Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen
Summary
Dit rapport beschrijft een werkwijze biotechnologie ontwerpen en bouwen van nieuwe kunstmatige splicingfactoren (ASFS) die specifiek de splitsing van doelgenen te moduleren in zoogdiercellen. Deze werkwijze kan verder worden uitgebreid met verschillende kunstmatige engineering factoren andere aspecten RNA metabolisme manipuleren.
Abstract
De verwerking van de meeste eukaryote RNA wordt gemedieerd door RNA-bindingseiwitten (RBPs) met modulaire configuraties, met inbegrip van een module RNA herkenning, dat specifiek bindt aan de pre-mRNA target en een effector domein. Eerder hebben we gebruik van de unieke RNA bindingsmodus van de PUF-domein genomen humaan Pumilio 1 aangeleerde RNA-bindende scaffold, dat werd gebruikt om verschillende kunstmatige RBPs ingenieur RNA metabolisme manipuleren genereren. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven Engineered splicingfactoren (ESFT) die speciaal zijn ontworpen om de alternatieve splicing van doelgenen te moduleren construeren. Het protocol omvat het ontwerpen en bouwen van een aangepaste PUF matrix voor een specifiek RNA-doelwit, hoe een ESF expressieplasmide te construeren door het fuseren ontwerper PUF domein en een effector domein en hoe ESFT om de splitsing van doelgenen te manipuleren. In de representatieve resultaten van deze methode, hebben we ook beschreven gemeenschappelijke assaysVan ESF-activiteiten met behulp van splicing verslaggevers, de toepassing van ESF in gekweekte menselijke cellen, en het daaropvolgende effect van splicing veranderingen. Door de gedetailleerde protocollen in dit rapport te volgen, is het mogelijk om ESF's te ontwerpen en te genereren voor de regulering van verschillende typen Alternative Splicing (AS), waarbij een nieuwe strategie wordt gegeven om splicing regulatie te bestuderen en de functie van verschillende splicing isoforms te bestuderen. Bovendien kunnen onderzoekers kunstmatige factoren richten op specifieke RNA's om verschillende stappen van RNA-verwerking te manipuleren door verschillende functionele domeinen te combineren met een ontworpen PUF-domein.
Introduction
De meeste menselijke genen ondergaan alternatieve splicing (AS) met meerdere isovormen te produceren met verschillende activiteiten, die sterk de coderende complexiteit van het genoom 1, 2 is toegenomen. AS een hoofdbestanddeel mechanisme om genfunctie te reguleren, en wordt strak gereguleerd via diverse transductie in verschillende cellulaire en ontwikkelingsstadia 3, 4. Omdat splicing misregulation is een veel voorkomende oorzaak van ziekte bij de mens 5, 6, 7, 8, gericht splicing regelgeving wordt steeds een aantrekkelijke therapeutische route.
Volgens een vereenvoudigd model van splicing verordening AS wordt voornamelijk bepaald door splicing Regulatory cis Elementen (SRE) in pre-mRNA splicing die fungeren als enhancers of silencers alternatieve exons. thEse SREs recruteren specifiek verschillende transactieve eiwitfactoren ( dwz splitsingsfactoren) die de splitsingsreactie 3 , 9 bevorderen of onderdrukken. De meeste transacterende splitsingsfactoren hebben afzonderlijke sequentiespecifieke RNA bindende domeinen om hun doelen en effector domeinen te herkennen om splicing te beheersen. De bekendste voorbeelden zijn de leden van de serine / arginine-rijke (SR) eiwitfamilie die N-terminale RNA-herkenningsmotieven (RRM's) bevatten, die exonische splicing enhancers binden en C-terminale RS domeinen die exon-inclusie 10 bevorderen . Omgekeerd bindt hnRNP A1 aan exonische splicing silencers via de RRM domeinen en remt exon inclusion door een C-terminale glycine-rijke domein 11 . Met behulp van dergelijke modulaire configuraties moeten onderzoekers artificiele splitsingsfactoren kunnen manipuleren door een specifiek RNA-bindend domein (RBD) te combineren met verschillende effectenTor domeinen die splicing activeren of remmen.
