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Genetics

इंजिनियरिंग कृत्रिम कारक विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में वैकल्पिक स्पष्टीकरण में हेरफेर करने के लिए

doi: 10.3791/54967 Published: April 26, 2017
* These authors contributed equally

Summary

इस रिपोर्ट में उपन्यास आर्टिफिशियल स्पलीसिंग फैक्टर्स (एएसएफ) डिजाइन और निर्माण करने के लिए जैवइंजिनियरिंग विधि का वर्णन किया गया है जो स्तनधारी कोशिकाओं में लक्षित जीनों के विभाजन को विशेष रूप से व्यवस्थित करता है। आरएनए चयापचय के अन्य पहलुओं को हेरफेर करने के लिए इस पद्धति को और अधिक कृत्रिम कारक इंजीनियर करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है।

Abstract

सबसे यूकेरियोटिक RNAs के प्रसंस्करण प्रोटीन (RBPs) एक आरएनए मान्यता मॉड्यूल है, जो विशेष रूप से पूर्व mRNA लक्ष्य और एक प्रेरक डोमेन बांधता सहित मॉड्यूलर विन्यास, साथ बाइंडिंग शाही सेना द्वारा मध्यस्थता है। इससे पहले, हम एक प्रोग्राम शाही सेना बाध्यकारी पाड़, जो विभिन्न कृत्रिम RBPs इंजीनियर शाही सेना चयापचय हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था उत्पन्न करने के लिए मानव pumilio 1 में PUF डोमेन के अद्वितीय शाही सेना बाध्यकारी मोड का लाभ ले लिया। इधर, एक विस्तृत प्रोटोकॉल इंजीनियर Splicing कारक (ESFs) है कि विशेष रूप से लक्ष्य जीन के वैकल्पिक स्प्लिसिंग व्यवस्थित करने के लिए तैयार कर रहे हैं का निर्माण करने में वर्णित है। प्रोटोकॉल के लिए डिजाइन और एक विशिष्ट शाही सेना लक्ष्य, कैसे एक डिजाइनर PUF डोमेन और एक प्रेरक डोमेन fusing, और कैसे ESFs उपयोग करने के लिए लक्ष्य जीन की स्प्लिसिंग में हेरफेर करने के द्वारा एक ESF अभिव्यक्ति प्लाज्मिड का निर्माण करने के लिए एक अनुकूलित PUF पाड़ निर्माण करने के लिए कैसे भी शामिल है। इस विधि के प्रतिनिधि परिणामों में, हम भी आम assays का वर्णन किया हैस्पष्टीकरण संवाददाताओं का उपयोग करते हुए ईएसएफ गतिविधियों का, सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं में ईएसएफ का प्रयोग, और splicing परिवर्तनों के बाद के प्रभाव। इस रिपोर्ट में विस्तृत प्रोटोकॉल का पालन करके, अलग-अलग प्रकार के वैकल्पिक विभाजन (एएस) के विनियमन के लिए ईएसएफ डिजाइन और उत्पन्न करना संभव है, जिससे स्प्लिचिंग विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक नई रणनीति प्रदान की जा सकती है और अलग-अलग स्प्लेसिंग आईसोफॉर्म के कार्य इसके अलावा, एक डिज़ाइन किए गए पीयूएफ डोमेन के साथ विभिन्न कार्यात्मक डोमेनों को फ्यूज़ करके, शोधकर्ता, कृत्रिम कारक इंजीनियर कर सकते हैं जो आरएनए प्रसंस्करण के विभिन्न चरणों में हेरफेर करने के लिए विशिष्ट आरएनए को लक्षित करते हैं।

Introduction

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अधिकांश मानव जीनों वैकल्पिक splicing (एएस) अलग गतिविधियों, जो बहुत जीनोम 1, 2 की कोडिंग जटिलता में वृद्धि हुई है के साथ कई isoforms निर्माण करने के लिए गुज़रना पड़ता है। के रूप में जीन समारोह को विनियमित करने के लिए एक प्रमुख तंत्र प्रदान करता है, और यह कसकर विभिन्न सेलुलर और विकास के चरणों 3, 4 में विविध रास्ते के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है। क्योंकि स्प्लिसिंग misregulation मानव रोग 5, 6, 7, 8 का एक आम कारण है, स्प्लिसिंग विनियमन को निशाना बनाने के लिए एक आकर्षक चिकित्सकीय मार्ग बनता जा रहा है।

, स्प्लिसिंग विनियमन का एक सरलीकृत मॉडल के अनुसार के रूप में मुख्य रूप से पूर्व mRNA में -Elements सिस Splicing नियामक (SRES) कि स्प्लिसिंग वर्धक या वैकल्पिक एक्सॉनों के साइलेंसर के रूप में कार्य द्वारा नियंत्रित है। गुएसईआर विशेष रूप से विभिन्न पार -प्रोटीन कारकों की भर्ती करते हैं ( यानी स्पलेसिंग कारक) जो splicing प्रतिक्रिया 3 , 9 को बढ़ावा देते हैं या दबाने के लिए। अधिकांश ट्रांस- फैक्टिंग स्प्लिसींग कारकों में अलग-अलग अनुक्रम-विशिष्ट आरएनए बाध्यकारी डोमेन होते हैं जिससे वे अपने लक्ष्यों को पहचान सकते हैं और प्रभावकारी डोमेन विभाजन को नियंत्रित कर सकते हैं। सबसे प्रसिद्ध उदाहरण सीरिन / आर्गीनिन-समृद्ध (एसआर) प्रोटीन परिवार के सदस्य हैं जो एन-टर्मिनल आरएनए रिकॉग्निशन मोटीफ्स (आरआरएम) शामिल हैं, जो एक्सोनिक स्प्लिचिंग बढ़ाने और सी-टर्मिनल आर एस डोमेन को बाध्य करते हैं, जो एक्सॉन शामिल किए जाने को बढ़ावा देते हैं 10 । इसके विपरीत, एचएनआरएनपी ए 1 आरआरएम डोमेन के माध्यम से एक्सोनिक स्प्लिचिंग साइलेंसर से जुड़ा हुआ है और सी-टर्मिनल ग्लाइसीन-समृद्ध डोमेन 11 के माध्यम से एक्सॉन समावेशन को रोकता है। ऐसे मॉड्यूलर कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग करके, शोधकर्ताओं को कृत्रिम विभाजन करने वाले कारकों को एक अलग आरएएनए-बाईंडिंग डोमेन (आरबीडी) के संयोजन से अलग ईएफफैक के साथ संयोजित करने में सक्षम होना चाहिएटॉर डोमेन जो कि स्प्लिचिंग को सक्रिय या बाधित करते हैं

इस तरह की डिजाइन की कुंजी एक आरबीडी का उपयोग करना है जो प्रोग्राम योग्य आरएनए बाध्यकारी विशिष्टता के साथ दिए गए लक्ष्यों को पहचानती है, जो टेले डोमेन के डीएनए बाध्यकारी मोड के अनुरूप है। हालांकि, अधिकांश देशी विभाजन के कारण आरआरएम या के होमोलॉजी (केएच) डोमेन होते हैं, जो कम आरएनए तत्वों को कमजोर आत्मीयता के साथ पहचानते हैं और इस प्रकार एक पूर्वानुमानित आरएनए-प्रोटीन पहचान "कोड" 12 की कमी नहीं है पीयूएफ दोहराए जाने वाले प्रोटीन ( अर्थात पीयूएफ डोमेन) का आरबीडी एक अद्वितीय आरएनए मान्यता मोड है, जिससे पीयूएफ डोमेन के नए स्वरूप को विशेष रूप से अलग आरएनए लक्ष्य 13 , 14 को पहचानने की अनुमति मिलती है। प्रामाणिक पीयूएफ डोमेन में तीन α-helices के आठ दोहराव होते हैं, प्रत्येक 8-एनटी आरएनए लक्ष्य में एक एकल आधार को पहचानते हैं। दूसरे α-हेलिक्स के कुछ स्थानों पर एमिनो एसिड की ओर की चेन, वाटसन-क्रिक टी के साथ विशिष्ट हाइड्रोजन बंधन बनाते हैंवह आरएनए आधार, जो प्रत्येक दोहराने ( चित्रा 1 ए ) के शाही सेना बाध्यकारी विशिष्टता को निर्धारित करता है। पीयूएफ दोहराने के आरएनए आधार मान्यता के लिए कोड आश्चर्यजनक रूप से सरल ( चित्रा 1 ए ) है, जो पीयूएफ डोमेन की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है जो किसी भी संभावित 8-बेस संयोजन को मान्यता देते हैं (वेई और वांग 15 द्वारा समीक्षा)।

