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Genetics

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

Published: April 26, 2017 doi: 10.3791/54967
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University
* These authors contributed equally

Summary

이 보고서는 특히 포유 동물 세포에서 표적 유전자의 스 플라이 싱을 조절하는 신규 한 인공 접합 인자 (ASFs)를 설계하고 구성하는 생명 공학 방법을 설명한다. 이 방법은 RNA 대사의 다른 측면을 조작하는 다양한 인공 요소를 엔지니어에게 확장 할 수 있습니다.

Abstract

대부분의 진핵 생물 RNA의 프로세싱은 pre-mRNA target과 effector domain을 특이 적으로 결합시키는 RNA 인식 모듈을 포함하여 모듈 형 배열을 갖는 RNA Binding Protein (RBP)에 의해 매개된다. 이전에 우리는 인간 Pumilio 1의 PUF 도메인의 고유 한 RNA 결합 모드를 이용하여 RNA 신진 대사를 조작하기 위해 다양한 인공 RBP를 설계하는 프로그래밍 가능한 RNA 바인딩 스캐 폴드를 생성했습니다. 여기에는 세부적인 프로토콜이 구체적으로 표적 유전자의 선택적인 접합을 조절하도록 설계된 공학적 접합 인자 (ESF)를 구축하기 위해 기술되어있다. 이 프로토콜에는 특정 RNA 표적을위한 맞춤화 된 PUF 스캐 폴드를 설계하고 구성하는 방법, 디자이너 PUF 도메인과 이펙터 도메인을 융합시켜 ESF 발현 플라스미드를 구축하는 방법 및 ESF를 사용하여 표적 유전자의 접합을 조작하는 방법이 포함됩니다. 이 방법의 대표 결과에서, 우리는 또한 일반적인 assays를 설명했다스 플라이 싱 리포터를 사용한 ESF 활동, 배양 된 인간 세포에서의 ESF의 적용 및 스 플라이 싱 변화의 후속 효과. 이 보고서의 상세한 프로토콜을 따르면, 다른 유형의 Alternative Splicing (AS)의 조절을위한 ESF를 설계하고 생성 할 수 있으며, 접합 조절 및 다른 접합 이형의 기능을 연구하기위한 새로운 전략을 제공합니다. 또한, 설계된 PUF 영역과 다른 기능 영역을 융합시킴으로써 연구원은 RNA 공정의 다양한 단계를 조작하기 위해 특정 RNA를 표적으로하는 인공 인자를 설계 할 수있다.

Introduction

대부분의 인간 유전자는 스 플라이 싱 (AS)가 크게 게놈 (1, 2)의 부호화 복잡도를 증가 구별 활동 여러 이성체를 제조 겪는다. AS는 유전자의 기능을 조절하는 주요 메커니즘을 제공하며, 밀접 다른 셀룰러 및 발달 단계 3, 4에서 다양한 경로를 통해 조절된다. 접합 misregulation 인간의 질병 5, 6, 7, 8의 일반적인 원인이기 때문에, 접합 규제를 대상으로하는 것은 매력적인 치료 경로가되고있다.

주로 접합 촉진제 또는 대체 엑손 소음기로서 기능 mRNA의 사전에 규정 -Elements 시스 접합 (SRES)에 의해 제어되는 바와 같이, 스플 라이스 규제의 간략화 모델에 따라. 목SREs는 스 플라이 싱 반응을 촉진 또는 억제하는 다양한 트랜스 - 작용 단백질 인자 ( 즉, 스 플라이 싱 인자)를 구체적으로 모집한다 3 , 9 . 대부분의 trans- acting splicing factor는 splicing을 제어하기 위해 타겟과 이펙터 도메인을 인식하기 위해 별도의 서열 특이 적 RNA 결합 도메인을 가지고 있습니다. 가장 잘 알려진 예는 exon splicing enhancer를 결합하는 N- 말단 RNA 인식 모티프 (RRMs) 및 엑손 삽입을 촉진시키는 C- 말단 RS 도메인을 포함하는 세린 / 아르기닌이 풍부한 (SR) 단백질 군의 구성원이다 . 반대로, hnRNP A1은 RRM 도메인을 통해 엑소닉 스 플라이 싱 사일런서에 결합하고 C- 말단 글리신이 풍부한 도메인을 통해 엑손 삽입을 억제한다. 이러한 모듈 형 구성을 사용하여 연구자는 서로 다른 효과를 갖는 특정 RNA 결합 도메인 (RBD)을 결합함으로써 인공적인 접합 인자를 조작 할 수 있어야한다활성화 도메인을 TOR 또는 접합을 억제.

이러한 설계의 핵심은 동화 영역의 DNA 결합 모드 유사 프로그램 RNA 결합 특이성과 함께 대상을 인식하는 소정의 RBD를 사용하는 것이다. 그러나, 대부분의 천연 스플 라이스 인자는 RRM을 포함하거나 이와 친 화성이 약하고 짧은 RNA 요소를 인식하고 K 동성 (KH) 도메인, 예측 RNA 단백질 인식 "코드"(12)이 부족하다. PUF 반복 단백질의 RBD는 (즉, PUF 도메인) (14), 특히 다른 RNA를 인식하는 PUF 도메인의 재 설계를 허용, 독특한 RNA 인식 모드가 13 목표로하고있다. 정규 PUF 도메인은 각각 8 NT의 RNA 표적의 단일 염기를 인식하는 세 개의 α 나선 여덟 반복을 포함한다. t의 왓슨 - 크릭 가장자리 번째 α 나선 형태 특정 수소 결합의 특정 위치에서 아미노산의 측쇄그는 각각의 반복 ( 그림 1A )의 RNA 바인딩 특이성을 결정 RNA베이스. PUF 반복의 RNA 염기 인식을위한 코드는 놀라 울 정도로 간단하며 ( Figure 1A ), 가능한 8 염기 조합을 인식하는 PUF 도메인을 생성 할 수 있습니다 (Wei and Wang 15 ).

이 모듈 형 설계 원리는 맞춤화 된 PUF 도메인과 접합 변조 도메인 ( 예 : SR 도메인 또는 Gly- 풍부한 도메인)으로 구성된 공학적 접합 요소 (ESF)를 생성 할 수있게합니다. 이 ESFs는 스 플라이 싱 액티베이터 (splicing activator) 또는 다양한 유형의 스 플라이 싱 이벤트를 제어하기위한 억제제로서 기능 할 수 있으며, 인간 질병과 관련된 내인성 유전자의 스 플라이 싱을 조작하는 도구로서 유용하다. 예를 들어, Bcl-x 유전자의 스 플라이 싱을 구체적으로 변경하기 위해 PUF-Gly- 유형 ESF를 구축했다(Bcl-xL)을 프로 - 아폽토시스 (pro-apoptotic) 단 이소성 형태 (Bcl-xS)로 전환시키는 것을 특징으로하는 방법. Bcl-x isoform의 비율을 바꾸는 것은 여러 가지 암 세포를 여러 항암 화학 요법 약물에 민감하게 만들기에 충분했으며, 이러한 인공 인자가 잠재적 인 치료 시약으로 유용 할 수 있음을 시사한다.

