Summary
该报告介绍了一种生物工程方法来设计和构建特异性调节在哺乳动物细胞中靶基因的剪接新颖人工剪接因子（ASFS）。该方法可以进一步扩展来设计各种人为因素来操纵RNA代谢的其它方面。
Abstract
大多数真核RNA的处理是由RNA介导的结合的模块化配置，包括一个RNA识别模块，其特异性地结合前mRNA靶和效应结构域的蛋白质（限制性商业惯例）。以前，我们已经利用所述PUF结构域的独特RNA结合模式在人类Pumilio 1，以产生一个可编程的RNA结合的支架，将其用于设计各种人造限制性商业惯例来操纵RNA代谢。这里，详细的协议描述来构建专门设计用于调节靶基因的可变剪接工程剪接因子（ESFS）。该协议包括如何设计和构建定制的PUF支架用于特定RNA靶，如何通过融合设计者PUF结构域和效应子结构域，以及如何使用ESFS来操纵目标基因的剪接以构建ESF表达质粒。在该方法的代表性结果，我们还描述了常见的测定法的使用拼接记者，ESF的培养的人细胞中的应用，和剪接改变后续效应ESF活动。按照本报告中的详细协议，它可以设计并为不同类型的选择性剪接（AS）的规ESFS，提供了一个新的战略研究剪接调节和不同的剪接异构体的功能。此外，通过用设计PUF域融合不同的功能结构域，研究人员可以设计靶向特定RNA操纵RNA加工的各种步骤人为因素。
Introduction
大多数的人类基因经历选择性剪接（AS），以产生多种同种型具有不同的活动，这大大增加了基因组1,2的编码的复杂性。 AS提供的主要机制来调节基因的功能，并且在不同的细胞和发育阶段3,4通过各种途径紧密调节。因为拼接错误调节是人类疾病5，6，7，8的常见原因，靶向剪接调节正在成为一种有吸引力的治疗路线。
根据剪接调节的简化模型，如由剪接调节顺 -elements（SRES）中前mRNA剪接增强子或替代外显子沉默发挥功能的主要控制。钍ESE的SRE具体招募各种反式作用蛋白因子促进或抑制剪接反应3,9（ 即剪接因子）。大多数反式作用剪接因子有单独的序列特异性RNA结合域认识到自己的目标和效应域控制剪接。最熟知的例子是丝氨酸/富含精氨酸的（SR）蛋白家族的含有N-末端的RNA识别基序（RRMS），其结合外显子剪接增强子，和C-末端RS结构域的成员，其中促进外显子内含10 。相反地，核蛋白A1通过RRM结构域结合至外显子剪接沉默子，并通过C末端的富含甘氨酸的结构域11抑制外显子包含。使用这种模块化配置，研究人员应该能够通过合并来设计人工剪接因子特异性RNA结合结构域（RBD）具有不同的短跑运动员激活或抑制剪接的结构域。
这种设计的关键是使用可编程RNA结合特异性识别给定靶标的RBD，其类似于TALE结构域的DNA结合模式。然而，大多数天然剪接因子含有RRM或K同源性（KH）结构域，其识别具有弱亲和力的短RNA元件，因此缺乏预测性RNA-蛋白质识别“代码” 12 。 PUF重复蛋白（ 即 PUF结构域）的RBD具有独特的RNA识别模式，允许重新设计PUF结构域以特异性识别不同的RNA靶标13,14 。典型的PUF结构域包含八个重复的三个α螺旋，每个重复在8-nt RNA靶标中识别单个碱基。第二个α-螺旋的某些位置的氨基酸侧链与t的Watson-Crick边缘形成特定的氢键他的RNA碱基决定了每个重复的RNA结合特异性（ 图1A ）。 PUF重复的RNA碱基识别代码令人惊讶地简单（ 图1A ），允许产生识别任何可能的8碱基组合的PUF结构域（由Wei和Wang 15综述）。
该模块化设计原则允许产生由定制的PUF域和剪接调制域（ 即 SR域或富含Gly域）组成的工程化拼接因子（ESF）。这些ESFs可以作为剪接活化剂或作为抑制剂来控制各种类型的剪接事件，并且已被证明可用作操纵与人类疾病相关的内源基因的剪接16,17 。例如，我们已经构建了PUF-Gly型ESFs来特异性地改变Bcl-x基因的剪接，将抗凋亡长的同种型（Bcl-xL）转化为促细胞凋亡的短异构体（Bcl-xS）。改变Bcl-x同种型的比例足以使几种癌细胞对多种抗癌化学药物16敏感，这表明这些人为因子可能作为潜在的治疗试剂。
除了用已知的剪接效应子结构域（ 例如， RS或富含Gly的结构域）控制剪接之外，工程化PUF因子也可用于检查新的剪接因子的活性。例如，使用这种方法，我们已经证明，当结合到不同的前mRNA区域18时，几种SR蛋白质的C-末端结构域可以激活或抑制剪接，RBM4的富含丙氨酸的基序可以抑制剪接19 ，并且DAZAP1的富含脯氨酸的基序可以增强剪接20,21/ sup>。这些新功能域可用于构建其他类型的人为因子以微调拼接。
