Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

Published: April 26, 2017 doi: 10.3791/54967
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Bu rapor, özellikle memeli hücrelerinde hedef genlerin eklenmesini düzenleyen yeni Yapay Ekleme faktörler (ASFS) tasarım ve yapı için biyoteknolojik yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem ayrıca, RNA metabolizması diğer yönlerini işlemek için çeşitli yapay faktörleri mühendisi genişletilebilir.

Abstract

Birçok ökaryotik RNA işleme, özellikle ön-mRNA hedef ve efektör alanına bağlanan bir RNA tanıma modülü, aşağıdakileri içeren modüler bir konfigürasyonları ile Proteins (RBPS) bağlanması RNA aracılık eder. Daha önce, bir RNA metabolizmasını değiştirmek için çeşitli yapay RBPS dizayn etmek için kullanılan bir programlanabilir RNA bağlayıcı iskeleti oluşturmak için insan pumilio 1 PUF alan eşsiz bir RNA bağlanma modu yararlanmaktadır. Burada detaylı bir protokol, spesifik olarak hedef genin alternatif eklemeler modüle etmek üzere tasarlanmış Engineered Ekleme faktörler (ESFs) oluşturmak için tarif edilmektedir. protokol tasarım ve nasıl bir tasarımcı PUF alanını ve bir efektör alan eritme ve nasıl hedef genlerin yapıştırma işlemek için ESFs kullanımı ile bir ESF sentezleme plasmidini inşa etmek üzere özel bir RNA hedefi, için özel bir PUF iskele inşa etmek için de içerir. Bu yöntemin temsili sonuçlar, aynı zamanda yaygın deneyleri tanımlamışlardırEkstraksiyon raportörlerini kullanarak ESF faaliyetlerinin, kültürlenmiş insan hücrelerinde ESF'nin uygulanması ve müteakip ekleme etkisi değişir. Bu rapordaki ayrıntılı protokolleri izleyerek, splicing düzenlemesini ve farklı splicing izoformlarının fonksiyonunu incelemek için yeni bir strateji sağlayarak, farklı Alternatif Ekleme (AS) tiplerinin düzenlenmesi için ESF'ler tasarlamak ve üretmek mümkündür. Üstelik, farklı işlev alanlarını tasarlanmış bir PUF alanı ile kaynaştırarak, araştırmacılar, RNA işlemenin çeşitli aşamalarını manipüle etmek için spesifik RNA'ları hedef alan yapay faktörleri mühendislik yapabilir.

Introduction

En çok insan genleri Alternatif Ekleme (AS), büyük ölçüde genom 1, 2 kodlama karmaşıklığı artmıştır farklı faaliyetleri ile birden fazla izoformu üretmek için tabi tutulur. AS gen fonksiyonunu düzenleyen önemli bir mekanizma sağlar ve sıkıca farklı hücresel ve gelişimsel aşamalarda 3, 4 de farklı yollar aracılığıyla düzenlenir. Ekleme düzen bozukluğu insan hastalığı 5, 6, 7, 8 ortak bir nedenidir olduğundan, ekleme düzenleme hedefleyen çekici bir terapötik yol haline geliyor.

Esas olarak birleştirme arttırıcılar ya da alternatif eksonların susturucu işlevi ön mRNA'da -elemanları sis Ekleme Düzenleme (SRE'ler) tarafından kontrol edilir, AS birleştirme düzenlemenin basitleştirilmiş bir modeline göre. thEse SRE , ekleme reaksiyonunu 3,9 destekleyen veya bastıran çeşitli trans- aktive protein faktörlerini ( yani splicing faktörleri) özellikle işe alır. Çoğu trans- aktive edici ekleme faktörü, splicing'i kontrol etmek için hedeflerini ve efektör alanlarını tanımak için ayrı diziye özgü RNA bağlama alanlarına sahiptir. En iyi bilinen örnekler, ekson ekleme arttırıcıları bağlayan N-terminal RNA Tanıma Motifleri (RRM'ler) ve ekson içeriğini teşvik eden C-terminal RS alanlarını içeren serin / arginin açısından zengin (SR) protein ailesinin üyeleridir . Tersine, hnRNP A1, RRM alanları vasıtasıyla eksonik ekleme susturucularına bağlanır ve bir C-terminali glisin bakımından zengindir domain 11 aracılığıyla ekson içerilmesini engeller. Bu gibi modüler yapılandırmaları kullanarak, araştırmacılar, farklı etki ile belirli bir RNA-Bağlama Alanı (RBD) birleştirerek yapay ekleme faktörleri mühendisliği yapabilmelidirBağlamayı etkinleştiren veya engelleyen alanlar.

Böyle bir tasarımın anahtarı, TALE alanının DNA bağlama moduna benzer programlanabilir RNA bağlanma özgünlüğü ile verilen hedefleri tanıyan bir RBD kullanmaktır. Bununla birlikte, çoğu yerli birleştirme faktörü, zayıf afiniteli kısa RNA elementlerini tanıyan RRM veya K Homology (KH) alanlarını içerir ve dolayısıyla bir "RNA-protein" tanıma koduna sahip değildir12. PUF tekrar proteinlerinin RBD'si ( yani PUF alanı), farklı RNA hedeflerini 13 , 14'ü özel olarak tanıması için PUF alanlarının yeniden tasarımına izin veren benzersiz bir RNA tanıma moduna sahiptir. Kanonik PUF alanı, her biri 8 nt'lik bir RNA hedefinde tek bir tabanı tanıyan sekiz tekrarlar içeren üç α-heliks içerir. İkinci α-sarmalın belirli pozisyonlarındaki amino asitlerin yan zincirleri t nin Watson-Crick kenarı ile spesifik hidrojen bağı oluştururo, her tekrarında (Şekil 1A) RNA bağlanma özgüllüğünü belirleyen temel RNA. PUF tekrar RNA baz tanıması için kod olası 8-baz kombinasyonu (Wei ve Wang 15 tarafından incelenmiştir) tanıyan PUF alan üretimi için izin, (Şekil 1A) şaşırtıcı derecede basittir.

Bu modüler tasarım, ilke, özel PUF etki alanı ve bir ekleme modülasyon alan (yani, bir SR alanı ya da bir Gly-zengini domenindeki) oluşan bir Engineered Ekleme Faktörü (ESF) oluşturulmasına olanak sağlar. Bu ESFs ya birleştirme aktivatörleri olarak ya da ekleme olayların çeşitli kontrol etmek için inhibitörleri olarak işlev görebildikleri ve araçlar insan hastalığı 16, 17 ile ilgili endojen genin eklenmesini işlemek için bu da yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bir örnek olarak, spesifik olarak, BCL-X'e geninin yapıştırma değiştirmek için PUF-Gly-tipi ESFs oluşturduk, Anti-apoptotik uzun izoformu (Bcl-xL) pro-apoptotik kısa izoforma (Bcl-xS) dönüştürmek. Bcl-x izoform oranının değiştirilmesi, birçok kanserli hücrenin çoklu anti-kanser kemoterapi ilaçlarına duyarlı hale getirilmesi için yeterliydi16, bu yapay faktörlerin potansiyel terapötik reaktifler olarak yararlı olabileceğini düşündürüyordu.