यह मॉड्यूलर डिजाइन सिद्धांत एक इंजीनियर पारेषण फैक्टर (ईएसएफ) की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है जिसमें एक कस्टमाइज्ड पीयूएफ डोमेन और एक स्प्लिचिंग मॉडुलन डोमेन ( यानी एक एसआर डोमेन या जीली-अमीर डोमेन) शामिल है। ये ईएसएफ अलग-अलग स्प्लिचिंग इवेंट्स को नियंत्रित करने के लिए स्प्लिचिंग एक्टिवेटर्स या इनहिबिटर के रूप में कार्य कर सकते हैं, और उन्होंने मानव रोग 16 , 17 से संबंधित अंतर्जात जीन के विभाजन को हेरफेर करने के उपकरण के रूप में उपयोगी साबित किया है। एक उदाहरण के रूप में, हमने पीईएफ-जीली-प्रकार ईएसएफ का निर्माण किया है ताकि विशेष रूप से बीसीएल-एक्स जीनसमर्थक अपोप्तोटिक कम isoform (BCL-XS) करने के लिए विरोधी अपोप्तोटिक लंबे isoform (बीसीएल एक्सएल) परिवर्तित। बीसीएल एक्स isoform के अनुपात स्थानांतरण कई विरोधी कैंसर कीमोथेरेपी दवाओं 16 करने के लिए कई कैंसर की कोशिकाओं को जागरूक करने के लिए पर्याप्त था, सुझाव इन कृत्रिम कारकों संभावित उपचारात्मक अभिकर्मकों के रूप में उपयोगी हो सकता है।

ज्ञात स्प्लिसिंग प्रेरक डोमेन (जैसे, एक रुपये या Gly-अमीर डोमेन) के साथ स्प्लिसिंग नियंत्रित करने के अलावा, इंजीनियर PUF कारकों को भी नई स्प्लिसिंग कारकों की गतिविधियों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण का उपयोग कर, हम दिखा दिया है कि कई एसआर प्रोटीन के सी-टर्मिनल डोमेन सक्रिय कर सकते हैं या स्प्लिसिंग बाधित जब विभिन्न पूर्व mRNA क्षेत्रों 18 के लिए बाध्य, RBM4 की alanine युक्त मूल भाव स्प्लिसिंग 19 बाधित कर सकते हैं कि, और कहा कि DAZAP1 की प्रोलाइन युक्त मूल भाव स्प्लिसिंग 20, 21 में वृद्धि कर सकते </ Sup>। इन नए कार्यात्मक डोमेन फ़ाइन-ट्यून स्प्लिसिंग करने के लिए कृत्रिम कारकों के अतिरिक्त प्रकार के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

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Protocol

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पीसीआर ओवरलैपिंग द्वारा 1. अनुकूलित के साथ एक PUF मचान का निर्माण शाही सेना बाध्यकारी विशिष्टता

  1. PUF दृश्यों कि विशेष रूप से प्रत्येक स्थिति 12 (: PUF मान्यता कोड प्राइमर दृश्यों के लिए तालिका 1 देख सकते हैं और शाही सेना के लिए देख चित्रा 1 ए) में अलग शाही सेना न्यूक्लियोटाइड पहचान युक्त पीसीआर प्राइमरों की एक श्रृंखला डिजाइन। प्रत्येक PUF दोहराने के लिए, डिजाइन चार अलग अलग प्राइमरों प्रत्येक स्थिति पर एक अलग आधार पहचान करने के लिए।
    नोट: ये प्राइमरों PUF टुकड़े कि एक साथ शामिल हो गए हैं (चित्रा 1 बी) उत्पन्न करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं के चार दौर की एक श्रृंखला में इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. विकल्प जोड़ स्थल के निकट लक्ष्य जीन की मान्यता साइट का चयन करें।
    नोट: इस साइट में उपयोगकर्ता द्वारा निर्णय लिया जा सकता है, और यह आमतौर पर भीतर 10 से चुना जाता है - NT विकल्प जोड़ साइटों से 50।
  3. राउंड 1: दृश्यों कोडिंग उत्पन्न4 पीयूएफ दोहराता, सार्वभौमिक पुल के टुकड़े और टोपी के टुकड़े के लिए।
    1. अनुकूलित पीयूएफ के प्रत्येक दोहराने के लिए मान्यता कोड को परिभाषित करने के लिए लक्ष्य साइट का उपयोग करें। पीयूएफ दोहराने के लिए पीसीआर प्राइमरों का सेट 1 - 8 का चयन करें। नीचे वर्णित अनुसार एक कस्टम पीयूएफ डोमेन का निर्माण करने के लिए पीसीआर के लगातार चार राउंड का संचालन करें ( चित्रा 1 बी )।
    2. पीसीआर के पहले दौर में मानक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण (2.5 μL 10x बफर, 0.5 μL 10 मिमी डीएनटीपी, 0.5 माइक्रोन 10 माइक्रोन के आगे और रिवर्स प्राइमरों, डीएनए टेम्प्लेट (मानव सीडीएनए या एक्सप्रेशन वेक्टर के 50 एनजी) डब्ल्यूटी पीयूएफ डोमेन का), और 0.5 यू उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ 25 μL अंतिम मात्रा में)।
      नोट: ये प्रतिक्रियाएं प्रत्येक पीयूएफ दोहराने से संबंधित डीएनए अनुक्रम, सार्वभौमिक पुल के टुकड़े, और अलग-अलग प्रतिबंध साइटों ( चित्रा 1 बी ) के साथ दो कैप टुकड़ों के लिए उत्पन्न करेगी। टेम्पलेट्स, प्राइमरों की संक्षिप्त सूची, इस चरण में इस्तेमाल किया और उत्पन्न पीसीआर उत्पादों 2 तालिका में दिखाए जाते हैं।
    3. पीसीआर कार्यक्रम सेट इस प्रकार है: 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट; 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 28 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 15 रों; और 72 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 5 मिनट। पीसीआर के दौरान बिंदु उत्परिवर्तन कम करने के लिए उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का प्रयोग करें।
  4. राउंड 2: आर 1 / आर 2 / R3 / R4 के लिए दृश्यों कोडिंग उत्पन्न (आर 1 - 4) और आर 5 / R6 / R7 / R8 (आर 5 - 8)।
    1. अलग कदम 1.3.3 में प्राप्त एक 1.5% agarose जेल (120 वी के एक निरंतर वोल्टेज में 25 मिनट) के साथ वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों। उम्मीद आकार एक जेल शुद्धि किट का उपयोग के सभी उत्पादों जेल-शुद्ध। पीसीआर के निम्नलिखित दौर में टेम्पलेट के रूप में इन उत्पादों की एक अलग मिश्रण का प्रयोग करें।
      नोट: 1: 1 के अनुपात मोटे तौर पर एक 1 में तीन पीसीआर उत्पादों मिक्स। वे आम तौर पर मात्रा निर्धारित की जा करने के लिए, जब तक प्रत्येक उत्पाद की तीव्रता जेल में समान दिखता है के रूप में की जरूरत नहीं है।
    2. एक tem को विशुद्ध पीसीआर उत्पादों के बारे में 5% मिक्सपीसीआर के अगले दौर में थाली। वैकल्पिक रूप से, एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर शुद्ध पीसीआर उत्पादों यों और टेम्पलेट मिश्रण में प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 15 एनजी का उपयोग करें।
    3. शुद्ध पीसीआर उत्पादों R1 / R2, R3 / R4, और पुल 2/3 मिश्रित रूप में टेम्पलेट्स और आर 1-एफ और प्राइमरों के रूप में R4-आर का प्रयोग करें। कदम 1.3 में वर्णित के रूप ओवरलैपिंग पीसीआर उत्पाद R1 प्राप्त करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें - 4।
    4. ओवरलैपिंग पीसीआर उत्पाद R5-8 (चित्रा 1 बी) प्राप्त करने के लिए मिश्रित टेम्पलेट्स और आर 5-एफ और R8 आर प्राइमरों के रूप में के रूप में शुद्ध पीसीआर उत्पादों R5 / R6, R7 / R8, और पुल 6-7 का उपयोग करें। पीसीआर कार्यक्रम सेट इस प्रकार है: 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट; 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 28 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 रों; और 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट। जेल-शुद्ध R1-4 और R5-8।
  5. दौर 3: R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (- 8 कैप के बगैर आर 1) के लिए कोडिंग दृश्यों उत्पन्न करें।
    1. पीसीआर के तीसरे दौर, शुद्ध R1-4, R5-8, और पुल 4/5 मिश्रित रूप में टेम्पलेट्स और आर 1-एफ और प्रयोग करने मेंप्राइमरों के रूप में आर 8-आर, कैप के बिना अतिव्यापी पीसीआर उत्पाद R1-8 प्राप्त करने के लिए चरण 1.3 में वर्णित पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थापना की गई।
    2. पीसीआर कार्यक्रम को निम्नानुसार सेट करें: 5 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर; 30 सेल्सियस के 30 चक्रों का तापमान 95 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस 55 डिग्री सेल्सियस और 55 डिग्री सेल्सियस 72 डिग्री सेल्सियस पर है। और 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट जेल-कैप के बिना आर 1-8 को शुद्ध करें।
  6. राउंड 4: पूर्ण पीयूएफ डोमेन के लिए कोडिंग अनुक्रम उत्पन्न करें।
    1. पीसीआर के आखिरी दौर में कैप और 5'-अंत और 3'-एंड कैप के बिना शुध्द आर 1-8 का प्रयोग मिश्रित टेम्पलेट और कैप-एफ और कैप-आर प्राइमरों के रूप में, पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थापना चरण 1.3 में वर्णित के अनुसार की गई है अंतिम उत्परिवर्तित पीयूएफ डोमेन प्राप्त करने के लिए
    2. पीसीआर कार्यक्रम को निम्नानुसार सेट करें: 5 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर; 30 डिग्री सेल्सियस 30 डिग्री सेल्सियस 95 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस 55 डिग्री सेल्सियस, और 72 मिनट पर 72 मिनट पर; और 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट
    3. अंतिम पुन: प्रोग्रामिंग पीयूएफ डोमेन के पीसीआर उत्पादों को जेल-शुद्ध करें बाद के चरणों में ESF अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के निर्माण के लिए इन उत्पादों का उपयोग करें। सेक्अंतिम PUF डोमेन की रीप्रोग्राम दृश्यों सत्यापित करने के लिए निर्माण खिलाडि़यों।
      नोट: कैप-एफ NLS (PPKKKRKV) BamH मैं और Xba मैं साइटों और कैप-आर के बीच एक स्टॉप कोडोन और साल मैं साइट (प्रतिबंध साइटों ESFs की अभिव्यक्ति वैक्टर, चित्रा 1 सी के निर्माण के लिए डिजाइन किए गए थे) को कूटबद्ध encodes।