공지 된 스 플라이 싱 이펙터 도메인 ( 예 : RS 또는 Gly- 리치 도메인)으로 스 플라이 싱을 제어하는 ​​것 외에도, 설계된 PUF 인자를 사용하여 새로운 스 플라이 싱 인자의 활성을 조사 할 수있다. 예를 들어,이 접근법을 사용하여 여러 SR 단백질의 C 말단 도메인이 다른 pre-mRNA 영역 18에 결합 할 때 접합을 활성화하거나 억제 할 수 있다는 것을 보여주었습니다. RBM4의 알라닌이 풍부한 주제는 접합 19 를 억제 할 수 있고, DAZAP1의 프롤린이 풍부한 모티프는 스 플라이 싱을 향상시킬 수있다 20 , 21 </ sup>. 이러한 새로운 기능 영역은 추가적인 유형의 인위적 요인을 구성하여 접합을 미세 조정할 수 있습니다.

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Protocol

사용자 정의와 PUF 비계 1. 건설 PCR 겹치는에 의해 특이성을 RNA가 결합

  1. 즉 각 위치 (12) (: PUF 인식 코드 프라이머 서열은 표 1을 참조하고, RNA는 그림 1 A 참조) 다른 RNA 뉴클레오티드를 인식 PUF 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 디자인 시리즈. 각 PUF 반복, 디자인 네 가지 프라이머는 각각의 위치에 다른 기본을 인식합니다.
    주 : 이들 프라이머 접합 (도 1 B)된다 PUF 단편을 생성하기 위해 PCR 반응의 네 라운드의 연속 사용한다.
  2. 대체 스플 라이스 사이트 근처의 표적 유전자의 인식 사이트를 선택합니다.
    참고 :이 사이트는 사용자가 결정 될 수 있으며, 그것은 일반적으로 10에서 선택 - NT를 대체 스플 라이스 사이트에서 (50).
  3. 1 라운드 : 시퀀스를 코딩 생성4 PUF 반복, 유니버설 브릿지 프래그먼트 및 캡 프래그먼트가 필요합니다.
    1. 대상 사이트를 사용하여 사용자 정의 된 PUF의 각 반복에 대한 인식 코드를 정의하십시오. PUF 반복 1 - 8에 대한 PCR 프라이머 세트를 선택하십시오. 아래에 설명 된대로 ( 그림 1B ) 커스터마이즈 된 PUF 도메인을 생성하기 위해 4 회 연속 PCR을 실시하십시오.
    2. PCR의 첫 번째 라운드에서 표준 PCR 반응 혼합물 (10x 버퍼 2.5 μL, 10 MM dNTP 0.5 μL, 10 μM 정방향 및 역방향 프라이머 0.5 μL, DNA 템플릿 (인간 cDNA 또는 발현 벡터 WT PUF 도메인) 및 0.5 U 고 충실도 DNA 폴리머 라 아제 (최종 부피 25 ㎕).
      참고 :이 반응은 각 PUF 반복, 유니버설 브리지 단편 및 다른 제한 효소 부위가있는 두 개의 캡 단편에 이르는 DNA 서열을 생성합니다 ( 그림 1B ). 템플릿, 프라이머의 간단한 목록이 단계에서 사용 된 생성 된 PCR 생성물을 표 2 에 나타내었다 .
    3. PCR 프로그램을 다음과 같이 설정하십시오 : 95 ℃에서 5 분; 95 ° C에서 30 초, 55 ° C에서 30 초, 72 ° C에서 15 초의 28주기; 72 ° C에서 5 분 배양. 고 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하여 PCR 중 포인트 변이를 최소화하십시오.
  4. 라운드 2 : R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) 및 R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8)에 대한 코딩 순서를 생성하십시오.
    1. 1.3.3에서 얻은 PCR 산물을 1.5 % 아가 로즈 겔 (120V의 일정 전압에서 25 분)으로 전기 영동을 사용하여 분리한다. 겔 정제 키트를 사용하여 예상되는 모든 크기의 제품을 젤 정제하십시오. 다음 PCR 라운드에서 이들 제품의 다른 혼합물을 주형으로 사용하십시오.
      참고 : 세 가지 PCR 제품을 대략 1 : 1 : 1 비율로 혼합하십시오. 그들은 각 제품의 강도가 젤에서 유사하게 보이는 한 일반적으로 정량화 할 필요가 없습니다.
    2. 약 5 %의 정제 된 PCR 산물을 온도PCR의 다음 라운드 플레이트. 대안 적으로, UV-비스 분광 광도계를 이용하여 정제 된 PCR 산물을 정량하고 템플릿 혼합물을 각각 PCR 생성물의 15 NG를 사용한다.
    3. 정제 된 PCR 산물 R1 / R2, R3 / R4 및 다리 2/3 혼합 템플릿과 R1-F 및 프라이머 R4-R을 사용한다. PCR 생성물 R1 겹치는 구하는 단계 1.3에 기재된 바와 같이 PCR 반응을 설정 - 4.
    4. PCR 생성물 R5-8 (도 1 B)를 중첩 수득 혼합 템플릿 프라이머 R5-R8 및 F-R 등의 정제 된 PCR 산물 R5 / R6, R7 / R8, 다리를 사용하여 6-7. 다음과 같이 PCR 프로그램 설정 : 95 ℃에서 5 분; 95 ° C에서 30 초의 28 사이클, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초; 72 ℃에서 5 분. R1-4 및 R5-8을 젤 정화.
  5. 라운드 3 : R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (- 8 개의 캡이없는 R1)에 대한 코딩 서열을 생성한다.
    1. 정제 R1-4, R5-8 및 다리 4/5 혼재 템플릿과 R1-F와 PCR을 이용하여 3 차에서,R8-R을 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 단계 1.3에 설명 된대로 설정하여 중복 PCR 산물 R1-8을 대문자없이 얻습니다.
    2. PCR 프로그램을 다음과 같이 설정하십시오 : 95 ℃에서 5 분; 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 55 초의 28 사이클; 72 ℃에서 5 분. 캡없이 R1-8을 젤 정제하십시오.
  6. 라운드 4 : 완전한 PUF 도메인을위한 코딩 시퀀스를 생성하십시오.
    1. PCR의 마지막 라운드에서, 뚜껑이없는 정제 된 R1-8과 혼합 된 주형으로서 5'- 말단 및 3'- 말단 캡을 사용하고 프라이머로서 Cap-F 및 Cap-R을 사용하여 단계 1.3에서 기술 된 바와 같이 PCR 반응을 셋업한다 최종 돌연변이 PUF 도메인을 얻는다.
    2. PCR 프로그램을 다음과 같이 설정하십시오 : 95 ℃에서 5 분; 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분 28 사이클; 72 ℃에서 5 분.
    3. 최종 재 프로그램 된 PUF 도메인의 PCR 생성물을 겔 - 정제하십시오. 후속 단계에서 ESF 발현 플라스미드의 건설을 위해 이러한 제품을 사용하십시오. 시퀀스PUF 도메인의 재 프로그램 된 서열을 검증하기위한 최종 구조물을 제조한다.
      참고 : Cap-F는 BamH I과 Xba I 사이에 NLS (PPKKKRKV)를 코딩하고 Cap-R은 정지 ​​코돈과 Sal I 사이트를 코딩합니다 (제한 사이트는 ESF의 발현 벡터를 구축하기 위해 설계됨, 그림 1 C ).