Bilinen ekleme efektör alanlarıyla ( örneğin, bir RS veya Gly-zengin alan) yapıştırmayı kontrol etmeye ek olarak, yeni ekleme faktörlerinin aktivitelerini incelemek için mühendislik PUF faktörleri de kullanılabilir. Örneğin, bu yaklaşımı kullanarak, birkaç SR proteininin C-terminal alanının, farklı pre-mRNA bölgelerine 18 bağlandığında splicing'i aktive edebileceğini veya inhibe edebildiğini, RBM4'ün alanin açısından zengin motifinin ekleme 19'u engelleyebileceğini ve DAZAP1'in prolin açısından zengin motifi, eklemeyi artırabilir 20 , 21 </ Sup>. Bu yeni işlevsel alanlar, eklemeyi ince ayar yapmak için ek yapay faktörler türlerini oluşturmak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Özel bir PUF iskele 1. İnşaat overlap PCR tekniği ile Özgüllük RNA bağlama

  1. Spesifik olarak her bir pozisyonda 12 (: PUF tanıma kodu primer diziler için Tablo 1 'e bakınız ve RNA için Şekil 1 A) farklı RNA nükleotidleri tanır PUF sekansları ihtiva eden PCR primerleri, bir dizi tasarımı. Her PUF tekrar için, tasarım dört farklı primerler, her pozisyonda farklı bir baz tanıması.
    NOT: Bu primerler, bir araya (Şekil 1 B) PUF parçaları üretmek için PCR reaksiyonlarında dört tur bir dizi kullanılır.
  2. alternatif birleştirme sahasına yakın hedef genin tanıma sitesini seçin.
    NOT: Bu site kullanıcı tarafından karar verilebilir ve genellikle 10 içinde seçilir - NT seçenek eklenti mevkilerinden 50.
  3. Tur 1: dizilerini kodlama üret4 PUF tekrarlar, evrensel köprü parçaları ve kap parçaları için.
    1. Özelleştirilmiş PUF her tekrarlanan tanıma kodunu tanımlamak için hedef sitesini kullanın. Özelleştirilmiş bir PUF alan üretmek üzere PCR'nin 8. Davranış dört ardışık mermi aşağıda tarif edilen (Şekil 1 B), - PUF 1 tekrarlar için PCR primerleri seti seçin.
    2. Birinci PCR turunda, ileri 10 uM, 0.5 uL 10x tampon 2.5 uL, 10 mM dNTP 0.5 ul ihtiva eden standart PCR reaksiyon karışımları (kurmak ve primerler, DNA şablonu, 50 ng (insan cDNA veya ekspresyon vektörü ters bir 25 uL nihai hacim içinde WT PUF alan), ve 0.5 U yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı).
      NOT: Bu reaksiyonlar genel köprü parçaları, her PUF tekrarına tekabül eden DNA sekanslarını üretmek ve farklı restriksiyon bölgelerinin (Şekil 1 B), iki kapak parçalarına olacaktır. şablonlar, astar kısa bir liste, Ve bu aşamada kullanılan üretilen PCR ürünleri Tablo 2'de gösterilmektedir.
    3. PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 95 ° C'de 5 dakika; 95 ° C'de 30 saniye, 55 ° C'de 30 saniye ve 72 ° C'de 15 saniye olmak üzere 28 döngü; Ve 72 ° C'de 5 dakika inkübe edildi. PCR sırasında nokta mutasyonlarını en aza indirgemek için yüksek kaliteli DNA polimeraz kullanın.
  4. 2. tur: R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) ve R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8) için kodlama dizileri oluşturun.
    1. Adım 1.3.3'te elde edilen PCR ürünlerini,% 1.5 agaroz jeli ile elektroforez kullanarak (120 V sabit voltajda 25 dakika) ayın. Jel arıtma kiti kullanılarak beklenen boyuttaki tüm ürünlerin jel ile arındırılması. Aşağıdaki PCR turlarında şablon olarak bu ürünlerin farklı bir karışımını kullanın.
      NOT: Üç PCR ürününü kabaca 1: 1: 1 oranında karıştırın. Her bir ürünün yoğunluğu jelde benzer görünüyorsa, genellikle miktarlarının belirlenmesine gerek yoktur.
    2. Saf PCR ürünlerinin yaklaşık% 5'ini bir toprak olarak karıştırın.Bir sonraki PCR safhasında plakaya. Alternatif olarak, saflaştırılmış PCR ürünlerini bir UV-Vis spektrofotometre kullanarak ölçün ve şablon karışımında her bir PCR ürününün 15 ng'ini kullanın.
    3. Karışık şablonlar olarak saflaştırılmış PCR ürünleri R1 / R2, R3 / R4 ve Köprü 2/3 ve primerler olarak R1-F ve R4-R'yi kullanın. Çakışan PCR ürünü R1-4'ü elde etmek için adım 1.3'te anlatıldığı gibi PCR reaksiyonunu kurun.
    4. Çakışan PCR ürünü R5-8 ( Şekil 1 B ) elde etmek için saflaştırılmış PCR ürünleri R5 / R6, R7 / R8 ve Köprü 6-7'yi karışık şablonlar ve primerler olarak R5-F ve R8-R'yi kullanın. PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 95 ° C'de 5 dakika; 95 ° C'de 30 saniye, 55 ° C'de 30 saniye ve 72 ° C'de 30 saniye olmak üzere 28 döngü; Ve 72 ° C'de 5 dakika. Jel-arıtılan R1-4 ve R5-8.
  5. 3. tur: R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (kapaklar olmadan R1 - 8) için kodlama dizileri oluşturun.
    1. PCR'nin üçüncü turunda, saflaştırılmış R1-4, R5-8 ve Köprü 4/5'i karışık şablonlar ve R1-F olarak kullanarak vekapaklar olmadan PCR ürünü, R1-8 üst üste elde etmek üzere adım 1.3 de tarif edildiği gibi, R8-R primer olarak, PCR reaksiyonunu ayarlayın.
    2. Aşağıdaki PCR programı ayarlayın: 95 ° C'de 5 dakika; 95 ° C'de 30 saniye 28 döngü, 55 ° C'de 30 saniye ve 72 ° C'de 55 s; ve 72 ° C 'de 5 dak. kapaklar olmadan R1-8 Jel saflaştırılması.
  6. Yuvarlak 4: tam PUF sahaları şifreleyen dizileri oluşturun.
    1. PCR reaksiyonu başlatacak karışık şablonlar ve primerler olarak Cap-F ve Cap-R gibi kapaklar ve 5'-uç ve 3'-uç başlıklarının, saflaştırılmış R1-8 kullanılarak PCR son turda, aşama 1.3 'de tarif edildiği gibi nihai mutasyona uğramış PUF etki elde etmek.
    2. Aşağıdaki PCR programı ayarlayın: 95 ° C'de 5 dakika; 95 ° C'de 30 saniye 28 döngü, 55 ° C'de 30 saniye ve 72 ° C'de 1 dakika; ve 72 ° C 'de 5 dak.
    3. Nihai yeniden programlanması PUF etki PCR ürünleri jel-saflaştırılması. sonraki adımlarda ESF ekspresyon plazmidinin yapımı için bu ürünlerin kullanım. SequPUF etki yeniden programlanması dizileri doğrulamak için, nihai bir yapı sözler söylenmelidir.
      Not: Cap-F NLS BamH I ve Xba I bölgeleri ve Cap-R arasındaki (PPKKKRKV), bir durdurma kodonu ve SalI sitesi (restriksiyon siteleri ESFs ekspresyon vektörleri, Şekil 1, Cı oluşturmak için dizayn edilmiştir) kodlayan kodlar.