2. ESFs के एक कार्यात्मक मॉड्यूल का निर्माण

  1. दो रणनीतियों सामान्यतः (राज्यसभा डोमेन Gly-अमीर डोमेन या) ESFs के कार्यात्मक मॉड्यूल क्लोन करने के लिए उपयोग किया जाता है: एक टेम्पलेट (कदम 2.2) के रूप में कुल मानव सीडीएनए का उपयोग कर पीसीआर द्वारा इन डोमेन बढ़ाना या सीधे डीएनए टुकड़े कि विभिन्न रुपये के लिए कोड के संश्लेषण के लिए या Gly-अमीर डोमेन (कदम 2.3)।
  2. 238 9G8 (NP001026854) की, अवशेषों SRP40 (NP008856) के 180-272, या अवशेषों 117 - - 221 SC35 (NP003007) का प्रयोग पीसीआर अवशेष 123 से रुपये डोमेन क्लोन करने के लिए। अवशेषों से Gly-अमीर डोमेन क्लोन 195 - 320 hnRNP ए 1 (NP_002127) की, अवशेषोंS 203 - 353 hnRNP A2 (NP112533), या अवशिष्ट 211 - 378 hnRNP A3 (NP919223)।
    1. एनसीबीआई प्राइमर डिज़ाइन उपकरण (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) या प्राइमर 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) का उपयोग प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए करें क्लोनिंग आरएस डोमेन या Gly- अमीर डोमेन (ESFs के कार्यात्मक मॉड्यूल)
      नोट: अग्रेषित प्राइमर में एन-टर्मिनल फ्लैग टैग है जो नहे आई साइट के बाद है। रिवर्स प्राइमर में अभिव्यक्ति वैक्टर ( चित्रा 1 सी ) में क्लोन करने के लिए एक बाम I साइट है।
    2. आरएस या Gly- समृद्ध डोमेन को बढ़ाने के लिए चरण 1.3 में वर्णित मानक PCR प्रतिक्रिया को सेट करें। पीसीआर कार्यक्रम को निम्नानुसार सेट करें: 5 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर; 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 डिग्री सेल्सियस, और 30 डिग्री सेल्सियस 72 डिग्री सेल्सियस पर; और 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट
  3. सीधे डीएनए संश्लेषण के माध्यम से आरओएस डोमेन या ग्लू-रिच डोमेन क्लोन करें। पीसीआर उत्पादों के निर्माण के बजाय चरण 2.2 में प्रभावकर्ता डोमेन के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना, syntheआकार एक oligonucleotide कि एक छोटी-टुकड़ा रुपये डोमेन (RSRSRSRSRSRS) या एक Gly-अमीर डोमेन (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) डीएनए ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स का एक वाणिज्यिक स्रोत का उपयोग encodes।

3. ESF अभिव्यक्ति प्लास्मिड का निर्माण

  1. किसी भी अभिव्यक्ति वेक्टर का उपयोग कर ESF अभिव्यक्ति प्लास्मिड का निर्माण।
    नोट: कोई व्यंजक का निर्माण PGL-Gly-MS2 (से संस्थान डी Biologie-CHR 11 डॉ आर Breathnach से एक उपहार) मूल रूप से इस्तेमाल किया गया था जो N- सी-टर्मिनल के लिए, एक फ्लैग एपीटोप, एक Gly से encodes hnRNP A1 के अमीर डोमेन, और MS2 कोट प्रोटीन। इसलिए, इस अभिव्यक्ति निर्माण निम्न चरण में एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाता है।
    नोट: एकाधिक क्लोनिंग साइटों के साथ अन्य अभिव्यक्ति वैक्टर का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, और मानक क्लोनिंग चरणों टुकड़े को एक साथ शामिल होने के लिए लागू किया जाएगा।
  2. अभिव्यक्ति प्लास्मिड (PGL-Gly-MS2) कदम 3.1 में वर्णित MS2 कोट प्रोटीन टुकड़ा दूर करने के लिए की 1.5 माइक्रोग्राम डाइजेस्ट। प्रतिबंधित प्रयोग करेंtion 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए BamH मैं और साल मैं endonucleases। ESFs की मान्यता मॉड्यूल डाइजेस्ट (एक NLS एन्कोडिंग और PUF डोमेन, कदम 1.5 में उत्पन्न रीप्रोग्राम) एक ही हालत में BamH मैं और साल मैं के साथ।
  3. प्रतिबंध के 5x लोड हो रहा है डाई जोड़े प्रतिक्रियाओं को पचाने और धीरे धीरे एक 1.5% agarose 120 वी जेल-शुद्ध पचा उत्पादों पर 40 मिनट के लिए एक डीएनए जेल दाग युक्त जेल के साथ कुल मात्रा Electrophorese।
  4. 1 के अनुपात, डीएनए ligase का 1 μL, और 10x बंधाव बफर के 1 μL: एक 3 में ESF आवेषण और अभिव्यक्ति वेक्टर डीएनए के एक शुद्ध मान्यता मॉड्यूल के साथ 10 μL बंधाव प्रतिक्रियाओं तैयार करें। सेते बंधाव प्रतिक्रियाओं रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर; इसके परिणामस्वरूप बने एक सीएमवी प्रमोटर (चित्रा 1 सी) के नियंत्रण में एक Gly-PUF प्रकार ESF (PGL-Gly-PUF) व्यक्त करता है।
  5. टुकड़ा निकालें 3 में 1 घंटे के लिए Nhe मैं और BamH मैं पाचन के साथ फ्लैग / Gly-अमीर डोमेन एन्कोडिंग7 डिग्री सेल्सियस इसे एक टुकड़ा के साथ बदलें जो आरएस डोमेन को एनकोड करता है (चरण 2.2 में जेनरेट किया गया है, जो नेहे I और बामएच I द्वारा भी पच चुका है ); जिसके परिणामस्वरूप निर्माण एक आरएस-पीयूएफ-प्रकार ESF ( चित्रा 1 सी ) को व्यक्त करता है।