2. ESF의 기능적 모듈의 구축

  1. ESF의 기능적 모듈 (RS 도메인 또는 Gly- 풍부한 도메인)을 복제하는 데 두 가지 전략이 일반적으로 사용됩니다 : 전체 인간 cDNA를 템플릿으로 사용하여 PCR로 이러한 도메인을 증폭하거나 (2.2 단계) 다른 RS를 코드하는 DNA 단편을 직접 합성합니다 또는 Gly- 풍부 도메인 (단계 2.3).
  2. PCR을 사용하여 9G8의 잔기 123-238 (NP001026854), SRP40의 잔기 180-272 (NP008856) 또는 SC35의 잔기 117-221 (NP003007)에서 RS 도메인을 복제하십시오. hnRNP A1 (NP_002127)의 잔기 195 - 320, Gly -hnRNP A3 (NP919223) 378 - hnRNP A2 (NP112533) 또는 잔기 211 353 - (S) (203).
    1. 사용하여 NCBI 프라이머 디자인 도구 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 또는 Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)에 대한 프라이머를 설계하기 RS 영역의 Gly 또는 - 풍부 도메인 (ESFs의 기능 모듈)에 클로닝.
      참고 : 정방향 프라이머는 NHE I 사이트 후 N- 말단 FLAG 태그가 포함되어 있습니다. 역방향 프라이머는 발현 벡터로 클로닝하기위한 사이트를 BamHI (도 1 C)을 포함한다.
    2. 단계 1.3에 기재된 바와 같이 또는 RS의 Gly가 풍부한 영역을 증폭하기 위해, 표준 PCR 반응을 설정한다. 다음과 같이 PCR 프로그램 설정 : 95 ℃에서 5 분; 95 ° C에서 30 초의 28 사이클, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초; 72 ℃에서 5 분.
  3. 클론 RS 도메인 또는 직접 DNA 합성의 Gly를 통해 풍부 도메인. 대신 상테 단계 2.2에서 이펙터 도메인에 대한 인코딩 PCR 제품을 생성크기 짧은 단편 RS 영역 (RSRSRSRSRSRS) 또는 DNA 올리고 뉴클레오티드를 상업적 공급원을 사용의 Gly 풍부한 도메인 (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG)를 코딩하는 올리고 뉴클레오티드.

ESF 식 플라스미드 3. 건설

  1. 어떤 발현 벡터를 사용하여 ESF 발현 플라스미드를 구축합니다.
    주 : 표현식 PGL-의 Gly-MS2 (연구소 드 생물학-CHR 11 박사 R. Breathnach에서 선물)를 구성하는 원래 C 말단에 N-하는 FLAG 에피토프하는의 Gly로 인코딩하는 데 사용 된 hnRNP A1의이 풍부한 도메인과 MS2 코트 단백질. 따라서,이 식 구조물은 다음 단계에서 예로서 사용된다.
    참고 : 여러 복제 사이트와 다른 발현 벡터도 사용할 수 표준 복제 단계는 함께 조각을 가입 적용됩니다.
  2. MS2 코트 단백질 단편을 제거하는 단계 3.1에 언급 된 발현 플라스미드 (PGL-의 Gly-MS2) 1.5 μg의 다이제스트. restric를 사용하여37 ℃에서 1 시간 동안 BamH I과 Sal I를 처리 하였다. 동일한 조건에서 BamH I 및 Sal I로 ESF (1.5 단계에서 생성 된 NLS 및 재 프로그램 된 PUF 도메인을 암호화 함)의 인식 모듈을 소화합니다.
  3. 제한 소화 반응에 5x 로딩 염료를 첨가하고 120V에서 40 분 동안 DNA 겔 얼룩이 들어있는 1.5 % 아가 로즈 겔로 전체 부피를 천천히 전기 투석한다. 소화 된 제품을 젤 - 정제한다.
  4. ESF 인서트와 발현 벡터 DNA를 3 : 1 비율로 정제 된 인식 모듈, DNA 리가 제 1 μL 및 10 배 연결 버퍼 1 μL로 10 μL 연결 반응을 준비하십시오. 4 ° C에서 하룻밤 동안 연결 반응을 품어; 생성 된 구조물은 CMV 프로모터 ( 도 1c)의 제어하에 Gly-PUF 형 ESF (pGL-Gly-PUF)를 발현한다.
  5. Nhe I 및 BamH I 분해로 FLAG / Gly- 풍부 도메인을 코딩하는 단편을 3 시간에서 1 시간 동안 제거한다7 ° C. 중계국 도메인을 코딩하는 단편으로 교체한다 (단계 2.2에서 발생도 NHE I 및 I를 BamHI로 분해); 결과적인 구조는 RS-PUF 형 ESF (도 1 C)를 나타낸다.