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Protocol
通过重叠PCR 1. PUF支架与定制的构建RNA结合特异性
- 设计一系列的包含在每个位置12（参照表1的引物序列和参见图1， 一种用于在RNA：PUF识别码）特异性识别不同的RNA核苷酸序列PUF的PCR引物。对于每个PUF重复，设计四个不同的引物识别每个位置的不同基地。
注意：这些引物将在一系列的四个回合的PCR反应中使用，以生成连接在一起的（ 图1B）PUF片段。 - 选择替代剪接位点附近的靶基因的识别位点。
注意：这个网站可以由用户来决定，通常选择在10 - 50 NT从选择性剪接位点。 - 轮1：生成编码序列4 PUF重复，通用桥接片段和帽片段。
- 使用目标站点定义定制的PUF的每次重复的识别码。选择该组的PCR引物用于PUF重复1 - 8.行为四个连续轮PCR，以产生定制的PUF结构域，如下所述（ 图1 的B）。
- 在第一轮PCR中，设置了标准的PCR反应混合物（含有2.5微升10X缓冲液，0.5微升10毫摩尔dNTP，0.5μL的10μM正向和反向引物，该DNA模板的50纳克（人cDNA或表达载体WT PUF结构域），以及0.5U的高保真DNA聚合酶在25μL最终体积的）。
注意：这些反应会产生对应于每个PUF重复DNA序列，通用桥接片段，以及与不同的限制性位点（ 图1B）2个帽片段。模板，引物的简要列表在该步骤中使用和产生的PCR产物示于表2中 。 - 按如下所示设置PCR程序：在95℃下5分钟;在95℃下的30秒28个循环，在55℃下30秒，和72℃15秒;和在72℃下孵育5分钟的。使用高保真DNA聚合酶PCR过程中，尽量减少点突变。
- 轮2：产生编码序列R1 / R2 / R3 / R4（R1 - 4）和R5 / R6 / R7 / R8（R5 - 8）。
- 分开使用电泳用1.5％琼脂糖凝胶（在120伏的恒定电压25分钟）在步骤1.3.3中获得的PCR产物。凝胶纯化使用凝胶纯化试剂盒的预期大小的所有产品。使用这些产品的不同的混合物，如下面的几轮PCR的模板。
注：混合三种PCR产物在大致为1：1：1的比例。他们通常不需要进行量化，只要每个产品的强度看起来在凝胶相似。 - 混合纯化的PCR产物的约5％的作为TEM在下一轮PCR中进行PCR。或者，使用UV-Vis分光光度计定量纯化的PCR产物，并在模板混合物中使用15ng的每种PCR产物。
- 使用纯化的PCR产物R1 / R2，R3 / R4和Bridge2/3作为混合模板，R1-F和R4-R作为引物。如步骤1.3所述设置PCR反应，得到重叠的PCR产物R1-4。
- 使用纯化的PCR产物R5 / R6，R7 / R8和桥6-7作为混合模板，R5-F和R8-R作为引物，以获得重叠PCR产物R5-8（ 图 1B ）。设置PCR程序如下：95℃5分钟;在95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒的循环28次;在72℃下5分钟。凝胶纯化R1-4和R5-8。
- 分开使用电泳用1.5％琼脂糖凝胶（在120伏的恒定电压25分钟）在步骤1.3.3中获得的PCR产物。凝胶纯化使用凝胶纯化试剂盒的预期大小的所有产品。使用这些产品的不同的混合物，如下面的几轮PCR的模板。
- 第3轮：为R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8（R1-8无盖）生成编码序列。
- 在第三轮PCR中，使用纯化的R1-4，R5-8和Bridge4/5作为混合模板和R1-F和R8-R作为引物，如步骤1.3所述建立PCR反应，得到无盖重叠PCR产物R1-8。
- 设置PCR程序如下：95℃5分钟; 95℃30秒，55℃30秒，72℃55秒28个循环;在72℃下5分钟。凝胶纯化R1-8无盖。
- 第4轮：为完整的PUF域生成编码序列。
- 在最后一轮PCR中，使用纯化的R1-8无帽和5'-末端和3'末端作为混合模板，Cap-F和Cap-R作为引物，如步骤1.3所述设置PCR反应以获得最终突变的PUF结构域。
- 设置PCR程序如下：95℃5分钟;在95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟的28个循环;在72℃下5分钟。
- 凝胶纯化最终重编程PUF结构域的PCR产物。在随后的步骤中使用这些产品来构建ESF表达质粒。 Sequ确定最终结构以验证PUF域的重新编程序列。