4. Splicing रिपोर्टर का निर्माण

  1. उम्मीदवार अनुक्रमों ( अर्थात पीयूएफ डोमेन के लक्ष्य अनुक्रम) वाले ओलिगोनक्लियोटाइड्स को संश्लेषित करें, जो झो मी और एपा आई साइट्स या एक्स्हो आई और इकोआर आई साइट्स द्वारा सामने आए। 5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड एनील को पीयूएफ डोमेन की पहचान साइटों वाले डबल फंसे हुए आवेषण को प्राप्त करने के लिए जो Xho I और Apa I या Xho I और EcoR I साइट्स के एकत्रीकरण छोर से निकलते हैं
  2. पहले वर्णित मॉड्यूलर स्प्लिचिंग रिपोर्टर 22 से शुरू करें, pGZ3, जिसमें दो जीएफपी एक्सन शामिल हैं, जो एक परीक्षण एक्सन (मानव आईजीएफ 2 बीपी 1 के एक्सन 12, एन्स्समल आईडी ENSG00000159217) और इसके बाहरी घुसपैठ
    नोट: परीक्षा एक्ज़ोन को Xho I और Apa I साइटों के साथ इंजीनियर किया गया था, जिसका इस्तेमाल उम्मीदवार अनुक्रम (पीयूएफ डोमेन के लक्ष्य अनुक्रम) युक्त संश्लेषित ओलिगोनक्लियोटाइड्स को सम्मिलित करने के लिए किया जा सकता है। इस मॉड्यूलर splicing रिपोर्टर (pGZ3) प्लाज्मिड रिपॉजिटरी ऐड-जीन के माध्यम से प्रदान किया जाता है
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए झो मी और एपा आई प्रतिबंध अंतोन्यूक्लिज़ के साथ बेस रिपोर्टर पीजीजी 3 (चरण 4.2 में तैयार) डाइजेस्ट करें।
  4. चरण -3 में वर्णित अनुसार जेल-पचाने वाले उत्पादों को शुद्ध करें।
  5. चरण 4.1 पर उत्पन्न डबल फंसे हुए आवेषण के साथ 10 μL लगी प्रतिक्रियाएं तैयार करें और 3: 1 दाढ़ अनुपात में चरण 4.4 पर डीजे लिगेज के 1 μL और 10x ligation बफर के 1 μL पर उत्पन्न पचाने वाला पीजीजेड 3 वेक्टर तैयार करें। निर्माण splicing रिपोर्टर वेक्टर pGZ3 प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ligation प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
  6. पहले चरण में 4.1 में उत्पन्न डबल-फंक्ड आवेषण डालेंप्रकाशित संवाददाताओं, Pez -1 बी और Pez-2F (Xho मैं और ECOR मैं साइटों का उपयोग कर) (का उपयोग कर Xho मैं और आपा मैं साइटों) 23, प्रतिस्पर्धा 5 प्राप्त करने के लिए 'एस एस रिपोर्टर और प्रतिस्पर्धा 3' एस एस संवाददाता, चरणों में वर्णित के रूप में 4.3-4.5।
    नोट: स्प्लिसिंग संवाददाताओं से दोनों प्रकार के ऐड-जीन के माध्यम से उपलब्ध हो जाएगा।

5. Lentiviral का निर्माण ESF के लिए अभिव्यक्ति वेक्टर

  1. कदम 1.3 में वर्णित के रूप मूल अभिव्यक्ति वैक्टर (PGL-Gly-PUF या PGL-RS-PUF) MLU मैं / Spe मैं साइटों को शामिल करते प्राइमरों के साथ से पूर्ण लंबाई ESFs बढ़ाना मानक पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें। पीसीआर कार्यक्रम सेट इस प्रकार है: 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट; 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 28 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 30, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिनट; और 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट।
  2. एक पाचन प्रतिक्रिया, जेल शुद्धि, और बंधाव प्रतिक्रिया के माध्यम से,, lentiviral अभिव्यक्ति वेक्टर, pWPXLd में ESFs एकीकृत MLU के बीच Spe मैं साइटों, कदम 3.2-3.4 में वर्णित है।
  3. मानक कैल्शियम फॉस्फेट तेज़ी विधि का उपयोग करें, जैसा कि पहले 24 सूचना दी, वैक्टर, psPAX2 और pMD2.G, पैकेजिंग के साथ द्वारा HEK293T कोशिकाओं cotransfecting द्वारा lentiviruses उत्पन्न करने के लिए या तो pWPXLd-Gly-PUF (BCL-एक्स), pWPXLd-Gly-PUF ( wt) (क विशिष्टता नियंत्रण के रूप में), या pWPXLd-GFP (नकली)।
    1. बीज 5x10 6 10 सेमी बर्तन में HEK293T कोशिकाओं और कोशिकाओं रात भर में 10 Dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) के साथ पूरक की एमएल बढ़ने 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) एक humidified इनक्यूबेटर में पकवान प्रति 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर । 90% संगामी - जब कोशिकाओं 70 हैं अभिकर्मक निष्पादित करें।
    2. pMD2.G के 2.5 माइक्रोग्राम; तीन प्लास्मिड (पैकेजिंग वेक्टर के 7.5 माइक्रोग्राम, psPAX2 जोड़कर प्लाज्मिड मिश्रण तैयार करें और 10 माइक्रोग्राम या तो pWPXLd-Gly-PUF (BCL-एक्स), pWPXLd-Gly-PUF (भार) , या pWPXLd-GFP) एक 2 एमएल ट्यूब।
    3. 0.25 एम CaCl के 560 μL जोड़ें2 और 560 μL 2x बीबीएस समाधान 2 एमएल ट्यूब के लिए। धीरे से कई बार मिलाएं और आरटी पर 15 मिनट के लिए इसे सेवन करें ताकि अभिकर्मक मिश्रण तैयार किया जा सके।
    4. सभी अभिकर्मक मिश्रण को 10 सेमी व्यंजनों में जोड़ें। व्यंजन धीरे से भंवर करें और उन्हें 3% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में सेवन करें।
    5. मध्यम निकालें, प्रत्येक डिश में 2% एफबीएस के साथ ताजा डीएमईएम के 10 एमएल जोड़ें, और उन्हें 10% सीओ 2 और 37 डिग्री CO / N पर सेते हैं।
    6. व्यंजन से पहले सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें। प्रत्येक डिश में 2% एफबीएस के साथ ताजा डीएमईएम के 10 एमएल जोड़ें। 10% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन ओ / एन सेते हैं 4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला स्टोर करें
    7. व्यंजन से दूसरे सतह पर तैरने वाले को ले लीजिए। पहली और दूसरी फसल से सतह पर तैरनेवाला पूल। यह एक 0.4-माइक्रमी फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करके सेल मलबे के सतह पर तैरनेवाला को साफ़ करें। साफ़ सतह पर तैरनेवाला सीधे का उपयोग करें या इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
  4. HEK2 को संक्रमित करके लैन्टीवायरस के टिटर को निर्धारित करेंवायरस की तैयारी के धारावाहिक dilutions के साथ 93T कोशिकाओं, जैसा कि पहले 25 रिपोर्ट।

6. विशेष रूप से ईएसएफ के साथ एक्सीन इंक्लुजन और स्प्लिस साइट्स के वैकल्पिक उपयोग को गतिशील करना