스 플라이 싱 리포터 4. 건설

  1. 을 XhoI 및 아파 I 사이트 또는을 XhoI과를 EcoRI 사이트에 의해 측면 후보 시퀀스 (PUF 도메인 즉, 대상 시퀀스)를 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 합성. 을 XhoI과 아파 I 또는 I을 XhoI과 EcoRI으로 I 사이트 응집 단부 어귀 PUF 도메인의 인식 부위를 포함하는 이중 가닥 삽입을 얻었다 55 ° C에서 5 분 동안 어닐링 된 올리고 뉴클레오티드.
  2. 이전에 기술 된 모듈러 접합 리포터 테스트 엑손 (인간 IGF2BP1, Ensembl ID ENSG000001의 엑손 (12)에 의해 분리 된 두 개의 GFP를 포함 엑손 22 pGZ3에서 시작59217) 및 그 인접한 인트론.
    참고 : 시험 엑손은 후보 서열 (PUF 도메인의 표적 서열)을 포함하는 합성 올리고 뉴클레오티드를 삽입하는데 사용될 수있는 Xho I 및 Apa I 부위로 조작되었다. 이 모듈러 스 플라이 싱 리포터 (pGZ3)는 플라스미드 저장소 Add-gene을 통해 제공됩니다.
  3. 37 ℃에서 1 시간 동안 Xho I 및 Apa I 제한 효소로 기본 리포터 pGZ3 (단계 4.2에서 제조 됨)을 분해시킨다.
  4. 단계 3.3에서 설명한대로 분해 된 제품을 젤 - 정제하십시오.
  5. 단계 4.1에서 생성 된 이중 가닥 삽입 및 단계 4.4에서 생성 된 절단 된 pGZ3 벡터와 3 : 1의 몰비, 1 μL의 DNA 리가 제 및 1 μL의 10X 연결 버퍼로 10 μL의 연결 반응을 준비합니다. 4에서 밤새 연결 반응을 품어 구성 reporter 벡터 pGZ3를 얻을 수 있습니다.
  6. 단계 4.1에서 생성 된 이중 가닥 삽입물을 이전에 삽입출판 된 기자, 경쟁자 5 's 기자와 경쟁 3's 기자를 얻기 위해 pEZ-1B ( Xho I 및 EcoRI 사이트 사용) 및 pEZ-2F ( Xho I 및 Apa I 사이트 사용) 23 4.3-4.5.
    참고 : 두 유형의 접합 리포터는 Add-gene을 통해 사용할 수 있습니다.

5. ESF 용 렌티 바이러스 발현 벡터의 제작

  1. Mlu I / Spe I 사이트를 포함하는 프라이머와 원본 발현 벡터 (pGL-Gly-PUF 또는 pGL-RS-PUF)에서 전체 길이의 ESF를 증폭하기 위해 표준 PCR 반응을 단계 1.3에서 설명한대로 설정하십시오. PCR 프로그램을 다음과 같이 설정하십시오 : 95 ℃에서 5 분; 95 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1.5 분 28 사이클; 72 ℃에서 5 분.
  2. 소화 반응, 겔 정제 및 라이 게이션 반응을 통해 ESF를 lentiviral 발현 벡터, pWPXLd, Mlu Spe I 사이트를 참조하십시오.
  3. 벡터 인 psPAX2와 pMD2.G를 pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (pWPXLd-Gly-PUF)와 함께 포장하여 HEK293T 세포를 공동 형질 감염시킴으로써 렌티 바이러스를 생성하기 위해 이전에보고 된 24 의 표준 인산 칼슘 침전 방법을 사용한다 wt) (특이성 대조군으로서), 또는 pWPXLd-GFP (모의).
    1. 씨앗 5x10 6 HEK293T 세포 10cm 요리에 37 ° C와 5 % 이산화탄소 2 humidified 인큐베이터에서 접시 당 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 보충 Dulbecco의 수정 이글의 매체 (DMEM) 10 ML에서 밤새 세포를 성장 . 세포가 70 - 90 % 합류 할 때 형질 감염을 수행하십시오.
    2. pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (wt) 또는 10 μg의 pWPXLd-Gly-PUF (10 μg)의 3 개의 플라스미드 (7.5 μg의 패키징 벡터, psPAX2, 2.5 μg의 pMD2.G 및 3 개의 플라스미드 , 또는 pWPXLd-GFP)를 2 mL 튜브에 넣습니다.
    3. 0.25 M CaCl 560 μL 첨가2 ㎖의 튜브에 배 BBS 용액 (2) 560 μL. 가볍게 수회 믹스 형질 감염 혼합물을 제조 RT에서 15 분 정도 배양한다.
    4. 10 cm 요리에 모든 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 부드럽게 요리 소용돌이 3 % CO 2 및 37 ℃에서 밤새 배양 그들을.
    5. 상기 배지를 제거 각 접시에 2 % FBS와 신선한 DMEM 10 mL를 첨가하고, 10 % CO 2 및 37 ° CO / N에이를 부화.
    6. 요리의 첫 번째 상층 액을 수집합니다. 각각의 접시에 2 % FBS 신선한 DMEM 10 ML을 추가합니다. 10 % CO 2 및 37 ° C에서 요리 O / N 부화. 4 ° C에서 뜨는을 저장합니다.
    7. 식기로부터 제 상등액을 모았다. 제 1 및 제 2 수확의 상등액을 풀. 0.4 μm의 필터를 통해 여과하여 세포 파편의 상등액을 취소. 직접 삭제 상층 액을 사용하거나 -80 ° C에서 보관합니다.
  4. HEK2 감염에 의해 렌티 바이러스의 역가를 결정바이러스 준비의 연속 희석와 93T 세포는 이전과 같이 25을보고했다.