注意：Cap-F编码BamH I和Xba I位点之间的NLS（PPKKKRKV），Cap-R编码终止密码子，并且Sal I位点（限制性位点被设计用于构建ESF的表达载体， 图 1C ）。
2.建立ESF功能模块
- 通常使用两种策略来克隆ESF（RS结构域或富含Gly区域）的功能模块：通过使用总人类cDNA作为模板通过PCR扩增这些结构域（步骤2.2）或直接合成编码不同RS的DNA片段或富含Gly的结构域（步骤2.3）。
- 使用PCR从9G8（NP001026854）的残基123-238，SRP40的残基180-272（NP008856）或SC35的残基117-221（NP003007）中克隆RS结构域。从hnRNP A1（NP_002127）的残基195-320克隆富含Gly的结构域，残基hnRNP A2（NP112533）的203-335，或hnRNP3A（NP919223）的残基211〜378。
- 使用NCBI引物设计工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）或Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）设计引物克隆RS结构域或富含Gly域（ESF功能模块）。
注意：正向引物在Nhe I位点后含有N端FLAG标签。反向引物含有用于克隆到表达载体中的BamH I位点（ 图 1C ）。 - 如步骤1.3所述设置标准PCR反应以扩增RS或富含Gly的结构域。设置PCR程序如下：95℃5分钟;在95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒的循环28次;在72℃下5分钟。
- 使用NCBI引物设计工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）或Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）设计引物克隆RS结构域或富含Gly域（ESF功能模块）。
- 通过直接DNA合成克隆RS结构域或富含Gly的结构域。代替在步骤2.2中产生编码效应子结构域的PCR产物，合成使用DNA寡核苷酸的商业来源，大小编码短片段RS结构域（RSRSRSRSRSRS）或富含Gly的结构域（GYGGGGPGYGNQGGGYGGG）的寡核苷酸。
3.构建ESF表达质粒
- 使用任何表达载体构建ESF表达质粒。
注意：最初使用表达构建体pGL-Gly-MS2（来自Institute de Biologie-CHR 11的Dr.B.Breathnach的礼物），其从N-至C末端编码FLAG表位，Gly的hnRNP A1结构域和MS2外壳蛋白。因此，在下面的步骤中使用该表达式构造作为示例。
注意：也可以使用具有多个克隆位点的其他表达载体，并且将应用标准克隆步骤将片段连接在一起。 - 摘取步骤3.1中提及的1.5μg表达质粒（pGL-Gly-MS2）以除去MS2外壳蛋白片段。使用限制内切核酸酶和灰的BamH I和Sal I在37℃下1个小时。消化ESFS的识别模块（编码NLS和重新编程PUF结构域，在步骤1.5中产生）在相同的条件下用BamH I和Sal I。
- 5X加样染料加入到限制酶切消化反应，并缓慢electrophorese用含有40分钟的DNA凝胶染料在120 V.凝胶纯化经消化的产物在1.5％琼脂糖凝胶的总体积。
- 制备10个用在一个3 ESF插入和表达载体DNA的纯化识别模块μL连接反应：1的比例，1μLDNA连接酶和10×连接缓冲液1微升。孵育连接反应过夜，在4℃;所得构建CMV启动子（ 图1 C）的控制下表达甘氨酸- PUF型ESF（PGL酰-Gly-PUF）。
- 取下片段在3编码用Nhe I和BamH I消化的FLAG /富含甘氨酸域1个小时7°C。将其替换为编码RS结构域的片段（在步骤2.2中生成，也由Nhe I和BamH I消化）;所得构建体表达RS-PUF型ESF（ 图 1C ）。
4.拼接记者的建设
- 合成寡核苷酸，其包含侧翼为Xho I和Apa I位点或Xho I和EcoR I位点的候选序列（ 即 PUF结构域的靶序列）。在55℃下将寡核苷酸退火5分钟以获得双链插入物，其含有侧翼为Xho I和Apa I或Xho I和EcoR I位点的粘性末端的PUF结构域的识别位点。