  1. एक 24-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में बीज 2 एक्स 10 5 एचईके 2 9 3 टी कोशिकाएं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 10% एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम के 500 μL में रात भर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  2. धीरे से बोतलों को प्रयोग करने से पहले लिपोसॉमल अभिकर्मक अभिकर्मक मिलाएं। कम सीरम माध्यम के 50 μL में 2 μ एल लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक को पतला। धीरे से मिलाएं और उन्हें आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. पीजीएल-जीली-पीयूएफ अभिव्यक्ति वैक्टर के 0.04 माइक्रोग्राम और पीजीजेड 3 रिपोर्टर प्लास्मिड के 0.2 माइक्रोग्राम को एक बाँझ ट्यूब में कम सीरम माध्यम के 50 μL में डालना। पीजीएल-आरएस-पीयूएफ अभिव्यक्ति वैक्टर के 0.4 माइक्रोग्राम और पीजीजेड 3 रिपोर्टर प्लास्मिड के 0.2 माइक्रोग्राम को एक बाँझ ट्यूब में 50 μL कम सीरम माध्यम में कम करें। डीइल्यूट 0.4 ​​पीजीएल-आरएस-पीयूएफ अभिव्यक्ति वैक्टर और पीईजेड -1 बी या पीईजेड -2 एफ रिपोर्टर प्लास्मिड के 0.2 माइक्रोग्राम एक बाँझ ट्यूब में कम सीरम माध्यम के 50 μL में।
  4. आरटी पर ऊष्मायन के 5 मिनट के बाद, चरण 6.2 में तैयार पतला प्लास्मिड के साथ चरण 6.2 में तैयार पतला लियोपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक को धीरे से मिलाएं। आरटी पर 20 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं
  5. अभिव्यक्ति वैक्टर और अभिकर्मक अभिकर्मक वाले सभी अभिकर्मक मिश्रणों को चरण 6.4 में प्रत्येक अच्छी तरह से तैयार किया गया और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में आर्मीड इनक्यूबेटर में कम से कम 12 घंटे के लिए तैयार किया गया।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 12 घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं से मध्यम त्याग दें और उन्हें 500 μL फास्फेट-बफरर सलाइन समाधान (पीबीएस) / अच्छी तरह से धो लें।
  7. पीबीएस को त्यागें और प्रत्येक कूल्हे में 200 μ एल ट्रिप्सिन जोड़ो। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में आर्मीड इनक्यूबेटर में प्लेट को सेते हैं। डी को रोकने के लिए मध्यम के 1 एमएल जोड़ेंGestion और एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
  8. 5,000 मिनट के लिए 3 मिनट के लिए ट्यूबों को अपकेंद्रित्र और मध्यम त्यागें। पुनरावर्तक pipetting द्वारा कोशिकाओं को lyse करने के लिए प्रति ट्यूब आरएनए निष्कर्षण बफर के 0.5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए homogenized नमूनों सेते
  9. प्रत्येक आरएनए निष्कर्षण बफर-युक्त नमूना के लिए, 0.5 एमएल आरएनए निष्कर्षण बफर के प्रति क्लोरोफॉर्म के 0.1 एमएल जोड़ें। 15 एस के लिए ट्यूबों को उलटा और आरटी पर 3 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं।
  10. 15 मिनट के लिए 12,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस के ट्यूबों को अपकेंद्रित करें एक ताजा ट्यूब के लिए जलीय चरण स्थानांतरण। आरंभिक होमोजनाइज़ेशन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले आरएनए निष्कर्षण बफर के 0.5 एमएल प्रति आइसोप्रोपनॉल के 0.25 एमएल जोड़ें।
  11. भंवर द्वारा मिक्स करें और 10 मिनट के लिए आरटी पर उन्हें लें। ट्यूबों को 10 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 12,000 xg पर अपकेंद्रित्र सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, आरएनए की गति आमतौर पर ट्यूब के नीचे दिखाई देती है।
  12. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और आरएनए निष्कर्षण बफर के 0.5 एमएल प्रति 0.5 एमएल के 75% इथेनॉल के साथ आरएनए गोली धो लें।
  13. भंवर सख्ती और अपकेंद्रित्र यह 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7500 XG पर। सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरएनए गोली सूखी। RNase मुक्त पानी के 50 μL में शाही सेना भंग।
  14. 5U / μL DNase मैं, 10x बफर के 7 μL के 2 μL, और एच 2 ओ के 11 μL प्रत्येक 50 μL आरएनए समाधान में जोड़े। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं। 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें गरम करें DNase निष्क्रिय करने के लिए।
  15. 50 माइक्रोन का 1 μL oligo डीटी, 400 एनजी के 5 μL / μL आरएनए (2 माइक्रोग्राम), 10 मिमी dNTP के 1 μL, और एच के 3 μL: प्रत्येक नमूने के लिए, एक 0.2 एमएल nuclease मुक्त ट्यूब के लिए निम्न घटक जोड़ने 2 ओ रिवर्स पीसीआर निष्पादित करें।
    1. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रण गर्म करें और कम से कम 2 मिनट के लिए बर्फ पर यह सेते माध्यमिक संरचना के सुधार को रोकने के लिए। एक ही ट्यूब को निम्न घटक जोड़ें: 5x के 4 μL प्रथम किनारा बफर, 0.1 एम डीटीटी का 1 μL, 1 μL 200 यू / μL के ट्रांसस्क्रिप्टेज रिवर्स, और एच 2 के 4 μL </ Sub> हे। धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स और 60 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके प्रतिक्रिया बंद करो।
  16. 10x पीसीआर बफर, 10 मिमी dNTP मिश्रण, 10 माइक्रोन आगे प्राइमर का 1 μL, के 0.5 μL का 2.5 μL 10 माइक्रोन का 1 μL: प्रत्येक नमूने के लिए, शरीर लेबल पीसीआर को पूरा करने के लिए एक पीसीआर ट्यूब के लिए निम्न घटक जोड़ने रिवर्स प्राइमर, 5 यू / μL Taq डीएनए पोलीमरेज़ के 0.25 μL, 25 एनएम Cy5-dCTP के 0.5 μL, और कदम 6.15 में तैयार सीडीएनए के 2 μL।
    1. 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रतिक्रिया गरम करें अणुओं denature करने के लिए, पीसीआर के 25 चक्र प्रदर्शन (30 s के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस 30, और 72 डिग्री सेल्सियस 30 रों), के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया रखना 7 मिनट, और फिर इसे एक 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ पर छोड़ दें।
  17. एक 1x Tris आधार, बोरिक एसिड, और EDTA (TBE) बफर के साथ एक 10% पॉलीएक्रिलमाइड जेल के माध्यम से वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पादों का समाधान करें। एक स्कैन एक प्रतिदीप्ति स्कैनर का उपयोग कर प्रदर्शन करते हैं। नापडेन्सिटोमेट्री सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए प्रत्येक विभाजन की राशि isoform

7. एनोफोनीस बीसीएल-एक्स स्प्लिसींग को मॉडिलेट करने के लिए ईएसएफ़ का प्रयोग करें और अपोप्टोसिस पर इसका प्रभाव मापें