6. 특히 모듈 레이팅 엑슨 클루 및 ESFs와 스플 라이스 사이트의 대체 사용

  1. 시드 2 X10 24- 웰 플레이트의 각 웰에 5 개 HEK293T 세포. DMEM 500 μL 하룻밤 세포 성장은 37 ° C, 5 % CO 2의 가습 된 배양기에서 10 % FBS로 보충.
  2. 부드럽게 사용 전에 병을 반전시켜 리포좀 형질 감염 시약을 혼합한다. 감소 된 혈청 배지에 50 μL 리포좀 형질 감염 시약을 2 μL 희석. 부드럽게 섞어 실온에서 5 분 동안 그들을 품어.
  3. 멸균 된 튜브에 감소 된 혈청 배지에 50 μL pGZ3 리포터 플라스미드 발현 벡터 0.04 PGL-의 Gly-PUF의 μg의 0.2 μg의 희석. 멸균 된 튜브에 혈청 감소 배지 50 μL에 pGZ3 리포터 플라스미드 0.4 PUF PGL-RS-발현 벡터 μg의 0.2 μg의 희석. 디PGL-RS-PUF 발현 벡터 및 ilute 0.4 μg의 멸균 튜브 환원 혈청 배지 0.2 페즈-1B 또는 페즈-2F 리포터 플라스미드 μg의 50 μL.
  4. RT에서 5 분 동안 배양 한 후, 부드럽게 단계 6.3에서 제조 한 플라스미드 희석 단계 6.2에서 제조 된 희석 리포좀 형질 감염 시약을 혼합한다. RT에서 20 분 동안 혼합물을 인큐베이션.
  5. 각 웰에 6.4 단계에서 제조 된 발현 벡터 및 트랜 스펙 션 시약을 포함하는 모든 형질 전환 혼합물을 첨가하고 37 ℃에서 가습 인큐베이터에서 12 시간 이상 및 5 % CO 2 부화.
  6. 37 ℃에서 가습 인큐베이터에서 12 시간 및 5 % CO 2 후, 각 웰로부터 배지를 버리고 웰 / 인산 완충 식염수 용액 500 μL (PBS)로 세척.
  7. PBS를 폐기하고 각 웰에 트립신 200 μL를 추가합니다. 5 분 동안 CO 2, 37 ℃의 가습 인큐베이터에서 인큐베이션 플레이트를 5 %. 디를 중지 매체의 1 ML을 추가합니다gestion하고 세포를 멸균 1.5 mL 튜브에 옮긴다.
  8. 튜브를 5,000 xg에서 3 분간 원심 분리하고 배지를 버린다. 반복 pipetting하여 세포를 녹이기 위해 튜브 당 RNA 추출 버퍼 0.5 ML을 추가합니다. 5 분 동안 균질 샘플을 품어.
  9. 각 RNA 추출 완충액 처리 시료에는 RNA 추출 완충액 0.5 mL 당 클로로포름 0.1 mL를 넣는다. 15 초 동안 튜브를 뒤집어 RT에서 3 분 동안 품어 라.
  10. 12,000 XG와 4 ° C에서 15 분 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 수성 상을 새로운 튜브로 옮긴다. 초기 균질화에 사용 된 RNA 추출 버퍼 0.5 mL 당 이소프로판올 0.25 mL를 첨가한다.
  11. vortexing하여 혼합하고 RT에서 10 분 동안 품어 라. 4 ° C에서 10 분 동안 12,000 xg에서 튜브를 원심 분리하십시오. 원심 분리 후, RNA 침전물은 대개 튜브의 바닥에서 볼 수 있습니다.
  12. 상등액을 버리고 RNA 추출 버퍼 0.5 ML 당 75 % 에탄올 0.5 ML로 RNA 펠렛을 씻으십시오.
  13. 격렬하게 소용돌이 원심 분리기는 4 ℃에서 5 분 동안 7,500 XG에. 상층 액을 제거하고 RNA 펠렛을 건조. 의 RNA 분해 효소가없는 물을 50 μL의 RNA를 녹인다.
  14. 각 50 μL RNA 용액 5U / μL의 DNase I, 10 배의 완충액 7 μL 2 μL, 및 H 2 O 11 μL를 추가한다. 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션 튜브. DNase를 불 활성화하기 위해 15 분 동안 70 ° C에서 이들을 가열한다.
  15. 50 μM 1 μL 올리고 DT, 400 ng의 5 μL / μL RNA (2 μg의), 10 mM의 dNTP를 1 μL 및 H의 3 μL : 각 샘플에 대해, 0.2 mL의 클레아없는 튜브에 다음과 같은 구성 요소를 추가 2 O.는 반대 PCR을 수행합니다.
    1. 5 분 동안 65 ℃로 혼합물을 가열하고 이차 구조의 재 형성을 방지하기 위해 적어도 2 분 동안 얼음에 부화. 동일한 튜브에하기 성분을 추가의 4 배 μL 제 가닥 완충액, 0.1 M DTT 1 μL, 1 μL 역전사 200 U / μL로하고, H 2의 4 μL </ sub> O. 부드럽게 위아래로 pipetting하여 혼합하고 50 ° C에서 60 분 품어. 70 ° C에서 15 분간 가열하여 반응을 정지시킨다.
  16. 각 샘플에 대해, 신체 - 라벨 PCR을 완료하기 위해 PCR 튜브에 다음 구성 요소를 추가하십시오 : 2.5 μL의 10X PCR 버퍼, 0.5 μL의 10 MM dNTP 믹스, 1 μL 10 μM 포워드 프라이머, 1 μL 10 μM 역방향 프라이머, 0.25 μL의 5 U / μL Taq DNA 중합 효소, 0.5 μL의 25 nM Cy5-dCTP, 및 단계 6.15에서 제조 된 cDNA 2 μL.
    1. 반응을 94 ℃로 2 분간 가열하여 분자를 변성시키고, PCR (30 초 동안 94 ℃, 30 초, 72 ℃에서 30 초)의 25 사이클을 수행하고, 72 ℃에서 반응을 유지시킨다. 7 분 후 4 ° C에서 정치하십시오.
  17. 1x 트리스 염기, 붕산, 및 EDTA (TBE) 완충액을 갖는 10 % 폴리 아크릴 아미드 겔을 통한 전기 영동에 의해 PCR 산물을 분석한다. 형광 스캐너를 사용하여 스캔을 수행하십시오. 측정밀도 측정 소프트웨어를 이용하여, 각 스 플라이 싱 이소 폼의 양.