ESFs bir Fonksiyonel Modülü 2. İnşaat

  1. Iki strateji yaygın fonksiyonel ESFs modüller (SC etki ya da Gly-açısından zengin domenin) klonlamak için kullanılır: bir şablon (aşama 2.2) toplam insan cDNA kullanılarak PCR ile bu etki amplifiye etmek için ya da doğrudan DNA fragmanları, farklı SC için kod sentezleme ya da Gly-bakımından zengin alan (aşama 2.3).
  2. 9G8 (NP001026854) 238, artıklar SRP40 (NP008856) ait 180-272 veya kalıntılar 117 - - SC35 (NP003007) 221 kullanımı PCR kalıntıları 123 RS etki klonlamak için. hnRNP A1 (NP_002127) 320, tortu - 195 kalıntılarından Giy zengin alanları ClonehnRNP A3 (NP919223) 378 - hnRNP A2 (NP112533) veya kalıntıları 211 353 - s 203.
    1. Kullanım NCBI Primer tasarımı, aracı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) ya da Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) için primerler dizayn etmek için RS etki ya da Gly-açısından zengin domenin (ESFs işlevsel modül) klonlanması.
      NOT: ileri primer NheI sitesine sonra bir N-terminal FLAG etiketi bulunuyor. Ters primer ekspresyon vektörleri içine klonlanması için, bir BamH I bölgesi (Şekil 1 C), ihtiva etmektedir.
    2. aşama 1.3 'de tarif edildiği gibi RS ya da Gly-açısından zengin domenin amplifiye etmek için, standart PCR reaksiyonu ayarlayın. Aşağıdaki PCR programı ayarlayın: 95 ° C'de 5 dakika; 95 ° C'de 30 saniye 28 döngü, 55 ° C'de 30 saniye ve 72 ° C'de 30 saniye; ve 72 ° C 'de 5 dak.
  3. Klon RS alanları ya da doğrudan DNA sentezi ile Giy-bakımından zengin alan. Bunun yerine sentezleyicisi, aşama 2.2'de efektör alanları için kodlayan PCR ürünleri üretenTicari olarak bir DNA oligonükleotid kaynağı kullanılarak bir kısa fragman RS alanını (RSRSRSRSRSRS) ya da bir Gly-zengin alanını (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) kodlayan bir oligonükleotid.

3. ESF Ekspresyon Plazmidlerinin Yapımı

  1. Herhangi bir ekspresyon vektörü kullanarak ESF ifade plasmidleri kurun.
    NOT: Doğal olarak N-'dan C-terminaline, bir FLAG epitopuna, bir Gly'ye (Şekil 1'de gösterildiği gibi) kodlayan pGL-Gly-MS2 (Dr. R. Breathnach, Institute de Biologie-CHR 11'den hediye) HnRNP A1'in zengin bölgesi ve MS2 kat proteini. Bu nedenle, bu ifade yapısı bir sonraki adımda örnek olarak kullanılır.
    NOT: Birden fazla klonlama alanı bulunan diğer ifade vektörleri de kullanılabilir ve standart klonlama adımları parçaları birleştirmek için uygulanır.
  2. MS2 kaplama proteini fragmanını çıkarmak için adım 3.1'de bahsedilen 1.5 μg ifade plasmidlerini (pGL-Gly-MS2) sindirin. Kısıtlayıcıları kullanınBamHI ve Sal I'i 37 ° C'de 1 saat süreyle endonükleazlar. ESF'lerin tanıma modülünü (bir NLS'yi kodlayan ve adım 1.5'te üretilen yeniden programlanmış PUF alanlarını) BamH I ve Sal I ile aynı durumda sindirin.
  3. Kısıtlama sindirim reaksiyonlarına 5x yükleme boyası ekleyin ve 120 V'de 40 dakika boyunca bir DNA jel lekesi içeren% 1.5 agaroz jeli ile toplam hacmi yavaşça elektroforezleyin. Sindirilmiş ürünleri jel-arındırın.
  4. ESF eklentilerinin saflaştırılmış bir tanıma modülü ve ekspresyon vektör DNA'sı 3: 1 oranında, 1 μL DNA ligazı ve 1 uL 10x ligasyon tamponu ile 10 μL ligasyon reaksiyonları hazırlayın. Ligasyon reaksiyonlarını gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin; Ortaya çıkan yapı, bir CMV yükselticisinin kontrolü altında bir Gly-PUF-tipi ESF (pGL-Gly-PUF) ifade eder ( Şekil 1 C ).
  5. FLAG / Gly bakımından zengin bölgeyi Nhe I ve BamHI sindirimiyle kodlayan parçayı 1 saat süreyle 3 ° C'de çıkarın.7 ° C. RS bir alanını şifreleyen bir fragmanı ile değiştirin (adım 2.2 oluşturulan, yine NheI ve BamH I ile sindirilmiş); Sonuçta elde edilen yapı, bir RS-MAL tipi ESF (Şekil 1 C), ifade eder.