  1. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए प्लेट 2 x 10 5 हेला कोशिकाएं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में इनक्यूबेटर में 10% एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम के 500 μL में रात भर कोशिकाओं को बढ़ाना।
  2. 12 घंटे के बाद, 2 ग्राम पीजीएल-जीली-पीयूएफ (डब्ल्यूटी) या 0.2 माइक्रोग्राम, 1 माइक्रोग्राम और पीजीएल-जी-पीयूएफ (531) के 2 माइक्रोग्राम के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट करें (एक पुनर्नवीक्षित पीयूएफ डोमेन जो बीसीएल-एक्स प्री- उच्च संबंध के साथ एमआरएनए, चित्रा 2 ए देखें )।
  3. बाद में 24 घंटे, कोशिकाओं को फसल 1/3 कोशिकाएं आरएनए अलगाव और पीसीआर विश्लेषण (चरण 6.8 - 6.17) के लिए होती हैं और प्रोटीन अलगाव के लिए 2/3 हैं।
  4. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, 2x सोडियम डाइडसायल सल्फेट-पॉलीएक्रिलाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस पृष्ठ) में कुल सेल छर्रों को 10 मिनट के लिए लोड हो रहा है, और फिर एक 12% एसडीएस-पृष्ठ जेल में प्रोटीन को हल। एक nitrocellulose झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरित करें।
  5. आरटी पर 1 घंटे के लिए 5% दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक और सेते झिल्ली हे / एन कस्पासे 3 (1: 1,000), PARP (1: 1,000), या बीटा actin (1: 5,000) प्राथमिक एंटीबॉडी (में पतला 5% दूध) 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  6. पीबीएस एक कमाल शेकर पर आर टी 3x पर 5 मिनट के लिए 0.1% बीच 20 (पीबीएस टी) युक्त के साथ झिल्ली धो लें। आरटी पर 1 घंटे के लिए: (5000, 5% दूध में पतला 1) एचआरपी से जुड़े एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं।
  7. आरटी पर पीबीएस टी 3x साथ झिल्ली धो लें, और फिर ईसीएल पश्चिमी सोख्ता का पता लगाने अभिकर्मकों का उपयोग कर झिल्ली का विकास।
  8. पाली एल लाइसिन (पीएलएल) के 250 μL coverslips पर जोड़ें, आरटी पर 15 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं, और तरल बंद साइफन। 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस 3x साथ पीएलएल-लेपित गिलास coverslips धो लें। इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख मापने apoptosis, बीज 5 x 10 5 हेला एक 6 अच्छी तरह से थाली में पाली लाइसिन-लेपित गिलास coverslips पर कोशिकाओं के लिए। transfect पीजीएल-जीली-पीयूएफ (डब्लूटी) या पीजीएल-जीली-पीयूएफ (531) प्लास्मिड एक लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करते हुए हेला कोशिकाओं में (चरण 6.1 - 6.5 देखें)।
  9. अभिकर्मक के बाद 24 घंटे, आरटी पर 20 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्माल्डहाइड (पीएफए) के 1 एमएल के साथ कन्स्पिटल्स पर कोशिकाओं को ठीक करें सावधानी: पीएफए ​​विषाक्त है; एक धूआं हुड में देखभाल के साथ इसे संभाल
  10. धीरे धीरे 1 एमबीएल 1x पीबीएस जोड़कर coverslips पर कोशिकाओं को धो लें। उन्हें 5 मिनट के लिए सेते हैं पिपेट्स के साथ पीबीएस निकालें धोने 3x दोहराएँ
  11. 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स -100 के साथ कोशिकाओं को स्थिर करें और फिर उन्हें 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें।
  12. 1 मिनट पीबीएस में 3% बोवाइन सीरम अल्बुमिन (बीएसए) के साथ कोशिकाओं को अवरुद्ध करें और उन्हें 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें।
  13. फ्लेग एंटिबॉडी 1: 1000 में 3% बीएसए / पीबीएस और पिपेट को पतला फ्लैग एंटीबॉडी के 30 μL पतला शीट पर पतला करें।
  14. कोशिकाओं के साथ कसलीप को बाहर निकालें, लैब पोंछे के साथ अतिरिक्त बफर को सावधानी से सूखें, और इसे 30 μL विरोधी फ़्लैग पर उल्टा (सेल-साइड डाउन) डालेंOlution आरटी पर 1 घंटे के लिए इसे सेते हैं।
  15. कवरलिप के ऊपर 500 μL का 1x पीबीएस जोड़ें, जब तक कि कवरलिप समाधान की चोटी पर तैर न हो जाए। कुओं में 1x पीबीएस के साथ 6-अच्छी तरह से थाली पर लौटें।
  16. 5x प्रत्येक के लिए इसे 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें।
  17. 3% बीएसए / पीबीएस में विरोधी-माउस द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 500) पतला; फिर, प्रत्येक कंसोल के लिए 30 μL का उपयोग करें कंसोलिप को द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान पर उल्टा रखें और आरटी पर 15 मिनट के लिए इसे लें।
  18. चरण 7.15 में वर्णित के रूप में पैराफिलम से कंसलिप को निकालें। इसे 6-अच्छी तरह से प्लेट में डालकर 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस 3x के साथ धो लें।
  19. माउंटिंग माध्यम (डीएपीआई के साथ) के साथ कवरलाइट माउंट करें, अतिरिक्त माध्यम को हटा दें, और नेल पॉलिश के साथ किनारे पर मुहर लगाएं।
  20. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (100X बढ़ाई में) का उपयोग करके कोशिकाओं को विज़ुअलाइज़ करें और एक डिजिटल कैमरा का उपयोग करके उन्हें तस्वीर दें।
    नोट: ईएसएफ की अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंस-लेबले द्वारा देखी गई हैफ्लैग टैग के खिलाफ माध्यमिक एंटीबॉडी, और परमाणु विखंडन डीएपीआई धुंधला होकर देखा गया है।

8. ESF को व्यक्त करने वाले विभिन्न कैंसर कोशिकाओं के अपोप्टोसिस को मापें

  1. स्प्लिट 2 एक्स 10 6 हेला कोशिकाओं, एमडीए-एमबी-231 कोशिकाएं और ए 549 कोशिकाओं में 4 एमएल डीएमईएम के साथ 60 एमएम व्यंजनों में 10% एफबीएस के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में प्रोपेडियम के साथ एपोपोसिस का पता लगाने में पूरक। आयोडाइड (पीआई) धुंधला हो जाना
  2. बाद में 24 घंटे, मध्यम ताज़ा करें और लैन्टीवायरस तैयार करें, जैसा कि पहले 24 की सूचना दी थी।
  3. 10 x 10 6 लेंटिवायरस पीडब्ल्यूपीएक्सड-ग्लू-पीयूएफ (डब्लूटी), पीडब्ल्यूपीएक्स-ग्लाइड-पीयूएफ (531), या पीडब्लूपीएक्स-जीडीपी स्टॉक को वायरस के अनुपात को 5 के बराबर बनाने के लिए ताजा माध्यम के 4 एमएल में पतला करें।
  4. चरण 8.3 में तैयार वायरस से युक्त माध्यम के प्लेटों में मध्यम को 4 एमएल और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं। संक्रमण के बाद 12 घंटे, मध्यम बदलें।
  5. संक्रमण के 24 घंटे के बाद, पीबीएस समाधान में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को एकत्र और दाग़ें जिसमें 2 माइक्रोग्राम / एमएल पीआई की अंतिम एकाग्रता होती है।
  6. पहले से 16 बताए अनुसार प्रवाह कोशिकामीटर के साथ पीआई-स्टेन्ड कोशिकाओं का विश्लेषण करें

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Representative Results

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यह रिपोर्ट ESF और splicing पत्रकारों के डिजाइन और निर्माण के लिए पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह अंतर्जात जीन के रूप में एएस के हेरफेर करने में ईएसएफ के आगे आवेदन को रेखांकित करता है। ESF- मध्यस्थता splicing परिवर्तन के ठेठ परिणामों को वर्णन करने के लिए, हम एक उदाहरण के रूप में हमारे पिछले काम से डेटा का उपयोग करते हैं। अलग-अलग कार्यात्मक डोमेन के साथ ईएसएफ का उपयोग लक्ष्य कैसेट एक्सॉन ( चित्रा 1 डी एंड ) को शामिल करने या बाधित करने के लिए किया जा सकता है। ईएसएफ रिपोर्टर सिस्टम ( चित्रा 1 एफ एंड जी ) में वैकल्पिक 5 'और 3' बाली साइट्स के उपयोग को भी प्रभावित कर सकता है।

अंतर्जात जीन के वैकल्पिक विभाजन को विशेष रूप से डिजाइनर ईएसएफ के साथ विनियमित किया जा सकता है। हमने इस एप्लिकेशन को स्पेस द्वारा प्रदर्शित किया हैifically को लक्षित बीसीएल एक्स, जो विकल्प 5 'जोड़ साइटों के साथ दो विरोधी isoforms में spliced ​​जा सकता है। हम एक ESF, Gly-PUF (531), कि वैकल्पिक 5 'जोड़ साइटों के बीच एक 8 NT आरएनए तत्व पहचानता बनाया गया है। यह Gly-PUF (531) विशेष रूप से बीसीएल XS (चित्रा 2 ए) के उत्पादन की दिशा में स्प्लिसिंग स्थानांतरित कर दिया। Gly-PUF (531) हेला कोशिकाओं में, बीसीएल XS isoforms और बीसीएल XS प्रोटीन एक खुराक पर निर्भर ढंग से वृद्धि हुई के स्तर परासंक्रमित, जबकि नियंत्रण ESF के बाद, Gly-PUF (WT), अनुपात को प्रभावित नहीं किया बीसीएल XS की बीसीएल एक्सएल (चित्रा 2 बी और सी) के लिए। इसके अलावा, डिजाइनर ESF कस्पासे 3 और पाली (ADP-राइबोज़) पोलीमर्स (PARP), दो apoptosis के प्रसिद्ध आणविक मार्कर (चित्रा 2 डी) की दरार पैदा कर सकते हैं। जैसी उम्मीद थी, डिजाइनर ESFs मुख्य रूप से, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के नाभिक में स्थानीयकृत हैं डेमो के रूप मेंइम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा nstrated (चित्रा 2 ई)। लगातार, Gly-PUF द्वारा स्प्लिसिंग पारी (531) परमाणु डीएनए के विखंडन के कारण होता है, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं apoptosis दौर से गुजर रहे (चित्रा 2 ई)। अपोप्तोटिक कोशिकाओं की वृद्धि आगे बेतरतीब ढंग से चुने क्षेत्रों से 200 से अधिक कोशिकाओं का परीक्षण करके और खंडित परमाणु डीएनए (चित्रा 2 एफ) के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत मात्र निर्धारण द्वारा पुष्टि की गई।