7. 사용 ESF는 내생하는 Bcl-X의 접합을 조절하고 세포 사멸에 미치는 영향을 측정하기 위해

  1. 플레이트 (2) 24- 웰 플레이트의 각 웰에 5 × 106 개 HeLa 세포. DMEM 500 μL 하룻밤 세포 성장은 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 10 % FBS로 보충.
  2. 12 시간 후,하는 Bcl-X 사전 인식 2 PGL-의 Gly-PUF (WT)의 μg의 0.2 μg의, 1 μg의, 2 PGL-의 Gly-PUF (531) (a 재 프로그램 PUF 도메인 μg의로 세포를 형질 높은 친 화성을 가진 mRNA의)도 2를 참조.
  3. 24 시간 후에, 세포를 수확. 2/3 단백질 분리 용으로 - 셀 1/3은 RNA 분리 및 PCR 분석 (6.17 68 단계)이다.
  4. 웨스턴 블롯 분석을 위해 2X 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)를 10 분 동안 로딩 버퍼에서의 전체 세포 펠렛을 끓여, 12 % SDS-PAGE 겔에서 단백질을 분해한다. 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 단백질을 옮깁니다.
  5. 실온에서 1 시간 동안 5 % 우유로 멤브레인을 차단하고 멤브레인 O / N을 카스파 제 -3 (1 : 1,000), PARP (1 : 1,000), 또는 베타 - 액틴 (1 : 5,000) 일차 항체 ( 5 % 우유) 4 ° C.
  6. 흔들어 쉐이커에 RT 3 분 5 분 0.1 % 트윈 20 (PBS - T)를 포함하는 PBS로 막 씻으십시오. RT에서 1 시간 동안 HRP 연결 항체 (1 : 5,000, 5 % 우유로 희석)와 막을 품어.
  7. 실온에서 PBS-T 3x로 막을 씻은 다음 ECL Western blotting detection reagent를 사용하여 membrane을 만든다.
  8. coverslips에 폴리 L - 라이신 (PLL) 250 μL를 추가, RT에서 15 분 동안 품어, 액체 떨어져 사이펀. 5 분 각각 PBS 3x로 PLL 코팅 유리 coverslips을 씻으십시오. apoptosis를 측정 immunofluorescence 분석을 위해, 6 - 웰 플레이트에 폴리 - 라이신 - 코팅 유리 coverslips에 5 X 10 5 HeLa 세포를 시드. Transfect pGL-Gly-PUF (WT) 또는 pGL-Gly-PUF (531) 플라스미드를 리포좀 형질 전환 시약을 사용하여 HeLa 세포에 삽입 하였다 (단계 6.1-6.5 참조).
  9. transfection 후 24 시간, RT에서 20 분 1X PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA) 1 ML로 coverslips에 세포를 고정. 주의 : PFA는 독성이 있습니다. 흄 후드에서 조심해서 다루십시오.
  10. 부드럽게 1x PBS 2 ML을 추가하여 coverslips에있는 세포를 씻으십시오. 5 분 동안 그들을 품어. 피펫으로 PBS를 제거합니다. 세 번 씻으십시오.
  11. 10 분 동안 1X PBS에서 0.2 % Triton X-100으로 세포를 침투시킨 다음 1x PBS로 3x 씻어냅니다.
  12. 10 분 동안 1x PBS에서 3 % Bovine Serum Albumin (BSA)으로 세포를 차단하고 1x PBS로 3x 씻으십시오.
  13. FLAG 항체 1 : 1,000을 3 % BSA / PBS로 희석하고 희석 된 FLAG 항체 30 μL를 파라 람 시트에 pipette.
  14. 세포와 coverslip을 꺼내 신중하게 실험실 잎사귀와 초과 버퍼를 건조하고 거꾸로 (셀면 아래로) 30 μL 안티 FLAG s에 넣어해결 방법. RT에서 1 시간 동안 인큐베이션하여.
  15. 커버 슬립은 용액 위에 떠까지 차 항체와 함께 배양 커버 슬립 측으로 1X PBS의 500 μL를 추가한다. 우물에 1X PBS로 6 웰 플레이트에 돌려줍니다.
  16. 이 5 분마다 1X PBS로 3 배 씻으십시오.
  17. 항 - 마우스 이차 항체 (1 : 500) 희석 3 % BSA / PBS하여; 또, 각 coverslip에 30 μL를 사용합니다. 이차 항체 용액의 커버 슬립을 거꾸로 놓고 RT에서 15 분 정도 배양한다.
  18. 단계 7.15에 기재된 바와 같이, 파라 필름에서 커버 슬립을 제거한다. 6- 웰 플레이트에 다시 넣고, 5 분마다 1X PBS 3X 씻는다.
  19. (DAPI)와 매체 마운팅 커버 슬립을 장착 과잉 매질을 제거하고 매니큐어 가장자리를 밀봉.
  20. (100X 배율) 형광 현미경을 이용하여 세포를 시각화하고, 디지털 카메라를 사용하여 사진.
    참고 : ESF의 발현은 형광 labele에 의해 가시화플래그 태그에 대해 D 차 항체 및 핵 분열이 DAPI 염색을 이용하여 가시화된다.

8. ESF를 표현하는 다른 암 세포의 세포 사멸을 측정

  1. 프로피 듐으로 아폽토시스를 검출하는 DMEM mL의 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 10 % FBS가 보충 된 4 60-mm 접시에 2 × 106 개 HeLa 세포, MDA-MB-231 세포 및 A549 세포 분열 요오다 이드 (PI) 염색.
  2. 이전에보고 된 24, 24 시간 후, 배지를 새로 및 렌티 바이러스를 준비한다.
  3. 5 동일 셀 수 바이러스의 비율을 신선한 배지 4 ㎖ 중에 10 × 106 렌티의 pWPXld-의 Gly-PUF (WT) pWPXld-의 Gly-PUF (531) 또는 pWPXld-GFP 주식 희석.
  4. 단계 8.3에서 제조 한 바이러스 - 함유 배지 4 mL의 플레이트에서 배지를 변경하고, 37 ℃, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양 플레이트. 12 시간의 감염 후, 배지를 변경.
  5. 감염 24 시간 후, 수집하고 2 ㎍ / ㎖의 PI의 최종 농도를 함유하는 PBS 용액에서 5 분 동안 세포를 염색.
  6. 이전 16 바와 같이, 플로우 사이토 미터로 PI 염색 된 세포를 분석한다.

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Representative Results

이 보고서는 ESF 및 접합 기자의 설계 및 구성을위한 전체 프로토콜을 설명합니다. 또한 내인성 유전자의 AS 조작에있어 ESF의 추가 적용에 대해 설명한다. ESF 매개 스 플라이 싱 변경의 전형적인 결과를 설명하기 위해 이전 연구의 데이터를 예로 사용합니다. 상이한 기능성 영역을 갖는 ESF는 표적 카세트 엑손 ( 도 1D 및 E )의 포함을 촉진 또는 억제하는데 사용될 수있다. ESFs는 또한 리포터 시스템의 대체 5 '및 3'스플 라이스 사이트의 사용에 영향을 미칠 수 있습니다 ( 그림 1 F & G ).

내인성 유전자의 선택적인 스 플라이 싱은 디자이너 ESF로 특이 적으로 조절 될 수있다. 우리는이 응용 프로그램을 사양으로 시연했습니다.ifically 다른 5 '스플 라이스 사이트와 두 개의 대립 아형으로 접합 할 수있다하는 Bcl-X를, 목표. 우리는 ESF, 대체 5 '스플 라이스 사이트 간의 8 NT를 RNA 요소를 인식의 Gly-PUF (531), 설계. 이러한의 Gly-PUF (531)는 구체적으로하는 Bcl-XS (도 2)의 생산을 향하여 접합 시프트. 제어 ESF 반면, HeLa 세포로의 Gly-PUF (531)하는 Bcl-XS 이성체 및 용량 의존적으로 증가하는 Bcl-XS 단백질의 수준을 형질 감염 후의 Gly-PUF (WT)의 비율에 영향을 미치지 않았다 하는 Bcl-XS의하는 Bcl-XL (도 2 B 및 C)에 관한 것이다. 또한, 디자이너 ESF는 카스파 제 3 및 폴리 (ADP 리보스) 폴리머 라제 (PARP), 아폽토시스 개의 잘 알려진 분자 표지 (도 2 D)의 절단을 유도 할 수있다. 예상대로, 디자이너 ESFs은 주로 데모로, 형질 전환 된 세포의 핵에 지역화면역 형광 현미경 nstrated (도 2 E). 일관의 Gly-PUF 의해 접합 시프트 (531)은 이들 세포가 아폽토시스를 (도 2 E)를 받고 있는지를 나타내는 핵 DNA의 단편화가 발생. 사멸 세포의 증가는 또한 무작위로 선택된 분야에서 200 개 이상의 세포를 검사함으로써 핵 DNA 단편화 (도 2 F)와 세포의 비율을 정량함으로써 확인 하였다.

