados debido a la apoptosis. Barra de escala: 5 μm. ( F ) El porcentaje de células apoptóticas ( es decir, células con ADN nuclear fragmentado) se mide a partir de campos elegidos aleatoriamente de imágenes de microscopía de fluorescencia. Las barras indican la media, mientras que los puntos indican los datos de los dos experimentos. La figuras se modifican de nuestro informe anterior por Wang et al. 16 de acuerdo con la política de Nature Publishing Group. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este informe proporciona una descripción detallada para el diseño y construcción de los factores de empalme artificiales que pueden manipular específicamente el corte y empalme alternativo de un gen diana. Este método toma ventaja del modo de unión a la ARN única de PUF repite para producir un andamio de unión al ARN con especificidad personalizado. Se puede utilizar para activar o reprimir empalme.

El paso crítico en este protocolo es la generación del dominio PUF reprogramed que define la especificidad de ESFs. Un protocolo de costura de PCR se ha desarrollado y optimizado para la rápida generación del andamio PUF. La clave de su éxito es para ajustar la relación de los diferentes plantillas superpuestas a 1: 1: 1. La purificación de los productos de la PCR después de cada ronda es también crítico, porque los productos no purificados pueden tener contaminación cebador de la última ronda. Otro paso importante es para someter a ensayo la relación de empalme utilizando semi-cuantitativos de RT-PCR. En general, también el hombreciclos de amplificación Y deben evitarse, ya que pueden saturar la reacción de PCR. En nuestros experimentos con la co-expresión de un reportero de empalme, 20 - se utilizan habitualmente 25 ciclos, pero esto puede variar dependiendo de la abundancia del ARNm cuando se mide el empalme de genes endógenos. Cuando la cuantificación de las isoformas de corte y empalme usando un nuevo par de cebadores, sugerimos que la calibración del experimento de PCR en cada ocasión, como se ha descrito previamente 16.

Una limitación potencial con ESFs diseñador es sus efectos fuera de objetivo, debido a que la especificidad está determinada por el número de repeticiones en el andamio PUF. Wildtype PUF reconoce un sitio de 8-nt, que es comparable a la especificidad de un siRNA que reconoce su objetivo a través de "partido semilla". Sin embargo, ya que cualquier secuencia de 8-nt podría ocurrir una vez por casualidad en una transcripción 65000 nt de longitud (4 8 = 65.536), habrá otras transcripciones fuera de objetivo reconocidos por la PUF diseñador. El eff desviadoEct se puede reducir utilizando PUFs con repeticiones adicionales; Sin embargo, sigue siendo útil evaluar la especificidad y los efectos fuera de destino de los FSE. Para minimizar los potenciales efectos fuera del objetivo, también se puede llevar a cabo la expresión de una combinación de múltiples ESFs de diseño a un nivel inferior. En tal caso, los genes no dirigidos pueden no verse afectados por la baja cantidad de ESFs, mientras que el empalme del objetivo real será afectado por los múltiples ESFs que funcionan sinérgicamente. Esta solución es similar a lo que los investigadores usaron en el silenciamiento de genes con RNAi, donde los siRNAs agrupados (cada uno a una concentración reducida) que se dirigen a múltiples sitios de un solo mRNA puede disminuir los efectos fuera de destino.

El otro método principal para manipular AS es utilizar oligonucleótidos antisentido que se emparejan con ciertas regiones del pre-mRNA. En comparación con este método existente, los FSE pueden causar efectos prolongados en células transfectadas de forma estable. Además, la administración in vivo de ESF puede aprovechar el creciente arsenal de vectores de terapia génica, mientras que la entrega in vivo de oligonucleótidos antisentido es muy difícil de controlar. Además, este método puede evitar complicadas y costosas modificaciones de los oligonucleótidos. Utilizando diversos promotores inducibles, también se puede conseguir un control más preciso de la expresión de ESF en los tipos de células correctos y en los tiempos correctos. La principal desventaja de este método es la especificidad relativamente baja (un sitio de reconocimiento de 8 nt frente a un sitio de reconocimiento de 16 a 20 nt en oligonucleótidos antisentido típicos).

La desregulación del empalme alternativo causa muchas enfermedades, incluyendo el cáncer 26 , 27 . Genoma a escala de los estudios han puesto de manifiesto más de 15.000 tumor asociado a las variantes de empalme en varios tipos de cánceres 28 , 29 , 30 . Por ejemplo, intronicmutaciones en sitios de empalme de genes supresores de tumores a menudo causan eventos de omisión de exón y producen proteínas aberrantes que pueden contribuir a la génesis del tumor 26, 31, 32. Por otra parte, se encuentran algunos de los factores de corte y empalme que se sobreexpresa en muchos tipos de cáncer, lo que contribuye a la transformación de células 33, 34, lo que indica que factores de empalme también pueden desempeñar un papel importante en la biogénesis de cáncer. Por lo tanto, además de proporcionar una herramienta útil para modular la función de genes, la manipulación de empalme con ESFs diseñador puede restaurar eventos de empalme misregulated en el cáncer, proporcionando así un potencial herramienta terapéutica. Además, mediante la fusión de un dominio PUF de diseño con diferentes dominios funcionales, múltiples factores artificiales que manipulan distintos procesos de metabolismo de ARN pueden ser diseñados. Por ejemplo, la fusión de un activador de traslación (GLD2) o un representante de traslaciónRESSOR (CAF1) con el dominio PUF producidos factores novedosos que pueden activar o inhibir la traducción del ARNm 27. Usando el mismo principio de diseño, se combinaron un dominio ARN endonucleasa no específica (PIN) con una serie de dominios PUF diseñador para generar endonucleasas artificiales específicos del sitio de ARN (Asres) que funcionan de manera análoga a la restricción de ADN enzimas 17.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01-CA158283 y la subvención NSFC 31400726 a ZWYW es financiado por el Programa de Young Thousand Talents y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 31471235 y 81422038). XY es financiado por la fundación científica postdoctoral de China (2015M571612).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

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