Ekleme Muhabir 4. İnşaat

  1. XhoI ve Apa I bölgeleri veya Xhol ve EcoRI siteleri tarafından sınırlanan aday sekansları (PUF etki yani hedef dizileri) içeren oligonükleotitler sentez. XhoI ve Apa I ya da Xhol ve EcoRI siteleri yapışkan uçları tarafından yanlardan ulaşılan PUF etki tanıma bölgelerini içeren çift sarmallı uçlar elde etmek için 55 ° C'de 5 dakika boyunca oligonükleotidleri tavlanması.
  2. Daha önce tarif edilen modüler yapıştırma raportör bir test ekson (insan IGF2BP1, Ensembl İD ENSG000001 ekson 12 ile ayrılmış iki GFP eksonu ihtiva 22 pGZ3, başlatın59.217) ve bunun komşu intron.
    NOT: Test ekson sentezlenmiş aday sekansları ihtiva eden oligonükleotitler (PUF etki hedef dizileri) eklemek için kullanılabilir Xhol ve Apa I siteleri ile işleme sokuldu. Bu modüler birleştirme raportör (pGZ3) plazmid deposu Eklenti geni ile sağlanmaktadır.
  3. 37 ° C'de 1 saat boyunca Xhol ve Apa I sınırlama endonükleazları ile (adım 4.2 hazırlandı) taban raportör pGZ3 Digest.
  4. Adım 3.3'te tarif edildiği gibi sindirildi ürünler Jel saflaştırılması.
  5. 1 mol oranında, DNA ligazı 1 uL ve 10x ligasyon tamponu 1 uL: 3 adım 4.4 üretilen Adım 4.1 üretilen çift sarmallı uçlar ve sindirilmiş pGZ3 vektörü ile ligasyon reaksiyonları 10 uL hazırlayın. İnşaat, yapıştırma raportör vektör pGZ3 elde etmek için gece boyunca 4 ° C 'de ligasyon reaksiyonları inkübe edin.
  6. Daha önce içine adım 4.1 oluşturulan çift sarmallı uçlar eklemeRakip 5 'lik muhabiri ve yarışmakta olan 3' s muhabirinin elde edilmesi için pEZ-1B ( Xho I ve EcoRI siteleri kullanılarak) ve pEZ-2F'nin ( Xho I ve Apa I bölgeleri kullanılarak) 23 yayınlanmış muhabirleri, adımlar 4.3-4.5.
    NOT: Her iki ekleme raportörünün türleri Add-gen aracılığıyla edinilebilir.

5. ESF için Lentiviral Ekspresyon Vektörleri Yapımı

  1. Standart PCR reaksiyonunu, Mlu I / Spe I bölgelerini içeren primerlerle orijinal ifade vektörlerinden (pGL-Gly-PUF veya pGL-RS-PUF) tam uzunlukta ESF'leri yükseltmek için adım 1.3'te açıklandığı şekilde ayarlayın. PCR programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 95 ° C'de 5 dakika; 95 ° C'de 30 saniye, 55 ° C'de 30 saniye ve 72 ° C'de 1.5 dakika olmak üzere 28 döngü; Ve 72 ° C'de 5 dakika.
  2. Bir sindirim reaksiyonu, jel saflaştırması ve ligasyon reaksiyonu yoluyla, ESF'leri lupıviral ifade vektörü pWPXLd'ye, Mlu Spe I siteleri, adımlarda 3,2-3,4 açıklandığı gibi.
  3. Sahip vektörler, psPAX2 ve pMD2.G, ambalaj ile HEK293T hücreleri transfekte olması ile lentivirüsleri oluşturmak için, daha önce 24 rapor edildiği gibi, standart bir kalsiyum fosfat çökeltme yöntemi kullanarak ya pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-XL), pWPXLd-GIy-PUF ( ağırlıkça)) () spesifısite kontrol olarak ya da pWPXLd-GFP (sahte.
    1. Tohum 5x10 6 HEK293T 10 cm çanaklara hücreleri ve gece boyunca 10 ml ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) hücrelerin büyümesine% 10 Fetal Sığır Serumu, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde çanak başına (FBS), 37 ° C'de ve% 5 CO2 . % 90 konfluent - hücreleri 70 olduğunda transfeksiyon gerçekleştirin.
    2. pMD2.G 2.5 ug;, üç plazmidler (paketleme vektörünün 7.5 ug, psPAX2 ekleyerek plazmid karışım hazırlayın ve 10 ug ya pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-XL), pWPXLd-GIy-PUF (ağırlıkça) 2 ml tüp veya pWPXLd GFP).
    3. 0.25 M CaCb 560 mcL2-ml tüp 2x BBS çözeltisi 2 ve 560 uL. yavaşça birkaç kez karıştırılır ve transfeksiyon karışımı hazırlamak için oda sıcaklığında 15 dakika için inkübe edilir.
    4. 10 cm'lik kaplar tüm transfeksiyon karışımları ekleyin. Hafifçe yemekler girdap ve% 3 CO2 ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe.
    5. , Orta çıkarmak her bir tabağa,% 2 FBS ile taze DMEM 10 ml ekleyin ve% 10 CO2 ve 37 ° CO / N inkübe.
    6. yemekler ilk süpernatant toplayın. her bir tabağa,% 2 FBS ile taze DMEM 10 mL ekleyin. % 10 CO2 ve 37 ° C 'de yemekler O / N inkübe edin. 4 ° C'de süpernatan saklayın.
    7. bulaşıklardan ikinci süpernatant toplayın. Birinci ve ikinci hasatlarından süpernatant Havuzu. 0.4-um filtre içinden filtre edilerek, hücre kalıntılarının süpernatant temizleyin. şirketinden temizlenmiş süpernatan kullanım veya -80 ° C'de saklayın.
  4. HEK2 enfekte edilmesiyle lentivirüsün titresini belirlemekDaha önce bildirildiği gibi virüs preparatının seri dilüsyonlarla 93T hücreleri, daha önce bildirildiği gibi 25 .

6. Özellikle Modüle Ekson Dahilimi ve ESF'ler ile Splice Sitelerinin Alternatif Kullanımı