- 从先前描述的模块化剪接报告物22 ，pGZ3开始，其包含由测试外显子分离的两个GFP外显子（人IGF2BP1的外显子12，Ensembl ID ENSG00000159217）及其侧翼内含子。
注：测试的外显子用Xho I和阿帕 I位点，其可用于插入包含候选序列合成的寡核苷酸（PUF结构域的靶序列）工程化。这种模块化拼接记者（pGZ3）通过质粒库中添加基因提供。 - 消化碱记者pGZ3（在步骤4.2中制备）与XhoI和ApaⅠ限制核酸内切酶进行1个小时，在37℃下。
- 如步骤3.3中描述的凝胶纯化经消化的产物。
- 制备连接反应的10微升与在步骤4.1中产生的双链插入和经消化的载体pGZ3在步骤4.4中产生的3：1的摩尔比，1μLDNA连接酶和10×连接缓冲液1微升。孵育连接反应在4℃下过夜，得到构建剪接报告载体pGZ3。
- 插入在步骤4.1中产生的到先前双链插入公布的记者，PEZ-1B（使用的Xho I和EcoR I位点）和PEZ-2F（使用XhoI和阿帕 I位点）23，以获得竞争5' SS记者和竞争3' SS记者，如在步骤中描述4.3-4.5。
注：这两种类型的拼接记者将可以通过添加基因。
5.慢病毒的构建表达载体的ESF
- 如步骤1.3中所述以扩增从原始的表达载体（PGL酰-Gly-PUF或PGL-RS-PUF）与含有的Mlu I / 的Spe I位点的引物的全长ESFS设立的标准PCR反应。按如下所示设置PCR程序：在95℃下5分钟;在95℃下的30秒28个循环，在55℃下30秒，和72℃1.5分钟;和在72℃下5分钟。
- 通过消化反应，凝胶纯化，并连接反应，集成ESFS入慢病毒表达载体，pWPXLd，所述的Mlu之间Spe I站点，如步骤3.2-3.4所述。
- 使用标准磷酸钙沉淀法，如先前报道的24 ，通过用pWPXLd-Gly-PUF（Bcl-x），pWPXLd-Gly-PUF（Bcl-xI）包裹载体psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞来产生慢病毒wt）（作为特异性对照）或pWPXLd-GFP（模拟）。
- 将种子5×10 6 HEK293T细胞倒入10cm的培养皿中并在含有10％胎牛血清（FBS）的10mL Dulbecco's Modified Eagle's培养基（DMEM）中，在37℃和5％CO 2的湿润培养箱中培养细胞过夜。细胞在70-90％融合时进行转染。
- 通过加入三种质粒（7.5μg包装载体psPAX2;2.5μgpMD2.G;和10μgpWPXLd-Gly-PUF（Bcl-x），pWPXLd-Gly-PUF（wt））来制备质粒混合物， ，或pWPXLd-GFP）连接至2mL管。
- 加入560μL的0.25M CaCl2个560μL的2×BBS溶液到2毫升试管中。轻轻混匀几次，并在室温孵育它15分钟，以制备转染混合物。
- 所有的转染混合物添加到10厘米的菜肴。轻轻摇动培养皿，并在3％CO 2和37℃下过夜孵育它们。
- 除去介质，用2％FBS加10毫升的新鲜DMEM的每个培养皿，并在10％CO 2和37℃CO / N培养它们。
- 收集从培养皿第一上清液。加入10 mL的新鲜DMEM中，用2％FBS至每个培养皿中。孵育菜O / N在10％CO 2和37℃。存储在4℃的上清液。
- 收集从培养皿第二上清液。汇集来自所述第一和第二收获上清液。通过一个0.4微米的过滤器将其过滤清除细胞碎片的上清液。直接使用澄清的上清液或将其存储在-80℃。
- 通过感染HEK2确定慢病毒的滴度93T细胞与病毒制备的连续稀释液，如先前报道25。
6.具体地调制外显子增加，并与所述ESFS使用替代剪接位点
- 种子2×10 5个的HEK293T细胞在24孔板的每个孔中。生长细胞过夜在DMEM 500μL在加湿培养箱中在补充有10％FBS在37℃下和5％CO 2。
- 使用前轻轻倒转瓶子混合脂质体转染试剂。稀释脂质体转染试剂的2μL在血清培养基减少的50μL。轻轻混匀，并培育它们在室温下5分钟。
- 稀PGL酰-Gly-PUF表达载体的0.04微克和0.2微克pGZ3报告质粒在减少血清的培养基50微升的无菌管中。稀PGL-RS-PUF表达载体的0.4微克和0.2微克pGZ3报告质粒的在血清培养基减少50μL在无菌管中。 ð在无菌管中的50μL还原血清培养基中稀释0.4μg的pGL-RS-PUF表达载体和0.2μg的pEZ-1B或pEZ-2F报道质粒。
- 在室温下孵育5分钟后，将步骤6.2中制备的稀释的脂质体转染试剂与步骤6.3中制备的稀释质粒轻轻混合。在室温下孵育混合物20分钟。