그림 1
그림 1 : 디자인 ESFs과 변조 엑손 스키핑에서 그들의 활동. PUF 도메인 및 RNA 표적 사이의 바인딩 (A)는 특정 RNA-PUF 구조 및 개략도로 도시된다. 의 각각에 대한 결합 PUF 코드오른쪽에 다른 색상으로 표시된 4 개의 RNA 염기가 PUF 돌연변이를 디자인하는 데 사용됩니다. ( B ) 사용자 정의 PUF 도메인을 얻기위한 플로우 차트. "UGUAUAUA"를 인식하는 PUF가 예제로 사용되었습니다. 4 라운드 PCR 전략은 사용자 정의 RNA 바인딩 특이성 (패널 A와 유사한 코딩 된 색상)와 PUF 발판을 조립하는 데 사용됩니다. 첫 번째 라운드에서는 두 개의 인접한 PUF 반복에 대해 원하는 RNA 인식 코드를 통합 한 일련의 PCR 프라이머를 사용하여 전체 PUF 단백질 (R1 / R2, R3 / R4)의 8 개 RNA 인식 코드를 포함하는 4 개의 단편을 생성합니다 , R5 / R6 및 R7 / R8). N 말단 핵 편재 신호, C 말단 정지 코돈 및 다리 단편을 코딩하는 캡 단편도 또한 별도로 생산된다 (5'- 말단 및 3'- 말단 캡, 다리 2/3, 다리 4/5 및 다리 6 / 7). 두 번째 라운드에서는 인접한 반복을 인코딩하는 겹치는 조각을 적절한 브리지와 믹싱하여 새 템플릿을 생성합니다 ( 예 : R1 / R2,R3 / R4 및 브릿지 2/3는 R1 - 4에 대한 템플릿을 생성 한 다음 DNA 폴리 메라 제로 확장하여 간격을 채 웁니다. 마찬가지로 세 번째 라운드에서는 R1-4, R5-8 및 브릿지 4/5가 조인됩니다. 마지막으로, 네 번째 라운드는 후속 복제를위한 발현 벡터에 대한 클로닝 사이트와 함께 PUF 도메인의 5 '끝 및 3'끝 캡을 추가합니다. ( C ) ESF의 모듈 형 도메인 구성. ESF는 CMV 프로모터 (화살표)에 의해 구동되고 N에서 C- 말단으로 FLAG 에피토프 (ESF 검출 용), 기능 모듈 (Gly- 풍부 도메인 또는 RS 도메인), NLS (ESF의 핵 편재 촉진) 및 RNA 인식 도메인 (PUF 도메인)을 포함한다. Nhe I과 BamH 는 기능적 모듈을 삽입하도록 설계된 반면, Xba I과 Sal I은 RNA 인식 도메인을 삽입하도록 설계되었습니다. ( D ) Gly-PUF ESF는 엑손 스킵 리포터와 함께 발현되고 스 플라이 싱 패턴은 RT-PCR에 의해 분석된다. 수정 된 PUF b는 각각 8-mer 표적 A 및 B에 특이 적으로 결합한다. 모든 조합이 사용되므로 서로 다른 색상의 PUF 타겟 쌍이 컨트롤 역할을합니다. 엑손 스킵 핑 ( E ), 경쟁 5 '스플 라이스 부위 ( F ) 또는 경쟁하는 3'스플 라이스 부위 리포터 ( G )에 대한 RS-PUF의 영향을 패널 D와 유사한 방법으로 분석 하였다. RT-PCR Wang et al. 16 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : ESF로 내인성 Bcl-x pre-mRNA 접합의 조절. ( A ) 내인성 Bc의 선택적인 접합의 개략도lx pre-mRNA. Bcl-x의 엑손 2에있는 2 개의 다른 5 '스플 라이스 부위는 상이한 크기 인 Bcl-xL 및 Bcl-xS의 2 개의 이소 형을 생성하는데 사용된다. 2 개의 5 '스플 라이스 부위 사이의 서열 UGUGCGUG가 ESF 표적으로 선택되고 WT PUF 반복 1, 3 및 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S)는이 표적 서열을 인식하기 위해 재 프로그램된다 (별표). Gly가 풍부한 도메인을 포함하는 생성 된 ESF는 다운 스트림 5의 사용을 억제합니다 (빨간색 화살표로 표시). ( B ) Bcl-x 5의 사용법 조절. 상이한 양의 Gly-PUF (531) 발현 구조물이 HeLa 세포로 형질 감염된다. Gly-PUF (WT)는 대조군으로 사용됩니다. Bcl-x의 2 개의 이소 형은 Bcl-x 유전자의 엑손 1 및 3에 상응하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 검출된다. Bcl-xS 동종 형의 백분율을 정량화하여 하단에 나타내었다. ( C ) ESFs는 Bcl-xL과 Bcl-xS의 발현 수준에 영향을 미친다. 샘플은 패널 B와 동일한 순서로 적재되며 모든 단백질은 ar전자 웨스턴 블롯에 의해 감지. ESFs의 발현은 항 FLAG 항체에 의해 검출되고, 튜 불린 레벨은 대조군으로 사용된다. (D) ESF 식 구조의 상이한 양을 웨스턴 블롯 형질 감염 후 24 시간에 의해 검출 된 PARP 및 카스파 제 3 샘플의 분열 결과 HeLa 세포로 형질 감염된다. 액틴 레벨 제어로 검출된다. (E) 형질 전환 된 HeLa 세포에서의 세포 내 ESFs 제이션은 항 FLAG 항체로 면역 형광 현미경 검사에 의해 검출된다. 세포는 핵을 표시 DAPI와 공동으로 염색된다. 특히의 Gly-PUF (531)로 형질 감염된 세포 핵의 일부는, 세포 사멸에 의한 단편화. 스케일 바 : 5 μm의. (F) 사멸 세포의 백분율 (단편화 된 핵 DNA와 즉 세포) 형광 현미경 이미지를 임의로 선택 필드에서 측정된다. 점은이 실험의 데이터를 나타내는 반면, 막대, 평균을 나타냅니다. 그림Wang et al. 의 초기 보고서에서 수정되었습니다 . 16 자연 출판 그룹의 정책에 따라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 보고서는 구체적으로 표적 유전자의 대체 스 플라이 싱을 조작 할 수있는 인공 접합 요소의 설계 및 구성에 대한 상세한 설명을 제공한다. 이 방법은 사용자의 특이성을 갖는 RNA 결합 골격을 생성하기 위해 반복 PUF의 고유 모드 RNA 결합을 이용한다. 그것은 중 하나를 활성화하거나 접합을 억제하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜의 핵심 단계는 ESFs의 특이성을 정의 reprogramed PUF 도메인의 생성이다. PCR을 봉합 프로토콜 개발 및 PUF 지지체의 빠른 생성을 위해 최적화되었습니다. 1 : 성공을위한 열쇠는 1 서로 다른 중첩 템플릿의 비율을 조정하는 일. 정제되지 않은 제품은 마지막 라운드에서 프라이머 오염이있을 수 있으므로 각 라운드 후 PCR 제품의 정화도 중요하다. 다른 중요한 단계는 반 - 정량적 RT-PCR을 이용하여 접합 비율을 분석하는 것이다. 일반적으로, 너무 사람y 증폭주기는 PCR 반응을 포화시킬 수 있으므로 피해야합니다. 스 플라이 싱 리포터 (splicing reporter)의 동시 발현에 대한 실험에서, 20 - 25 사이클이 일상적으로 사용되었지만 내인성 유전자의 스 플라이 싱을 측정 할 때 mRNA의 풍부성에 따라 달라질 수있다. 새 프라이머 쌍을 사용하여 스 플라이 싱 아이소 폼을 정량 할 때 이전에 설명한 것처럼 매번 PCR 실험을 보정하는 것이 좋습니다 16 .