De sleutel van zo'n ontwerp is het gebruik van een RBD die bepaalde doelstellingen herkent met programmeerbare RNA-bindingsspecificiteit, die analoog is aan de DNA-bindende modus van het TALE-domein. Echter, de meeste inheemse splicing factoren bevatten RRM of K Homology (KH) domeinen, die korte RNA-elementen met zwakke affiniteit herkennen en dus een voorspellende RNA-eiwitherkenning "code" 12 ontbreken. De RBD van PUF-herhalingsproteïnen ( dwz het PUF-domein) heeft een unieke RNA herkenningsmodus, waardoor de herontwikkeling van PUF-domeinen specifiek herkenbaar is voor verschillende RNA-doelen 13 , 14 . Het canonische PUF-domein bevat acht herhalingen van drie a-helices, die elk een enkele basis in een 8-nt RNA doel herkennen. De zijketens van aminozuren in bepaalde posities van de tweede α-helix vormen specifieke waterstofverbindingen met de Watson-Crick rand van tHij rna basis, die het RNA bindingsspecificiteit van elke herhaling (figuur 1A) bepaalt. De code voor RNA-basen herkenningsplaats van de PUF repeat verrassend eenvoudig (figuur 1A), waardoor de vorming van PUF domeinen mogelijke 8-base combinatie (beoordeeld door Wei en Wang 15) herkennen.
Deze modulaire constructieprincipe maakt het genereren van een Engineered Splicing factor (ESF) bestaande uit een aangepaste PUF domein en een domein splicing modulatie (dwz een SR-domein of een Gly-rijke domein). Deze ESFT kan functioneren als zowel splicing activatoren of remmers verschillende soorten splicing gebeurtenissen controleren, en zij nuttig gebleken als instrumenten om de splitsing van endogene genen betrokken bij menselijke ziekten 16, 17 te manipuleren. Als voorbeeld hebben we PUF-Gly-type ESFT geconstrueerd om specifiek af aan het lassen van de Bcl-xL genOmzetten van de anti-apoptotische lange isovorm (Bcl-xL) tot het pro-apoptotische korte isovorm (Bcl-xs). Het verschuiven van de verhouding van de Bcl-x isovorm volstond om verschillende kankercellen sensibiliseren voor meerdere anti-kanker chemotherapie geneesmiddelen 16, wat suggereert dat deze kunstmatige factoren bruikbaar als potentiële therapeutische reagens kunnen zijn.
Naast het beheren splicing bekende splicing effector domeinen (bijvoorbeeld een RS of Gly-rijke domein), kunnen de gemanipuleerde PUF factoren ook gebruikt worden om de activiteiten van nieuwe splicing factoren onderzocht. Bijvoorbeeld met gebruikmaking van deze benadering hebben we aangetoond dat het C-terminale domein van verschillende SR eiwitten kunnen activeren of remmen splitsing bij binding aan verschillende pre-mRNA gebieden 18, die de alanine-rijke motief van RBM4 splicing 19 kan remmen, en dat de proline-rijke motief van DAZAP1 kan splicing 20, 21 te verbeteren </ Sup>. Deze nieuwe functionele domeinen kunnen worden gebruikt om extra typen kunstmatige factoren verfijnen splicing construeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van het ontwerp en de bouw van kunstmatige splicing factoren die specifiek de alternatieve splicing van een doelwitgen kan manipuleren. Deze methode maakt gebruik van de unieke RNA binding wijze van PUF herhaald om een RNA-bindende scaffold aanpassen met specificiteit. Het kan worden gebruikt om ofwel activeren of onderdrukken splicing.
De kritische stap in dit protocol is het genereren van de reprogramed PUF domein dat de specificiteit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R01-CA158283 en NSFC verlenen 31.400.726 aan ZWYW wordt gefinancierd door de Young Duizend Talents Program en de National Natural Science Foundation of China (subsidies 31.471.235 en 81.422.038). XY wordt gefinancierd door de postdoctorale Science Foundation of China (2015M571612).
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
- Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
- Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
- Wang, G. -. S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
- Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
- Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
- Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -. C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
- Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
- Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
- Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
- Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
- Wang, Y., Cheong, C. -. G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
- Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
- Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
- McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
- Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
- Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
- Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
- Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
- Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
- Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
- He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732 (2009).
- Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
- Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).
- David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
- Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
- Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
- Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).