- 将含有表达载体和步骤6.4中制备的转染试剂的整个转染混合物加入每个孔中，并在37℃和5％CO 2的潮湿培养箱中孵育至少12小时。
- 在37℃，5％CO 2的湿润培养箱中放置12小时后，将其从各孔中取出，并用500μL磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）/孔清洗。
- 弃去PBS，每孔加入200μL胰蛋白酶。将培养板在37℃和5％CO 2的加湿培养箱中孵育5分钟。加入1 mL的培养基以停止di并将细胞转移到无菌的1.5mL管中。
- 以5000xg离心管3分钟，弃去培养基。每管加入0.5 mL RNA提取缓冲液，通过重复移液来细胞裂解。孵育均质样品5分钟。
- 对于每个RNA提取缓冲液处理的样品，每0.5mL RNA提取缓冲液加入0.1mL氯仿。将管反转15秒，并在室温下孵育3分钟。
- 在12,000 xg和4℃下离心管15分钟。将水相转移到新鲜管中。每0.5mL用于初始均质化的RNA提取缓冲液中加入0.25mL异丙醇。
- 通过涡旋混合并在室温下孵育10分钟。在4℃下以12,000xg离心管10分钟。离心后，RNA沉淀通常在管的底部可见。
- 弃去上清液，每0.5mL RNA提取缓冲液用0.5mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀。
- 剧烈涡旋并在4℃下以7,500 xg离心5分钟。取出上清液并干燥RNA颗粒。将RNA溶解在50μL无RNase的水中。
- 向每个50μLRNA溶液中加入2μL5U /μLDNase I，7μL10x缓冲液和11μLH 2 O。将管在37℃孵育1小时。在70℃下加热15分钟以使DNA酶失活。
- 对于每个样品，将以下组分添加到0.2mL不含核酸酶的管中：将1μL50μM寡聚dT，5μL400ng /μLRNA（2μg），1μL10mM dNTP和3μLH执行反向PCR。
- 将混合物加热至65℃5分钟，并将其在冰上孵育至少2分钟，以防止二级结构的重新形成。将以下组分加入到同一管中：4μL5x第一链缓冲液，1μL0.1M DTT，1μL200U /μL逆转录酶和4μLH 2 </子> 0。吹打轻轻上下混合，并在50℃下孵育60分钟。通过在70℃下加热15分钟停止反应。
- 对于每个样品，将以下组件添加到PCR管中，以完成身体标记的PCR：10×PCR缓冲液，0.5微升的10mM dNTP混合物，10μM正向引物的1微升的2.5μL的10μM1μL反向引物，0.25μL5U /μL的Taq DNA聚合酶，25 nM的的Cy5-的dCTP 0.5微升，并且在步骤6.15中制备的cDNA的2μL。
- 加热反应至94℃2分钟以变性分子，进行25个PCR循环（94℃30秒，60℃30秒，和72℃30秒），使反应在72℃进行7分钟，然后把它在一个4℃保持。
- 通过用1X Tris碱，硼酸和EDTA（TBE）缓冲液中的10％聚丙烯酰胺凝胶通过解析电泳PCR产物。执行使用荧光扫描仪扫描。测量使用密度测定法软件的每个剪接同种型的量。
7.使用ESF来调节内源性的Bcl-X拼接，并测量其对细胞凋亡的影响
- 板2×10个5 HeLa细胞到24孔板的每个孔中。生长细胞过夜在DMEM 500μL在培养箱中在补充有10％FBS在37℃下和5％CO 2。
- 12小时后，转染细胞与PGL酰-Gly-PUF（WT）的2微克或0.2微克，1微克，和2 PGL酰-Gly-PUF（531）（一个重新编程PUF结构域的微克识别的Bcl-X的预的mRNA以高亲和力，参见图2 的A）。
- 24个小时后，收获细胞。细胞的1/3是用于RNA分离和PCR分析（步骤6.8 - 6.17）和2/3是用于蛋白分离。
- 对于Western印迹分析，在煮沸2X十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行10分钟加样缓冲液的总的细胞沉淀，然后解决一个12％SDS-PAGE凝胶中的蛋白质。转移蛋白质到硝酸纤维素膜上。
- 块用5％牛奶的膜在室温下1个小时，孵育所述膜O / N与caspase-3（1：1,000），PARP（1：1000），或β-肌动蛋白（1：5000）的初级抗体（稀释在5％牛奶）中于4℃。
- 与在摇床上含有PBS 0.1％吐温20（PBS-T）中5分钟，在RT 3×洗膜。孵育与HRP-连接的抗体的膜：在RT下1个小时（1 5000，在5％牛奶中稀释）。