  1. 24 x yuva plakanın her kuyucuğuna 2x10 5 HEK293T hücresi tohumlayın. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de nemli bir kuluçka makinesinde% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM'nin 500 mcL'sinde gece boyunca hücreleri büyütün.
  2. Kullanmadan önce nazikçe şişeleri ters çevirerek lipozomal transfeksiyon reaktifi karıştırın. 50 μL azaltılmış serum ortamında 2 μL lipozomal transfeksiyon reaktifi seyreltin. Nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  3. Steril tüp içinde 50 μL azaltılmış serum ortamında 0.04 μg pGL-Gly-PUF ifade vektörleri ve 0.2 μg pGZ3 raportör plazmidlerini sulandırın. 0.4 μg pGL-RS-PUF ekspresyon vektörleri ve 0.2 μg pGZ3 raportör plazmidini steril bir tüp içinde 50 μL azaltılmış serum ortamında seyreltin. DpGL-RS-PUF ifade vektörlerinin ilute 0.4 ug ve steril bir tüp içinde düşük serum ortamına 0.2 Pez-1B veya Pez-2F haberci plazmid ug 50 uL.
  4. Oda sıcaklığında inkübe edildikten 5 dakika sonra, yavaşça aşama 6.3'de hazırlanan seyreltilmiş plazmidlerle aşama 6.2'de hazırlanan seyreltilmiş lipozomal transfeksiyon reaktifi karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı.
  5. Her bir adım 6.4 hazırlanan ekspresyon vektörleri ve transfeksiyon reaktifi içeren tüm transfeksiyon karışımları ekleyin ve 37 ° C de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, en az 12 saat ve% 5 CO2 inkübe edin.
  6. 37 ° C de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, 12 saat ve% 5 CO2 sonra, her bir ortamın atmak ve de / fosfat tamponlu salin çözeltisi, 500 uL (PBS) ile yıkayın.
  7. PBS atın ve her kuyuya tripsinin 200 uL ekleyebilir. 5 dakika için CO2, 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde plaka inkübe ve% 5. di durdurmak için ortam 1 ml ekleyinGestion ve hücreleri steril bir 1.5 ml tüp aktarın.
  8. Tüpleri 5,000 xg'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin ve ortamı atın. Tekrarlayan pipetleme ile hücreleri lyse için tüp başına 0.5 ml RNA ekstraksiyon tamponu ekleyin. Homojenleştirilmiş numuneleri 5 dakika inkübe edin.
  9. Her RNA ekstraksiyonu tamponu ile muamele edilmiş numune için, 0.5 mL RNA ekstraksiyon tamponu başına 0.1 mL kloroform ekleyin. Tüpleri 15 saniye ters çevirin ve RT'de 3 dakika inkübe edin.
  10. Tüpleri 12,000 xg ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. İlk homojenleştirme için kullanılan 0.5 mL RNA ekstraksiyon tamponu başına 0.25 mL izopropanol ekleyin.
  11. Vorteksleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Tüpleri 10 dakika 4 ° C'de 12,000 xg'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra RNA çökeltisi genellikle tüpün dibinde görülebilir.
  12. Süpernatantı atın ve 0.5 mL RNA ekstraksiyon tamponu başına 0.5 mL% 75 etanol ile RNA pelletini yıkayın.
  13. Vorteks şiddetle ve 7,500 xg'de 5 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve RNA pelletini kurutun. RNA 50 uL RNaz içermeyen suda eritilir.
  14. Her 50 μL RNA çözeltisine 2 uL 5U / μL DNase I, 7 μL 10x tampon ve 11 μL H 2 O ekleyin. Tüpleri 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. DNaz'ı devre dışı bırakmak için onları 70 ° C'de 15 dakika ısıtın.
  15. Her bir numune için aşağıdaki bileşenleri 0,2 mL'lik bir nükleaz içermeyen tübün içine ekleyin: 1 uL 50 uM oligo dT, 5 ng / mL'lik 400 ng / μL'lik RNA (2 μg), 1 μL'lik 10 mM dNTP ve 3 μL'lik H O. Ters PCR uygulayın.
    1. Karışımı 65 ° C'ye 5 dakika boyunca ısıtın ve ikincil yapının yeniden düzenlenmesini önlemek için buz üzerinde en az 2 dakika inkübe edin. Aşağıdaki tıpkı aynı tüpe ekleyin: 4 uL 5 x birinci telli tampon, 1 uL 0,1 M DTT, 1 uL 200 U / μL ters transkriptaz ve 4 uL H 2 </ Sub> O. hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın ve 60 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin. 15 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtılarak reaksiyonu durdurun.
  16. 10x PCR tamponu, 10 mM dNTP karışımı, 10 uM ileri primer 1 uL, 0.5 uL 2.5 uL 10 uM 1 uL: Her numune için, vücut etiketli PCR tamamlamak üzere bir PCR tüpüne aşağıdaki bileşenleri ekleyin ters primer, 5 U / ml Taq DNA polimerazı, 0.25 uL 25 nM Cy5 dCTP, 0.5 uL, ve adım 6.15 hazırlanan cDNA'nın 2 uL.
    1. Molekülleri denatüre etmek için 2 dakika süreyle 94 ° C'ye kadar reaksiyon Isı PCR 25 çevrim yerine (30 s için 94 ° C, 60 ° C 30 saniye, ve 72 ° C'de 30 saniye), 72 ° C 'de reaksiyon devam 7 dakika, ve daha sonra, 4 ° C'de beklemeye de bırakın.
  17. 1x Tris bazı, borik asit, ve EDTA (TBE) tamponu ile% 10 poliakrilamid jeli içinden elektroforez ile PCR ürünleri giderin. Bir floresan tarayıcı kullanarak bir tarama gerçekleştirin. ölçmekBir yoğunluk ölçme yazılımı kullanılarak her bir birleştirme izoformunun miktarı.

7. Endojen Bcl-x Eklenmesini Modüle Etmek ve Apoptoz Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için ESF'yi kullanın