आकृति 1
चित्रा 1: डिजाइन ESFs की और Modulating एक्सॉन लंघन में उनकी गतिविधि। (ए) विशिष्ट PUF डोमेन और आरएनए लक्ष्यों के बीच बंधन आरएनए PUF संरचना और एक योजनाबद्ध आरेख से दिखाया गया है। से प्रत्येक के लिए PUF बाध्यकारी कोडचार शाही सेना अड्डों, अलग अलग रंग के साथ सही पर दिखाया गया है, PUF म्यूटेशन डिजाइन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी) के एक स्वनिर्धारित PUF डोमेन प्राप्त करने के लिए चार्ट प्रवाह। PUF है कि "UGUAUAUA" पहचानता है एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एक 4-दौर पीसीआर रणनीति अनुकूलित शाही सेना बाध्यकारी विशिष्टता (रंग पैनल एक करने के लिए इसी तरह कोडित) के साथ एक PUF पाड़ इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। पहले दौर में पीसीआर प्राइमरों की एक श्रृंखला है कि दो आसन्न PUF दोहराता के लिए वांछित आरएनए मान्यता कोड को शामिल चार टुकड़े है कि एक पूर्ण PUF प्रोटीन के आठ आरएनए मान्यता कोड शामिल (आर 1 / R2, R3 / R4 उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है , आर 5 / R6, और R7 / R8)। एक एन टर्मिनल परमाणु स्थानीयकरण संकेत, एक सी-टर्मिनल स्टॉप कोडोन एन्कोडिंग कैप टुकड़े, और पुल के टुकड़े को भी अलग से उत्पादित कर रहे हैं (5'-अंत और 3'-अंत टोपी, पुल 2/3, पुल 4/5, और पुल 6 / 7)। दूसरे दौर में, नए टेम्पलेट (उचित पुल के साथ आसन्न दोहराता एन्कोडिंग अतिव्यापी टुकड़े मिश्रण जैसे, मिश्रण R1 / R2 द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं,R3 / R4, और पुल 2/3 R1 के लिए टेम्पलेट उत्पन्न करता है - 4) और फिर डीएनए पोलीमरेज़ के साथ विस्तार अंतराल को भरने। इसी तरह, तीसरे दौर R1-4, R5-8, और पुल 4/5 मिलती है। अंत में, चौथे दौर अभिव्यक्ति वैक्टर के बाद क्लोनिंग के लिए क्लोनिंग साइटों के साथ एक साथ PUF डोमेन की 5'-अंत और 3'-अंत टोपियां कहते हैं। (सी) ESFs की मॉड्यूलर डोमेन संगठन। एक फ्लैग एपीटोप (ESFs का पता लगाने के लिए), एक कार्यात्मक मॉड्यूल (एक Gly-अमीर डोमेन या एक रुपये डोमेन), एक NLS: ESFs सी-टर्मिनल के लिए N- से, सीएमवी प्रमोटर (तीर) और एनकोड से प्रेरित हैं (ESFs के परमाणु स्थानीयकरण सुविधा के लिए), और एक आरएनए-मान्यता डोमेन (एक PUF डोमेन)। Nhe मैं और BamH मैं, जबकि Xba मैं और साल मैं एक आरएनए-मान्यता डोमेन डालने के लिए तैयार कर रहे हैं एक कार्यात्मक मॉड्यूल सम्मिलित करने के लिए डिजाइन किए हैं। (डी) Gly-PUF ESFs सह व्यक्त एक्सॉन लंघन पत्रकारों के साथ कर रहे हैं, और स्प्लिसिंग पैटर्न आरटी-पीसीआर द्वारा assayed है। संशोधित PUF एक ख विशेष रूप से 8-मेर लक्ष्यों को ए और बी, क्रमशः (एक ही रंग में) से बद्ध करता है। सभी संयोजनों का उपयोग किया जाता है, इसलिए विभिन्न रंगों के पीयूएफ लक्ष्य जोड़े नियंत्रण के रूप में कार्य करते हैं। एक्सॉन लंघन ( ) पर आरएस-पीयूएफ के प्रभाव, प्रतिस्पर्धी 5 'ब्याह साइट ( एफ ), या प्रतिस्पर्धी 3' बेंगलुरु साइट रिपोर्टर ( जी ) पैनल डी के समान विधियों द्वारा परख रहे थे। आरटी-पीसीआर के डेटा वैंग एट अल से हैं 16 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : ईएसएफ के साथ अंतर्जात बीसीएल-एक्स पूर्व-एमआरएनए स्पलिशिंग का विनियमन। ( ) अंतर्जात बीसी के वैकल्पिक splicing के योजनाबद्धlx पूर्व mRNA। की बीसीएल एक्स एक्सॉन 2 में दो विकल्प 5 'जोड़ साइट बीसीएल एक्सएल और बीसीएल XS विभिन्न आकार के दो isoforms, उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है। दो 5 'जोड़ साइटों के बीच अनुक्रम UGUGCGUG ESF लक्ष्य के रूप में चयन किया जाता है, और WT PUF 1, 3, और 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) रीप्रोग्राम कर रहे हैं (तारांकन) को दोहराता है इस लक्ष्य अनुक्रम पहचान करने के लिए। जिसके परिणामस्वरूप ESF एक Gly-अमीर डोमेन युक्त नीचे की ओर 5 'एस एस (लाल तीर द्वारा इंगित) के उपयोग को रोकता है। (बी) बीसीएल एक्स 5 'एस एस उपयोग के मॉड्यूलेशन। Gly-PUF (531) अभिव्यक्ति निर्माण के विभिन्न मात्रा में हेला कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं। Gly-PUF (WT) एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। की बीसीएल एक्स दो isoforms एक्सॉनों 1 और बीसीएल एक्स जीन की 3 करने के लिए इसी प्राइमरों का उपयोग कर आरटी-पीसीआर के साथ पाया जाता है। बीसीएल XS isoform का प्रतिशत मात्रा निर्धारित और नीचे दिखाया गया है। (सी) ESFs बीसीएल एक्सएल और बीसीएल XS की अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित। नमूने पैनल बी में के रूप में एक ही क्रम में लोड किए गए हैं, और सभी प्रोटीन की गिरफ्तारीई पश्चिमी दाग ​​द्वारा पता लगाया। ESFs की अभिव्यक्ति विरोधी फ्लैग एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है, और ट्यूबिलिन स्तर एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। (डी) ESF अभिव्यक्ति निर्माणों के विभिन्न मात्रा में हेला कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, PARP और कस्पासे 3. नमूने की दरार में जिसके परिणामस्वरूप अभिकर्मक के बाद पश्चिमी धब्बा 24 घंटे के द्वारा पता लगाया जाता है। एक्टिन स्तर एक नियंत्रण के रूप में पाया जाता है। (ई) ट्रांसफ़ेक्ट हेला कोशिकाओं में ESFs के subcellular स्थानीयकरण विरोधी फ्लैग एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा पता चला है। कोशिकाओं DAPI के साथ सह दाग हैं नाभिक को दिखाने के लिए। कुछ नाभिक, विशेष रूप से Gly-PUF (531) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में, apoptosis के कारण खंडित कर रहे हैं। स्केल बार: 5 सुक्ष्ममापी। (एफ) अपोप्तोटिक कोशिकाओं का प्रतिशत (खंडित परमाणु डीएनए के साथ यानी कोशिकाओं) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों का अनियमित रूप से चुने क्षेत्रों से मापा जाता है। सलाखों, मतलब संकेत मिलता है, जबकि डॉट्स दो प्रयोगों से डेटा संकेत मिलता है। आकृतिवाँग एट अल द्वारा हमारी पिछली रिपोर्ट से संशोधित किया गया है प्रकृति प्रकाशन समूह की नीति के अनुसार 16इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