- 在RT下洗涤用PBS-T 3倍的膜，然后使用ECL Western印迹检测试剂产生薄膜。
- 添加聚-L-赖氨酸（PLL）的250μL到盖玻片，它们孵育在室温15分钟，并虹吸出液体。用PBS洗3次的PLL涂覆的玻璃盖玻片上，每次5分钟。对于免疫荧光测定测量细胞凋亡，种子5×10个5 HeLa细胞到在6孔板中的聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上。转染p使用脂质体转染试剂将GL-Gly-PUF（WT）或pGL-Gly-PUF（531）质粒导入HeLa细胞（参见步骤6.1-6.5）。
- 在转染后24小时，用1ml 4％多聚甲醛（PFA）在1×PBS中将细胞固定在盖玻片上20分钟。小心：PFA有毒;在通风柜中小心处理。
- 通过加入2毫升1x PBS轻轻洗涤盖玻片上的细胞。孵育5分钟。用移液器取出PBS。重复洗3次。
- 用1％PBS中0.2％Triton X-100渗透细胞10分钟，然后用1x PBS洗涤3次。
- 用1％PBS中的3％牛血清白蛋白（BSA）将细胞阻断10分钟，并用1x PBS洗涤3次。
- 在3％BSA / PBS中稀释FLAG抗体1：1,000，并将30μL稀释的FLAG抗体移液到石蜡膜上。
- 用细胞取出盖玻片，用实验室擦拭巾小心地干燥多余的缓冲液，将其倒置（细胞侧向下）放在30μL抗FLAGolution。它孵育在室温1个小时。
- 添加约500μL1×PBS中，以与第一抗体温育盖玻片侧直到盖玻片上溶液的顶部浮动。其返回到中孔用1×PBS的6孔板中。
- 洗用1×PBS 3倍，每次5分钟。
- 稀释的抗小鼠第二抗体（1：500）中的3％BSA / PBS;再次，用30微升每个盖玻片。放置在第二抗体溶液盖玻片倒置，并培育它在室温下15分钟。
- 从石蜡膜除去盖玻片，如在步骤7.15中描述。把它放回6孔板并用1×PBS洗涤3次它每次5分钟。
- 安装用封固剂（用DAPI）的盖玻片，除去过量的介质，和密封用指甲油的边缘。
- 可视化（放大100倍），使用荧光显微镜的细胞和使用数码相机拍摄它们。
注：ESF的表达是由荧光labele可视化d抗FLAG标签的二抗，并且使用DAPI染色显现核碎裂。
8.测量表达ESF的不同癌细胞的凋亡
- 在37℃和5％CO 2的培养箱中将2×10 6个 HeLa细胞，MDA-MB-231细胞和A549细胞分成60毫米的培养皿，其中在4毫升补充有10％FBS的DMEM中，用Propidium碘化物（PI）染色。
- 24小时后，刷新培养基并准备慢病毒，如前所述24 。
- 将稀释10×10 6个慢病毒pWPXld-Gly-PUF（WT），pWPXld-Gly-PUF（531）或pWPXld-GFP储存在4mL新鲜培养基中，使病毒与细胞数之比等于5。
- 将板中的培养基更换为4mL在步骤8.3中制备的含病毒培养基，并将培养箱在37℃和5％CO 2的培养箱中孵育。感染后12 h，更换培养基。
- 感染24个小时后，收集和染色5分钟，将细胞在含有2μg/ mL的PI的最终浓度的PBS溶液。
- 分析PI染色的细胞用流式细胞仪，如先前描述的16。
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Representative Results
这份报告描述了ESFS和拼接记者的设计和施工的完整的协议。它还概述ESFS的操纵内源基因16的AS的进一步应用。为了说明的ESF介导的拼接变化的典型结果，我们使用的数据来自我们以前的工作作为一个例子。具有不同的功能结构域的ESFS可用于促进或抑制靶盒外显子（ 图1 D＆E）的夹杂物。 ESFS也可影响在报道系统（ 图1 F＆G）替代5'和3'剪接位点的使用。
内源基因的可变剪接也可以与设计师ESFS进行具体调整。我们已经证明了通过规范这个应用程序ifically靶向的Bcl-x，它可以被拼接成具有替代5' 剪接位点的两种拮抗同种型。我们设计了一个ESF，甘氨酸 - PUF（531），识别备选5' 剪接位点之间的8个核苷酸的RNA元件。此甘氨酸- PUF（531）具体地移位剪接朝向生产的Bcl-XS（ 图2 A）的。转染甘氨酸 - PUF（531）到HeLa细胞和Bcl-XS亚型和Bcl-XS蛋白以剂量依赖性方式增加的电平，而控制ESF后，甘氨酸 - PUF（WT），没有影响的比率的Bcl-XS的到Bcl-xL的（ 图2 B和C）。此外，设计者可以ESF诱导胱天蛋白酶3和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP），两个公知的细胞凋亡的分子标志物（ 图2 D）的切割。如所预期的，设计者ESFS被主要定位在转染细胞的核，作为演示通过免疫荧光显微镜nstrated（ 图2 E）。一致的是，通过甘氨酸- PUF剪接移（531）引起的核DNA的碎裂，这表明这些细胞经历凋亡（ 图2 E）。凋亡细胞的增加通过检查从随机选择的视野多于200个细胞并通过量化具有片段化DNA的核（ 图2 F）的细胞的百分比进一步证实。