  1. 24 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 2 x 10 5 HeLa hücresi plakası. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bir kuluçka makinesinde% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM 500 mcL'de gece boyunca hücreleri büyütün.
  2. 12 saat sonra, hücreleri, 2 ug pGL-Gly-PUF (WT) veya 0.2 ug, 1 ug ve 2 ug pGL-Gly-PUF (531) (Bcl-x ön-tanımayı yeniden tanımlayan yeniden programlanmış bir PUF alanı) Yüksek afiniteli mRNA, bakınız Şekil 2A).
  3. 24 saat sonra hücreleri hasat edin. Hücrelerin 1 / 3'ü RNA izolasyonu ve PCR analizi için (6.8 - 6.17 adımlar) ve 2/3 protein izolasyonu içindir.
  4. Western leke analizi için toplam hücre pelletini 2X Sodyum Dodesil Sülfat-PolyAcrylamide Jel Elektroforez (SDS-PAGE) yükleme tamponu içinde 10 dakika kaynatınVe daha sonra proteinleri% 12'lik bir SDS-PAGE jelinde çözünür. Proteinleri bir nitroselüloz zara aktarın.
  5. Zarı oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt ile bloke edin ve Membran O / N'yi Kaspaz-3 (1: 1000), PARP (1: 1000) veya beta-aktin (1: 5000) primer antikorlarla inceltin % 5 süt) 4 ° C'de.
  6. Membranı sallanan bir çalkalayıcı üzerinde RT 3x'de 5 dakika% 0.1 Tween 20 (PBS-T) içeren PBS ile yıkayın. Membranı RT'de 1 saat boyunca HRP'ye bağlı antikorlar (1: 5,000,% 5 süt içinde seyreltilmiş) ile inkübe edin.
  7. Membranı RT'de PBS-T 3x ile yıkayın ve daha sonra membranı ECL Western blotting belirleme reaktiflerini kullanarak geliştirin.
  8. Lamelleri üzerine 250 μL poli-L-Lizin (PLL) ekleyin, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve sıvıyı sifonlayın. PLL kaplı cam lamelleri her biri için 5 dakika PBS 3x ile yıkayın. Apoptozu ölçen immünofloresans testi için, 6 oyuklu bir plakada poli-lizin kaplı cam lamelleri üzerine 5 x 10 5 HeLa hücrelerini tohumlayın. Transfect pBir lipozomal transfeksiyon ayıracı kullanarak HeLa hücrelerine GL-Gly-PUF (WT) veya pGL-Gly-PUF (531) plazmidleri ilave edin (bkz. Adımlar 6.1-6.5).
  9. Transfeksiyondan 24 saat sonra RT'de 20 dakika 1x PBS içerisinde 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile lamelleri üzerindeki hücreleri sabitleyin. DİKKAT: PFA toksiktir; Bir duman davlumbazında özenle kullanın.
  10. Nazikçe 1x PBS 2 mL ekleyerek lamelleri üzerinde hücreleri yıkayın. Onları 5 dakika inkübe edin. PBS pipetleri ile çıkarın. Yıkamayı 3 kez tekrarlayın.
  11. 10 dakika boyunca 1x PBS içinde% 0.2 Triton X-100 ile hücreleri permeabilize ve daha sonra 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
  12. 10 dakika 1x PBS% 3 Bovine Serum Albumin (BSA) ile hücreleri bloke edin ve 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
  13. FLAG antikoru 1: 1,000% 3 BSA / PBS'de seyreltin ve seyreltilmiş FLAG antikorundan 30 μL pipetle bir parafilm tabakasına pipetleyin.
  14. Hücrelerle birlikte lamelleri çıkarın, fazladan tamponu laboratuar mendilleri ile dikkatli bir şekilde kurutun ve 30 μL anti-FLAG'ın üzerine ters yerleştirin (hücre tarafında aşağı doğru)eriyiği. Oda sıcaklığında 1 saat için inkübe edilir.
  15. örtücü cam, çözelti üzerinde yüzer kadar birincil antikor ile inkübe lamel tarafına 1x PBS yaklaşık 500 mcL ekleyin. kuyularda 1x PBS ile 6 oyuklu plakaya dönün.
  16. o 5 dakika her biri için 1x PBS ile 3 kez yıkanır.
  17. anti-fare ikincil antikoru (1: 500) ile seyreltilir,% 3 BSA / PBS içinde; Yine, her lamel 30 mcL kullanın. İkincil antikor çözeltisi ile lamel baş aşağı koyun ve oda sıcaklığında 15 dakika için inkübe edilir.
  18. Adım 7.15 tarif edildiği gibi, parafilm lamel çıkarın. 6 plaka içine geri koyun ve her biri 5 dakika için 1 x PBS 3x ile yıkayın.
  19. (DAPI) ile yerleştirme ortamı ile lamelleri monte fazla orta kaldırmak ve tırnak cilası ile kenarına sahiptir.
  20. (100 X büyütme), bir floresans mikroskobu kullanılarak hücrelerin görselleştirmek ve dijital bir kamera kullanılarak fotoğraflamak.
    Not: ESF ekspresyonu floresanla labele ile yükseltilirFLAG etiketi karşı d sekonder antikor, ve nükleer fragmentasyona DAPI lekelemesi kullanılarak görüntülenmiştir.

8. ESF ifade Farklı Kanser Hücrelerinin Apoptoz ölçün

  1. Propidium ile apoptozu belirlemek için mL DMEM, 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde bir inkübatör içinde% 10 FBS ile takviye edilmiş 4 ile 60 mm lik tabaklar içine 2 x 10 6 HeLa hücrelerini, MDA-MB-231 hücreleri, ve A549 hücreleri bölme iyodür (PI) boyama.
  2. Daha önce rapor edildiği gibi 24, 24 saat sonra, ortam yenilemek ve lentivirüs hazırlar.
  3. 5'e eşit hücre sayısına virüs oranının elde edilmesi için taze ortam 4 mL 10 x 10 6 lentivirüs pWPXld-GIy-PUF (WT), pWPXld-GIy-PUF (531), ya da pWPXld-GFP stokları seyreltin.
  4. Adım 8.3'te hazırlanan virüs içeren ortam 4 mL plakalarda orta değiştirin ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde bir inkübatör içerisinde inkübe edin. 12 saat sonra enfeksiyon, orta değiştirmek.
  5. Enfeksiyon 24 saat sonra, toplamak ve 2 ug / mL PI bir son konsantrasyon ihtiva eden bir PBS çözeltisi içinde 5 dakika için hücreleri boyar.
  6. Daha önce tarif edildiği gibi 16, bir akış sitometresinde PI-lekeli hücrelerin analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu raporda, ESF'lerin ve ekleme raportörlerinin tasarımı ve inşası için komple protokol açıklanmaktadır. Aynı zamanda, endojen genlerin AS'sinin manipüle edilmesinde ESF'lerin daha ileri uygulamalarını özetlemektedir16. ESF aracılı splicing değişikliklerinin tipik sonuçlarını göstermek için önceki çalışmalarımızdaki verileri bir örnek olarak kullanırız. Farklı fonksiyonel alanlara sahip ESF'ler, hedef kaset eksonunun dahil edilmesini teşvik etmek veya inhibe etmek için kullanılabilir ( Şekil 1 D ve E ). ESFler, raportör sistemindeki alternatif 5 've 3' ek yeri yerlerinin kullanımını da etkileyebilir ( Şekil 1 F & G ).