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यह रिपोर्ट कृत्रिम विभाजन करने वाले कारकों के डिजाइन और निर्माण के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है जो विशेष रूप से लक्ष्य जीन के वैकल्पिक splicing में हेरफेर कर सकते हैं। यह विधि कस्टम आरआईए बाध्यकारी पाड़ का निर्माण करने के लिए पीयूएफ के अनन्य आरएनए बाध्यकारी मोड का लाभ उठाती है, जिसे कस्टमाइज किया गया है। इसका प्रयोग या तो सक्रिय करना या दबाना splicing के लिए किया जा सकता है

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम reprogramed PUF डोमेन की पीढ़ी है जो ESF की विशिष्टता को परिभाषित करता है। एक पीसीआर सिलाई प्रोटोकॉल को पीयूएफ स्कैफोल्ड की तेजी से पीढ़ी के लिए विकसित और अनुकूलित किया गया है। इसकी सफलता की कुंजी 1: 1: 1 के लिए विभिन्न ओवरलैपिंग टेम्पलेट्स के अनुपात को समायोजित करना है। प्रत्येक दौर के बाद पीसीआर उत्पादों की शुद्धि भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि अनजाने वाले उत्पादों के अंतिम दौर से प्राइमर प्रदूषण हो सकता है। एक और महत्वपूर्ण कदम है अर्ध-मात्रात्मक आरटी-पीसीआर का उपयोग करके विभाजन अनुपात को परखना। आम तौर पर, बहुत आदमी भीवाई प्रवर्धन चक्रों से बचा जाना चाहिए, क्योंकि वे पीसीआर प्रतिक्रिया को बढ़ा सकते हैं एक splicing रिपोर्टर के सह-अभिव्यक्ति के साथ हमारे प्रयोगों में, 20-25 चक्र नियमित रूप से उपयोग किए गए थे, लेकिन यह अंतर्जात जीन के विभाजन को मापने के दौरान एमआरएनए की बहुतायत पर निर्भर करता है। जब एक नई जोड़ी प्राइमर्स का उपयोग करके splicing isoforms का प्रमाणन करते हैं, तो हम हर बार पीसीआर प्रयोग को कैलिब्रेट करने का सुझाव देते हैं, जैसा कि पहले 16 वर्णित है।

डिजाइनर ईएसएफ के साथ एक संभावित सीमा उनके ऑफ-टाईबिल प्रभाव है, क्योंकि विशिष्टता पीयूएफ स्कैफोल्ड में दोहराव की संख्या से निर्धारित होती है। Wildtype PUF एक 8-एनटी साइट को पहचानता है, जो किसी एसएआरएनए की विशिष्टता के बराबर है जो "बीज मैच" के माध्यम से अपने लक्ष्य को पहचानता है। हालांकि, चूंकि किसी भी 8-एनटी अनुक्रम एक बार प्रतिलिपि 65,000 एनटी लंबा (4 8 = 65,536) में एक बार हो सकता है, वहां डिजाइनर पीयूएफ द्वारा मान्यता प्राप्त अन्य ऑफ-टैक्स्ट टेप होंगे। ऑफ-टार्गेट एफ़ect अतिरिक्त दोहराता साथ PUFs का उपयोग करके कम किया जा सकता; हालांकि, यह अभी भी विशिष्टता और ऑफ-टारगेट ESFs के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है। संभावित ऑफ-टारगेट प्रभाव को कम करने के लिए, एक निचले स्तर पर कई डिजाइनर ESFs का एक संयोजन की अभिव्यक्ति भी किया जा सकता है। इस तरह के एक मामले में, बंद-लक्षित जीन, ESFs की कम मात्रा से प्रभावित नहीं किया जा सकता है, जबकि वास्तविक लक्ष्य की स्प्लिसिंग कई ESFs कि synergistically ढंग से काम से प्रभावित हो जाएगा। यह समाधान क्या शोधकर्ताओं आरएनएआई, जहां जमा siRNAs (एक कम एकाग्रता पर प्रत्येक) है कि एक ही mRNA के कई साइटों को लक्षित ऑफ-टारगेट प्रभाव कम कर सकते हैं के साथ जीन गुप्तता में इस्तेमाल के समान है।

अन्य मुख्य विधि में हेरफेर करने के रूप में एंटी-सेन्स ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स कि पूर्व mRNA के कुछ क्षेत्रों के साथ जोड़ी का प्रयोग है। इस मौजूदा विधि की तुलना में, ESFs स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में लंबे समय तक प्रभाव हो सकता है। इसके अलावा, ई के इन विवो वितरणएस एफ, जीन थेरेपी वैक्टर की बढ़ती शस्त्रागार का लाभ ले सकते हैं, जबकि एंटी-सेन्स ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स का इन विवो वितरण बहुत नियंत्रित करने के लिए कठिन है। इसके अलावा, इस विधि ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स का जटिल और महंगा संशोधनों से बच सकते हैं। विभिन्न inducible प्रमोटरों का उपयोग करना, सही प्रकार की कोशिकाओं में और सही समय पर ESF अभिव्यक्ति का एक अधिक सटीक नियंत्रण भी प्राप्त किया जा सकता है। इस विधि का मुख्य नुकसान अपेक्षाकृत कम विशिष्टता (विशिष्ट एंटिसेंस ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स में एक 16- 20-NT मान्यता साइट बनाम एक 8 NT मान्यता साइट) है।

वैकल्पिक स्प्लिसिंग का अनियंत्रण कैंसर 26, 27 सहित कई बीमारियों का कारण बनता है। जीनोम चौड़ा पढ़ाई के कैंसर 28, 29, 30 के विभिन्न प्रकार में 15,000 से भी अधिक ट्यूमर जुड़े जोड़ वेरिएंट पता चला है। उदाहरण के लिए, intronicट्यूमर शमन करने वाले जीन की जोड़-साइट म्यूटेशन अक्सर एक्सॉन-लंघन घटनाओं का कारण और असामान्य प्रोटीन है कि ट्यूमर उत्पत्ति 26, 31, 32 में योगदान कर सकते उत्पादन। इसके अलावा, कुछ स्प्लिसिंग कारकों कई प्रकार के कैंसर, जो कोशिका परिवर्तन 33, 34 के लिए योगदान में overexpressed किया जाना है, यह दर्शाता है कि स्प्लिसिंग कारकों को भी कैंसर जीवजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं पाए जाते हैं। इसलिए, जीन समारोह व्यवस्थित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करने के अतिरिक्त, डिजाइनर ESFs साथ स्प्लिसिंग के हेरफेर misregulated स्प्लिसिंग घटनाओं कैंसर में पुनर्स्थापित कर सकते हैं, इस प्रकार एक संभावित चिकित्सीय उपकरण प्रदान करते हैं। इसके अलावा, विभिन्न कार्यात्मक डोमेन के साथ एक डिजाइनर PUF डोमेन फ़्यूज़ होने से, कई कृत्रिम कारक है कि विभिन्न आरएनए चयापचय प्रक्रियाओं में हेरफेर बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक अनुवादकीय उत्प्रेरक के संलयन (GLD2) या एक अनुवादकीय प्रतिनिधिपीयूएफ डोमेन के साथ Reseror (CAF1) ने उपन्यास कारकों का निर्माण किया है जो एमआरएनए अनुवाद 27 को सक्रिय या बाधित कर सकता है। उसी डिज़ाइन प्रिंसिपल का इस्तेमाल करते हुए हमने कृत्रिम साइट-विशिष्ट आरएनए एंडोन्यूक्ल्यूज (एएसआरई) उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइनर पीयूएफ डोमेन की एक श्रृंखला के साथ एक गैर-विशिष्ट आरएनए एंडोन्यूक्लेईज़ डोमेन (पिन) को जोड़ा है जो डीएनए प्रतिबंध एंजाइम के अनुरूप काम करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच अनुदान R01-CA158283 और एनएसएफसी अनुदान 31400726 द्वारा समर्थित था, जेडडब्ल्यूवाईडब्ल्यू को युवा हजार प्रतिभा कार्यक्रम और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान 31471235 और 81422038) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। XY को चीन के पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (2015 एम 571612) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

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References

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इंजिनियरिंग कृत्रिम कारक विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में वैकल्पिक स्पष्टीकरण में हेरफेर करने के लिए
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Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).More

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