图1： 设计ESFS和它们在调节外显子跳跃活动。 （A）特定的PUF结构域和RNA靶标之间的结合被示出与RNA-PUF结构和示意图。为每个所述PUF绑定代码4个RNA碱基，与不同颜色的右侧所示，用于设计PUF突变。 （B）的流程图，以获得一个定制的PUF结构域。识别“UGUAUAUA”的PUF用作一个例子。 A 4轮PCR策略是用于组装定制RNA结合特异性（颜色类似编码到面板A）一个PUF支架。在第一轮中，并入两个相邻PUF重复所需的RNA识别码的一系列PCR引物被用于产生四个片段包括一个完整的PUF蛋白质的八个RNA识别码（R1 / R2，R3 / R4 ，R5 / R6和R7 / R8）。编码N末端核定位信号，一个C-末端终止密码子帽片段和桥片段也单独制造（5'-端和3'-端帽，桥2/3，桥4/5，和桥6 / 7）。在第二轮中，通过混合编码与适当的桥相邻重复的重叠片段（ 例如，混合R1 / R2生成的新模板，R3 / R4和桥2/3生成R1 - 4的模板），然后用DNA聚合酶扩展填补空白。类似地，第三轮连接R1-4，R5-8和桥4/5。最后，第四轮将PUF结构域的5'末端和3'末端连同克隆位点一起加入到表达载体中。 （ C ）ESF的模块化域名组织。 ESF由CMV启动子（箭头）驱动，并从N至C末端编码：FLAG表位（用于检测ESF），功能模块（富含Gly的结构域或RS结构域），NLS （促进ESF的核定位）和RNA识别结构域（PUF结构域）。 Nhe I和BamH I被设计为插入功能模块，而Xba I和Sal I被设计为插入RNA识别结构域。 （ D ）Gly-PUF ESF与外显子跳过报告共同表达，通过RT-PCR分析剪接模式。改性PUF a b特异性结合8-mer的目标A和B，分别为（在相同的颜色）。所有组合被使用，因此不同颜色的PUF目标对作为对照。 RS-PUF的上外显子跳跃（E）的影响，竞争5'剪接位点（F），或竞争性3'剪接位点记者（G）通过类似于面板D.方法RT-PCR的数据测定从Wang 等人。 16。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 与内源性ESFS的Bcl-X前mRNA剪接的调节。 （A）的内源性BC的可变剪接的示意LX mRNA前体。在的Bcl-x的外显子2的两个替代5' 剪接位点被用来生成不同尺寸的两种同种型，Bcl-xL的和Bcl-XS。两个5' 剪接位点之间的序列UGUGCGUG被选择作为目标ESF和WT PUF重复1，图3和5（Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S）重新编程（星号）来识别该靶序列。含有丰富的甘氨酸域所得ESF禁止将下游5' SS（红色箭头指示）。的Bcl-X 5' SS使用的（B）调制。不同量的甘氨酸 - PUF（531）表达构建体转染到HeLa细胞中。甘氨酸 - PUF（WT）被用作对照。使用对应于外显子1和的Bcl-X基因的3个引物通过RT-PCR检测到的Bcl-x的两种同种型。所述的Bcl-XS同种型的百分比进行定量，并在底部示出。 （C）ESFS影响了Bcl-xL和Bcl-XS的表达水平。将样品以相同的顺序加载在面板B中，和所有蛋白质ARe被Western印迹检测。通过抗FLAG抗体检测ESF的表达，将微管蛋白水平用作对照。 （ D ）将不同量的ESF表达构建体转染到HeLa细胞中，导致PARP和半胱天冬酶3的切割。转染24小时后通过Western印迹检测样品。肌动蛋白水平被检测为对照。 （ E ）通过免疫荧光显微镜检测转染HeLa细胞中ESFs的亚细胞定位。细胞与DAPI共染色显示细胞核。一些核，特别是在用Gly-PUF（531）转染的细胞中，由于细胞凋亡而被分裂。刻度棒：5μm。 （ F ）从随机选择的荧光显微镜图像领域测量凋亡细胞（ 即具有片段核DNA的细胞）的百分比。条形表示平均值，而点表示来自两个实验的数据。这个数字s是我们早些时候的报告由Wang 等人修改。 16，根据自然出版集团的政策。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本报告详细描述了可以特异性操纵靶基因选择性剪接的人工剪接因子的设计和构建。该方法利用PUF重复的独特的RNA结合模式产生具有定制特异性的RNA结合支架。它可以用于激活或抑制拼接。