디자이너 ESF의 잠재적 인 한계는 PUF 스캐 폴드의 반복 횟수에 따라 특이성이 결정되므로 오프 타겟 효과입니다. Wildtype PUF는 "seed match"를 통해 표적을 인식하는 siRNA의 특이성과 비교 가능한 8-nt 사이트를 인식합니다. 그러나 어떤 8-nt 서열이 전사 65,000nt 길이 (4 8 = 65,536)에서 우연히 발생할 수 있기 때문에, 디자이너 PUF가 인정한 다른 off-target transcript가있을 것이다. 오프 - 타겟 eff요법은 추가 되풀이가있는 PUF를 사용하여 줄일 수 있습니다. 그러나 ESF의 특이성과 목표 외 효과를 평가하는 것은 여전히 ​​유용합니다. 잠재적 인 오프 - 타겟 효과를 최소화하기 위해, 더 낮은 레벨에서 다수의 디자이너 ESF들의 조합의 표현이 또한 수행 될 수있다. 그러한 경우에, 표적화되지 않은 유전자는 적은 양의 ESF에 의해 영향을받지 않을 수 있지만, 실제 표적의 스 플라이 싱은 상승 작용으로 작용하는 다중 ESF에 의해 영향을받을 것이다. 이 솔루션은 단일 mRNA의 여러 사이트를 대상으로하는 풀링 된 siRNA (각각 농도가 감소한)가 오프 타겟 효과를 감소시킬 수있는 RNAi로 유전자 침묵에 사용 된 연구자와 유사합니다.

AS를 조작하는 다른 주요 방법은 pre-mRNA의 특정 영역과 쌍을 이루는 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 사용하는 것입니다. 이 기존의 방법과 비교하여, ESFs는 안정적으로 transfected 세포에서 장기적인 효과를 일으킬 수 있습니다. 또한, E의 생체 내 전달안티센스 올리고 뉴클레오티드의 생체 내 전달을 제어하기가 매우 어려운 반면, SF는, 유전자 치료 벡터의 증가 아스날을 이용할 수있다. 또한,이 방법은 올리고 뉴클레오타이드의 복잡하고 비용이 많이 드는 변경을 피할 수있다. 다양한 유도 성 프로모터를 사용하여, 적절한 세포 유형과 정확한 시점 ESF 식의보다 정확한 제어가 또한 달성 될 수있다. 이 방법의 주요 단점은 상대적으로 낮은 특이성 (일반 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 16 내지 20-NT 인식 부위 대 8 NT 인식 부위)이다.

스 플라이 싱의 조절 장애는 암 (26), (27)을 포함하여 많은 질병을 발생합니다. 게놈 차원의 연구는 암 28, 29, 30의 여러 유형에 15,000 개 이상의 종양 관련 스플 라이스 변종을 공개했다. 예를 들어, 인트론종양 억제 유전자의 스플 라이스 부위 돌연변이는 종종 엑손 건너 뛰기를 일으키고 종양 기원 26 , 31 , 32에 기여할 수있는 이상 단백질을 생성합니다. 더욱이 어떤 스 플라이 싱 인자는 세포 변이 33 , 34 에 기여하는 많은 암 유형에서 과발현되어 스 플라이 싱 인자가 암 생체 형성에서도 중요한 역할을 할 수 있음을 보여줍니다. 따라서 유전자 기능을 조절하는 유용한 도구를 제공하는 것 외에도 디자이너 ESF와의 스 플라이 싱 조작은 암에서의 잘못 조절 된 스 플라이 싱 이벤트를 복원하여 잠재적 인 치료 도구를 제공 할 수 있습니다. 또한 디자이너 PUF 도메인을 다른 기능성 영역과 융합시킴으로써 다양한 RNA 대사 과정을 조작하는 여러 가지 인위적인 요인을 설계 할 수 있습니다. 예를 들어, 번역 활성제 (GLD2) 또는 번역 대리인resor (CAF1) PUF 도메인과 mRNA 번역을 활성화하거나 억제 27 수있는 새로운 요인을 생산. 동일한 디자인 원칙을 사용하여 DNA 제한 효소 17와 유사하게 기능하는 인공 부위 특이 적 RNA 엔도 누 클레아 제 (ASRE)를 생성하기 위해 일련의 디자이너 PUF 도메인과 비특이적 RNA 엔도 뉴 클레아 제 도메인 (PIN)을 결합했습니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH 보조금 R01-CA158283 및 NSFC에 의해 ZWYW에 31,400,726는 젊은 천 인재 프로그램 및 국립 자연 과학 중국의 재단 (보조금 31471235 및 81422038)에 의해 자금 지원 허용 지원되었다. XY 중국의 박사후 과학 재단 (2015M571612)에 의해 지원된다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

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References

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인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할
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Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).

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