Endojen genin alternatif bir şekilde birleştirilmesi tasarımcı ESF'lerle spesifik olarak düzenlenebilir. Bu uygulamayı spesifikasyonlarla sergiledik.ifically alternatif 5' ekleme bölgeleri olan iki karşıt izoform halinde eklenmiş olabilir, Bcl-x, hedefleme. Biz ESF, alternatif 5' ekleme bölgeleri arasında bir 8-nt RNA elemanı tanıyan Gly-PUF (531) olarak tasarlanmış. Bu Gly-PUF (531) özel Bcl-Xs (Şekil 2 A) üretimine yönelik yapıştırma kaymıştır. Kontrol ESF ise, HeLa hücrelerine Gly-PUF (531), Bcl-xS, izoformları ve bir doz bağımlı olarak artmıştır Bcl-xS, protein seviyesini transfekte sonra, Gly-PUF (WT), oranı etkilemedi Bcl-Xs Bcl-xL (Şekil 2 B ve C) için. Buna ek olarak, tasarım ESF kaspaz 3 ve poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP), apoptoz, iki iyi bilinen moleküler markörler (Şekil 2 D) bölünmesini indükleyebilir. Beklendiği gibi, tasarımcı ESFs ağırlıklı demo olarak, transfekte hücrelerin çekirdeklerinde lokalize edilirmikroskobi ile nstrated (Şekil 2E). Tutarlı olarak, Giy-PUF ile birleştirme kayma (531), bu hücreler apoptoz (Şekil 2 E) yapılan belirten, nükleer DNA parçalanma neden oldu. Apoptotik hücre artışı ayrıca, rastgele seçilen alanlar 200'ün hücrelerin incelenmesi ile ve parçalanmış çekirdek DNA (Şekil 2, F) ile hücrelerin yüzde miktarının ile teyit edilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1: Tasarım ESFs ve Oransal ekson atlama Onların etkinlik. PUF alan ve RNA hedefleri arasındaki bağlanma (A) spesifik RNA PUF yapısı ve şematik diyagramı ile görüntülenmiştir. her biri için PUF bağlanma kodufarklı renklerle sağda gösterilen Dört RNA bazı, PUF mutasyonları tasarlamak için kullanılır. (B), bir özel PUF etki elde etmek akış şeması. "UGUAUAUA" tanır PUF bir örnek olarak kullanılmıştır. Bir 4-tur PCR stratejisi özel RNA bağlama özgüllüğü (panel A benzer renk kodlu) bir PUF iskelesi oluşturmak için kullanılır. İlk rauntta, iki bitişik PUF tekrarı için arzu edilen RNA tanıma kodu dahil bir PCR primerleri dizisi, tam PUF protein, sekiz RNA tanıma kodu dahil dört kısımdan (R1 / R2, R3 / R4 oluşturmak için kullanılan R5 / R6 ve R7 / R8). bir N-terminal nükleer lokalizasyon sinyali, bir Cı-uç durdurucu kodonu kodlayan kap fragmanları ve köprü parçalan ayrı olarak üretilir (5'-ucu ve 3'-uç kapağı, köprü 2/3, köprü 4/5, ve köprü 6 / 7). İkinci tur, yeni şablonlar (örneğin, karıştırma, R1 / R2, uygun bir köprü ile bitişik tekrarları kodlayan üst üste binen fragmanlar karıştırılmasıyla oluşturulur,R3 / R4 ve köprü 2/3, R1 - 4 için şablon oluşturur ve daha sonra boşlukları doldurmak için DNA polimeraz ile uzatılır. Benzer şekilde, üçüncü turda R1-4, R5-8 ve köprü 4/5 katıldı. Son olarak, dördüncü tur, ekspresyon vektörlerine klonlama için klonlama bölgeleri ile birlikte PUF alanının 5 'ucunu ve 3' uç kapaklarını ekler. ( C ) ESF'lerin modüler alan organizasyonu. ESF'ler CMV yükselticileri tarafından yönlendirilir (ok) ve N-'dan C terminaline: bir FLAG epitopu (ESF'lerin tespiti için), fonksiyonel bir modül (bir Gly-zengin alan veya bir RS bölgesi), bir NLS (ESF'lerin nükleer lokalizasyonunu kolaylaştırır) ve bir RNA tanıma alanını (bir PUF alanı) içerir. Nhe I ve BamH Fonksiyonel bir modül eklemek için tasarlandık, Xba I ve Sal I, bir RNA tanıma alanı eklemek üzere tasarlandı. ( D ) Gly-PUF ESF'ler, ekson atlama muhabirleri ile birlikte eksprese edilir ve ekleme paterni RT-PCR ile denenir. Değiştirilmiş PUF a b sırasıyla 8-mer hedef A ve B'ye (aynı renklerde) bağlanır. Tüm kombinasyonlar kullanılır, bu nedenle farklı renkteki PUF hedef çiftleri kontroller olarak kullanılır. RS-PUF'nin ekson atlama ( E ), rekabet eden 5 'ek yeri ( F ) veya rekabet eden 3' ek yeri muhabiri ( G ) üzerindeki etkileri panel D'ye benzer yöntemlerle denendi. RT-PCR'nin verileri Wang ve ark. 16 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2 : ESF'ler ile Endojen Bcl-x pre-mRNA Eklemesinin Düzenlenmesi. ( A ) Endojen Bc'nin alternatif bağlanma şeması1x pre-mRNA. Bcl-x ekson 2'sinde iki alternatif 5 'ek yeri, farklı boyutlarda, Bcl-xL ve Bcl-xS iki izoformu üretmek için kullanılır. İki 5 'ek yeri arasındaki UGUGCGUG sekansı ESF hedefi olarak seçilir ve bu hedef sekansı tanımak için WT PUF tekrarları 1, 3 ve 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) yeniden programlanır (yıldız işareti). Gly bakımından zengin bir alan içeren ortaya çıkan ESF, aşağı doğru 5 's'lik (kırmızı ok ile gösterilen) kullanımını engeller. ( B ) Bcl-x 5 'lerin modülasyonu. Farklı miktarlarda Gly-PUF (531) ekspresyon yapısı HeLa hücrelerine transfekte edilir. Bir kontrol olarak Gly-PUF (WT) kullanılır. Bcl-x'nin iki izoformu, Bcl-x geninin ekson 1 ve 3'üne karşılık gelen primerler kullanılarak RT-PCR ile tespit edilir. Bcl-xS izoformunun yüzdesi nicelenir ve alt kısımda gösterilir. ( C ) ESFs, Bcl-xL ve Bcl-xS ekspresyon düzeylerini etkiler. Numuneler panel B'deki gibi aynı sırada yüklenir ve tüm proteinlerE Batı benekleri ile tespit edildi. ESFs ekspresyonu, anti-FLAG antikoru ile tespit edilir, ve tübülin seviyesi, bir kontrol olarak kullanılır. (D), ASF ekspresyon yapıları farklı miktarlarda transfeksiyonundan sonra Western blot, 24 saat ile tespit edilir PARP ve kaspaz 3 Numune yarılması sonucu, HeLa hücrelerine transfekte edilmiştir. aktin seviyesi, bir kontrol olarak tespit edilir. (E), transfekte edilmiş HeLa hücrelerinde ESFs alt hücresel lokalizasyonu, anti-FLAG antikoru ile immünofloresan mikroskopi ile tespit edilir. Hücreler çekirdekleri göstermek için DAPI ile birlikte boyandı. özellikle Giy-PUF (531) ile transfekte edilmiş hücrelerin bazı çekirdekleri, apoptoza bağlı parçalıdır. Ölçek çizgisi: 5 um. (F), apoptotik hücrelerin yüzdesi (parçalanmış nükleer DNA ile, yani hücreleri) floresan mikroskobu görüntüleri rastgele seçilen alanlar ölçülür. noktalar iki deneylerden elde edilen verilerdir işaret ederken barlar, ortalama göstermektedir. FigürWang ve ark. Tarafından daha önceki raporumuzdan değiştirildi . 16 , Nature Publishing Group politikasına uygun olarak hazırlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu rapor özellikle bir hedef genin alternatif eklemeler işleyebilirsiniz yapay ekleme faktörlerinin tasarımı ve inşası için ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu yöntem, özel bir özgüllüğü olan bir RNA bağlayıcı iskeleti oluşturmak için tekrar PUF eşsiz RNA bağlanma modu yararlanır. Ya etkinleştirmek veya yapıştırma bastırmak için kullanılabilir.