该协议中的关键步骤是生成定义了ESF特异性的重新编程的PUF结构域。已经开发并优化了PCR拼接方案，用于快速生成PUF支架。其成功的关键是将不同重叠模板的比例调整为1：1：1。每次循环后PCR产物的纯化也至关重要，因为未纯化的产品可能会含有上一轮的底漆污染。另一个重要的步骤是使用半定量RT-PCR来测定剪接比率。一般也是男人ý扩增循环应该避免，因为它们可能饱和PCR反应。在我们与剪接记者的共表达的实验中，20 - 25个循环进行了常规使用的，但是这可以根据丰度mRNA的测量内源基因的剪接时变化。当使用新的引物对量化剪接异构体，建议校准每次PCR的实验中，如先前所描述16。
与设计师ESFS的潜在限制在于它们的脱靶效应，因为该特异性是由在PUF支架重复的次数来确定。野生型PUF识别的8个核苷酸位点，这与通过识别其靶的siRNA的特异性“种子匹配”。然而，由于任意的8个核苷酸序列可能偶然在转录65000出现一次NT长（4 8 = 65536），将有由设计者PUF认可的其他脱靶转录物。脱离目标的EFF可以通过使用与另外的重复的PUF减小ECT;然而，它仍然是评估的特异性和ESFS的脱靶效应非常有用。以最小化潜在的脱靶效应，在较低的水平多设计师ESFS的组合的表达也可以进行。在这种情况下，关断目标基因可以不被ESFS的低量的影响，而真正的目标的剪接将由协同起作用的多个ESFS受到影响。该解决方案是类似于在基因沉默使用的RNAi，其中靶向单个mRNA的多个位点的汇集的siRNA（各以降低的浓度）可降低脱靶效应的研究人员。
其他主要方法来操纵AS是使用反义寡核苷酸与所述mRNA前体的某些区域配对。与此相比现有的方法，该ESFS可导致在稳定转染的细胞延长的效果。此外，E的体内递送SF可以利用增加的基因治疗载体的武库，而反义寡核苷酸的体内递送非常难以控制。此外，该方法可以避免寡核苷酸的复杂且昂贵的修饰。使用各种诱导型启动子，也可以在正确的细胞类型和正确的时间更精确地控制ESF表达。该方法的主要缺点是相对较低的特异性（8-nt识别位点与典型反义寡核苷酸中的16至20-nt识别位点）。
选择性剪接的失调导致许多疾病，包括癌症26,27 。全基因组研究已经揭示了各种类型的癌症28,29,30 中超过15,000个肿瘤相关的剪接变体。例如，intronic肿瘤抑制基因的剪接位点突变通常导致外显子跳跃事件，并产生可能有助于肿瘤发生的异常蛋白质26,31,32。此外，发现一些剪接因子在许多癌症类型中过表达，这有助于细胞转化33,34 ，表明剪接因子也可以在癌症生物发生中起重要作用。因此，除了提供调节基因功能的有用工具之外，用设计者ESF进行拼接的操作还可能恢复癌症中的错配剪接事件，从而提供潜在的治疗工具。此外，通过将设计者PUF结构域与不同功能域融合，可以设计操纵各种RNA代谢过程的多种人为因子。例如，翻译激活物（GLD2）或翻译代谢物的融合与PUF结构域的融合蛋白（CAF1）产生可激活或抑制mRNA翻译的新因子27 。使用相同的设计原则，我们将非特异性RNA核酸内切酶结构域（PIN）与一系列设计者PUF结构域结合，以产生类似于DNA限制酶17的功能的人工位点特异性RNA内切核酸酶（ASRE）。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助R01-CA158283和国家自然科学基金委员会授予31400726到ZWYW由青年千人计划和中国国家自然科学基金（赠款31471235和81422038）的资助支持。 XY是由中国博士后科学基金会（2015M571612）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| PBS (1x) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P-4832 | Filter-sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
References
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