Bu protokol dahilinde kritik safha ESFs spesifikliğini tanımlayan reprogramed PUF etki oluşturulmasıdır. Bir PCR dikiş protokolü geliştirildi ve PUF iskele hızlı nesil için optimize edilmiştir. 1: başarısının anahtarı 1'e farklı örtüşen şablonları oranını ayarlamaktır 1. Saflaştırılmamış ürün son tur Primer kirlenme olabilir, çünkü her turdan sonra PCR ürünlerinin saflaştırılması, de önemlidir. Diğer önemli bir adım, yarı nicel RT-PCR kullanılarak birleştirme oranı tahlil etmektir. Genellikle, çok adambunlar PCR reaksiyonunu saturate olarak y amplifikasyon döngüsü, kaçınılmalıdır. bir ekleme raportör ko-ekspresyonu ile Deneylerimizde, 20-25 devir rutin olarak kullanılan, ama bu, endojen genlerin eklenmesini ölçülürken mRNA bolluğu bağlı olarak değişebilir. Primerlerin yeni bir çifti kullanılarak yapıştırma izoformları miktarının zaman daha önce tarif edildiği gibi 16, biz, PCR deneyi her zaman kalibre öneriyoruz.

özgüllük PUF iskele yinelemelerin sayısı ile belirlendiğinden, tasarımcı ESFs ile önemli bir dezavantaj, bunların hedef dışı etkilerdir. Doğal suş PUF aracılığıyla hedefini tanıyan bir siRNA'nın özgüllük karşılaştırılabilir bir 8-nt sitesini tanır "tohum maçı." Herhangi 8-nt dizisi bir transkript 65.000 tesadüfen bir kez meydana gelebilir Ancak, nt uzun (4 8 = 65.536), tasarımcı PUF tarafından tanınan diğer hedef dışı transkript olacaktır. Hedef dışı effvb ek tekrarlar PUFs kullanılarak azaltılabilir; ancak, yine de özgüllük ve ESFs ait hedef dışı etkilerini değerlendirmek için yararlıdır. Potansiyel hedef dışı etkilerini en aza indirmek için, daha düşük bir seviyede çok tasarım ESFs bir kombinasyonunun ifade de gerçekleştirilebilir. Gerçek hedefin birleştirme sinerjistik işlev birden ESFs etkilenecektir ise, böyle bir durumda, kapalı hedefli genlerin ESFs düşük miktarda etkilenmeyebilir. Bu çözelti, araştırmacılar tek bir mRNA, çoklu sayıda hedef bir araya getirilmiş siRNA'lar (düşük bir konsantrasyonda her bir) hedef dışı etkileri azaltılabilir RNAi, gen susturulmasında kullanılmışken olana benzerdir.

pre-mRNA'nın belli bölgelerde ile eşleştirmek antisens oligonükleotidleri kullanmak için olduğu gibi, diğer ana yöntem işlemek için. bu, mevcut yöntem ile karşılaştırıldığında, ESFs kararlı biçimde transfekte edilmiş hücrelerde uzun etkilere neden olabilir. Buna ek olarak, E'nin, in vivo dağıtımSF, gen terapi vektörlerinin giderek artan cephaneliğinden faydalanabilirken, antisense oligonükleotidlerin in vivo iletimi kontrol edilmesi çok zordur. Buna ek olarak, bu yöntem, oligonükleotitlerin karmaşık ve pahalı modifikasyonlarından kaçınabilir. Çeşitli indüklenebilir promotörleri kullanarak, doğru hücre tiplerinde ve doğru zamanlarda ESF ekspresyonunun daha hassas bir şekilde kontrolü sağlanabilir. Bu yöntemin en büyük dezavantajı nispeten düşük özgüllük (tipik antisens oligonükleotitlerde 16 ila 20 nt'lik bir tanıma bölgesi yerine 8-nt'lik bir tanıma bölgesi) 'dir.

Alternatif splizlemenin düzensizliği kanseri 26 , 27 gibi birçok hastalığa neden olur. Genom çapında yapılan çalışmalar, çeşitli kanserler türlerinde 28 , 29 ve 30 yaşlarında 15.000 'den fazla tümöre bağlı ek yeri varyantı ortaya çıkardı. Örneğin, introniktümör baskılayıcı genlerin bağlayıcı bir mutasyon genellikle ekson-atlama olaylara neden ve tümör oluşumu 26, 31, 32 katkıda bulunabilir anormal proteinler üretirler. Ayrıca, bazı birleştirme faktör birleştirme faktörler kanser biyogenezine önemli roller oynadığı belirten, hücre dönüşümünün 33, 34 katkıda birçok kanser tiplerinde aşırı ifadeli olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, gen fonksiyonunu modüle etmek için faydalı bir araç sağlayan ek olarak, tasarım ESFs ile yapıştırma manipulasyonu ve böylece potansiyel bir terapötik bir araç sağlar, kanserde düzeni bozulmuş kırpılma geri olabilir. Buna ek olarak, farklı fonksiyonel saha ihtiva eden tasarımcı PUF domain kaynaştırarak, çeşitli RNA metabolizması süreçleri manipüle çoklu yapay faktörler tasarlanabilir. Örneğin, bir translasyon aktivatörü füzyonu (GLD2) ya da bir translasyonal temsilcisiaktif veya mRNA çevirisi 27 önleyebilen PUF alan üretilen yeni faktörlerle ressor (CAF1). Aynı tasarım anapara kullanarak, 17 enzimleri DNA restriksiyon benzer şekilde işlev yapay yere spesifik RNA endonükleaz (ASREs) oluşturmak için tasarımcı PUF etki, bir dizi spesifik olmayan bir RNA endonükleaz alanı (PIN) birleştirildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, NIH hibe R01-CA158283 tarafından desteklendi ve NSWB, ZWYW için 31400726 no'lu hibe, Genç Bin Talent Programı ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından finanse edildi (hibe 31471235 ve 81422038). XY, Çin'in doktora sonrası bilim kurumu (2015M571612) tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732 (2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).

Tags

Genetik Sayı 122 yapay RNA bağlanma faktörleri protein mühendisliği birleştirme faktörleri alternatif birleştirme PUF iskele RNA bağlayıcı proteinler kanser
Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu,… More

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter