Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

doi: 10.3791/54967 Published: April 26, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Dit rapport beschrijft een werkwijze biotechnologie ontwerpen en bouwen van nieuwe kunstmatige splicingfactoren (ASFS) die specifiek de splitsing van doelgenen te moduleren in zoogdiercellen. Deze werkwijze kan verder worden uitgebreid met verschillende kunstmatige engineering factoren andere aspecten RNA metabolisme manipuleren.

Abstract

De verwerking van de meeste eukaryote RNA wordt gemedieerd door RNA-bindingseiwitten (RBPs) met modulaire configuraties, met inbegrip van een module RNA herkenning, dat specifiek bindt aan de pre-mRNA target en een effector domein. Eerder hebben we gebruik van de unieke RNA bindingsmodus van de PUF-domein genomen humaan Pumilio 1 aangeleerde RNA-bindende scaffold, dat werd gebruikt om verschillende kunstmatige RBPs ingenieur RNA metabolisme manipuleren genereren. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven Engineered splicingfactoren (ESFT) die speciaal zijn ontworpen om de alternatieve splicing van doelgenen te moduleren construeren. Het protocol omvat het ontwerpen en bouwen van een aangepaste PUF matrix voor een specifiek RNA-doelwit, hoe een ESF expressieplasmide te construeren door het fuseren ontwerper PUF domein en een effector domein en hoe ESFT om de splitsing van doelgenen te manipuleren. In de representatieve resultaten van deze methode, hebben we ook beschreven gemeenschappelijke assaysVan ESF-activiteiten met behulp van splicing verslaggevers, de toepassing van ESF in gekweekte menselijke cellen, en het daaropvolgende effect van splicing veranderingen. Door de gedetailleerde protocollen in dit rapport te volgen, is het mogelijk om ESF's te ontwerpen en te genereren voor de regulering van verschillende typen Alternative Splicing (AS), waarbij een nieuwe strategie wordt gegeven om splicing regulatie te bestuderen en de functie van verschillende splicing isoforms te bestuderen. Bovendien kunnen onderzoekers kunstmatige factoren richten op specifieke RNA's om verschillende stappen van RNA-verwerking te manipuleren door verschillende functionele domeinen te combineren met een ontworpen PUF-domein.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De meeste menselijke genen ondergaan alternatieve splicing (AS) met meerdere isovormen te produceren met verschillende activiteiten, die sterk de coderende complexiteit van het genoom 1, 2 is toegenomen. AS een hoofdbestanddeel mechanisme om genfunctie te reguleren, en wordt strak gereguleerd via diverse transductie in verschillende cellulaire en ontwikkelingsstadia 3, 4. Omdat splicing misregulation is een veel voorkomende oorzaak van ziekte bij de mens 5, 6, 7, 8, gericht splicing regelgeving wordt steeds een aantrekkelijke therapeutische route.

Volgens een vereenvoudigd model van splicing verordening AS wordt voornamelijk bepaald door splicing Regulatory cis Elementen (SRE) in pre-mRNA splicing die fungeren als enhancers of silencers alternatieve exons. thEse SREs recruteren specifiek verschillende transactieve eiwitfactoren ( dwz splitsingsfactoren) die de splitsingsreactie 3 , 9 bevorderen of onderdrukken. De meeste transacterende splitsingsfactoren hebben afzonderlijke sequentiespecifieke RNA bindende domeinen om hun doelen en effector domeinen te herkennen om splicing te beheersen. De bekendste voorbeelden zijn de leden van de serine / arginine-rijke (SR) eiwitfamilie die N-terminale RNA-herkenningsmotieven (RRM's) bevatten, die exonische splicing enhancers binden en C-terminale RS domeinen die exon-inclusie 10 bevorderen . Omgekeerd bindt hnRNP A1 aan exonische splicing silencers via de RRM domeinen en remt exon inclusion door een C-terminale glycine-rijke domein 11 . Met behulp van dergelijke modulaire configuraties moeten onderzoekers artificiele splitsingsfactoren kunnen manipuleren door een specifiek RNA-bindend domein (RBD) te combineren met verschillende effectenTor domeinen die splicing activeren of remmen.

De sleutel van zo'n ontwerp is het gebruik van een RBD die bepaalde doelstellingen herkent met programmeerbare RNA-bindingsspecificiteit, die analoog is aan de DNA-bindende modus van het TALE-domein. Echter, de meeste inheemse splicing factoren bevatten RRM of K Homology (KH) domeinen, die korte RNA-elementen met zwakke affiniteit herkennen en dus een voorspellende RNA-eiwitherkenning "code" 12 ontbreken. De RBD van PUF-herhalingsproteïnen ( dwz het PUF-domein) heeft een unieke RNA herkenningsmodus, waardoor de herontwikkeling van PUF-domeinen specifiek herkenbaar is voor verschillende RNA-doelen 13 , 14 . Het canonische PUF-domein bevat acht herhalingen van drie a-helices, die elk een enkele basis in een 8-nt RNA doel herkennen. De zijketens van aminozuren in bepaalde posities van de tweede α-helix vormen specifieke waterstofverbindingen met de Watson-Crick rand van tHij rna basis, die het RNA bindingsspecificiteit van elke herhaling (figuur 1A) bepaalt. De code voor RNA-basen herkenningsplaats van de PUF repeat verrassend eenvoudig (figuur 1A), waardoor de vorming van PUF domeinen mogelijke 8-base combinatie (beoordeeld door Wei en Wang 15) herkennen.

Deze modulaire constructieprincipe maakt het genereren van een Engineered Splicing factor (ESF) bestaande uit een aangepaste PUF domein en een domein splicing modulatie (dwz een SR-domein of een Gly-rijke domein). Deze ESFT kan functioneren als zowel splicing activatoren of remmers verschillende soorten splicing gebeurtenissen controleren, en zij nuttig gebleken als instrumenten om de splitsing van endogene genen betrokken bij menselijke ziekten 16, 17 te manipuleren. Als voorbeeld hebben we PUF-Gly-type ESFT geconstrueerd om specifiek af aan het lassen van de Bcl-xL genOmzetten van de anti-apoptotische lange isovorm (Bcl-xL) tot het pro-apoptotische korte isovorm (Bcl-xs). Het verschuiven van de verhouding van de Bcl-x isovorm volstond om verschillende kankercellen sensibiliseren voor meerdere anti-kanker chemotherapie geneesmiddelen 16, wat suggereert dat deze kunstmatige factoren bruikbaar als potentiële therapeutische reagens kunnen zijn.

Naast het beheren splicing bekende splicing effector domeinen (bijvoorbeeld een RS of Gly-rijke domein), kunnen de gemanipuleerde PUF factoren ook gebruikt worden om de activiteiten van nieuwe splicing factoren onderzocht. Bijvoorbeeld met gebruikmaking van deze benadering hebben we aangetoond dat het C-terminale domein van verschillende SR eiwitten kunnen activeren of remmen splitsing bij binding aan verschillende pre-mRNA gebieden 18, die de alanine-rijke motief van RBM4 splicing 19 kan remmen, en dat de proline-rijke motief van DAZAP1 kan splicing 20, 21 te verbeteren </ Sup>. Deze nieuwe functionele domeinen kunnen worden gebruikt om extra typen kunstmatige factoren verfijnen splicing construeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Constructie van een PUF Steiger met aangepaste RNA-bindende specificiteit door overlappende PCR

  1. Ontwerp een reeks PCR-primers die de PUF sequenties die specifiek verschillende RNA nucleotiden herkennen in elke positie 12 (zie Tabel 1 voor de primersequenties en zie Figuur 1A de RNA: PUF herkenningscode). Voor elke herhaling PUF, ontwerp vier verschillende primers om een ​​andere base op elke positie te herkennen.
    Opmerking: Deze primers worden gebruikt in een reeks van vier ronden van PCR reacties PUF fragmenten die aan elkaar zijn verbonden (figuur 1B) te genereren.
  2. Selecteer de erkenning plaats van het doelwitgen in de buurt van de alternatieve splice website.
    LET OP: Deze site kan worden beslist door de gebruiker, en meestal wordt gekozen binnen 10-50 nt van de alternatieve splice sites.
  3. Ronde 1: genereren coderende sequenties4 PUF herhalingen, universele brug fragmenten en fragmenten cap.
    1. Gebruik de beoogde plaats voor de erkenning code te definiëren voor elke herhaling van de aangepaste PUF. Selecteer het PCR primers voor PUF herhalingen 1 - 8. Gedrag vier opeenvolgende ronden van PCR om een aangepaste PUF domein te produceren, zoals hieronder beschreven (figuur 1B).
    2. In de eerste ronde van PCR ingestelde standaard PCR-reactiemengsels (dat 2,5 pl van 10x buffer, 0,5 ui 10 mM dNTP's, 0,5 pl 10 pM voorwaartse en reverse primers, 50 ng van het DNA-matrijs (humaan cDNA of expressievector WT PUF domein) en 0,5 U high-fidelity DNA polymerase in een 25 pl eindvolume).
      Opmerking: Deze reacties zullen DNA-sequenties die overeenkomen met elke herhaling PUF, universele brug fragmenten en twee cap fragmenten met verschillende restrictieplaatsen (figuur 1B). Een korte lijst met sjablonen, primersEn gegenereerde PCR-producten die in deze stap worden getoond in Tabel 2.
    3. Stel het PCR-programma als volgt: 5 min bij 95 ° C; 28 cycli van 30 seconden bij 95 ° C, 30 seconden bij 55 ° C en 15 s bij 72 ° C; en 5 min incubatie bij 72 ° C. Gebruik high-fidelity DNA polymerase om puntmutaties te minimaliseren gedurende PCR.
  4. Ronde 2: Genereer coderende sequenties voor R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) en R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
    1. Scheid de PCR producten verkregen in stap 1.3.3 behulp van elektroforese met een 1,5% agarosegel (25 minuten bij een constante spanning van 120 V). Gel-zuiveren van alle producten van de verwachte grootte met behulp van een gel zuivering kit. Gebruik een ander mengsel van deze producten als matrijs in de volgende ronden van PCR.
      OPMERKING: Meng de drie PCR-producten in een vrijwel 1: 1: 1 verhouding. Ze hebben meestal hoeven niet te worden gekwantificeerd, zolang de intensiteit van elk product lijkt in de gel.
    2. Meng ongeveer 5% van de gezuiverde PCR producten als een temPlaatje in de volgende ronde PCR. Alternatief, kwantificeer de gezuiverde PCR producten met behulp van een UV-Vis spectrofotometer en gebruik 15 ng van elk PCR product in het sjabloon mengsel.
    3. Gebruik gezuiverde PCR producten R1 / R2, R3 / R4 en Bridge 2/3 als gemengde sjablonen en R1-F en R4-R als primers. Stel de PCR-reactie op zoals beschreven in stap 1.3 om overlappend PCR-product R1-4 te verkrijgen.
    4. Gebruik gezuiverde PCR-producten R5 / R6, R7 / R8 en Bridge 6-7 als gemengde sjablonen en R5-F en R8-R als primers om overlappend PCR-product R5-8 te verkrijgen ( Figuur 1B ). Stel het PCR-programma als volgt in: 5 minuten bij 95 ° C; 28 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C en 30 s bij 72 ° C; En 5 minuten bij 72 ° C. Gel-zuiveren R1-4 en R5-8.
  5. Ronde 3: Genereer coderende sequenties voor R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 zonder caps).
    1. In de derde ronde PCR, met gebruikmaking van de gezuiverde R1-4, R5-8 en Bridge 4/5 als gemengde templates en R1-F enR8-R als primers, zet de PCR-reactie op zoals beschreven in stap 1.3 om overlappend PCR-product R1-8 zonder caps te verkrijgen.
    2. Stel het PCR-programma als volgt in: 5 minuten bij 95 ° C; 28 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C en 55 s bij 72 ° C; En 5 minuten bij 72 ° C. Gel-zuiver de R1-8 zonder caps.
  6. Ronde 4: Genereer coderende sequenties voor complete PUF domeinen.
    1. In de laatste ronde PCR, gebruik de gezuiverde R1-8 zonder caps en 5'-end en 3'-end caps als gemengde templates en Cap-F en Cap-R als primers, stel de PCR-reactie op zoals beschreven in stap 1.3 Om de uiteindelijke gemuteerde PUF domeinen te verkrijgen.
    2. Stel het PCR-programma als volgt in: 5 minuten bij 95 ° C; 28 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C en 1 min bij 72 ° C; En 5 minuten bij 72 ° C.
    3. Gel-zuiveren de PCR-producten van de laatste herprogrammeerde PUF domeinen. Gebruik deze producten voor de constructie van het ESF expressie plasmide in de volgende stappen. SequEnce het laatste construct om de herprogrammeerde sequenties van PUF domeinen te verifiëren.
      OPMERKING: Cap-F codeert NLS (PPKKKRKV) tussen BamH I en Xba I sites en Cap-R codeert voor een stopcodon en de Sal I site (restrictieplaatsen zijn ontworpen voor het vormen van expressievectoren van ESFs, Figuur 1C).

2. Opbouw van een functionele module van ESF's

  1. Twee strategieën worden vaak gebruikt om functionele modules van ESF's (RS-domeinen of Gly-rich-domeinen) te klooneren: deze domeinen te amplificeren met behulp van PCR met behulp van totaal menselijk cDNA als een template (stap 2.2) of om de DNA-fragmenten die voor verschillende RS-codes codeert rechtstreeks te synthetiseren Of Gly-rijke domeinen (stap 2.3).
  2. Gebruik PCR om RS-domeinen te kloonen van residuen 123 - 238 van 9G8 (NP001026854), residuen 180-272 van SRP40 (NP008856), of residuen 117-221 van SC35 (NP003007). Clone Gly-rijke domeinen van residuen 195 - 320 van hnRNP A1 (NP_002127), residuS 203 - 353 van hnRNP A2 (NP112533), of resten 211 - 378 van hnRNP A3 (NP919223).
    1. Gebruik het NCBI primer design tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) of Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) om primers te ontwerpen voor Klonen van RS-domeinen of Gly-rich domeinen (functionele module van ESF's).
      OPMERKING: De voorwaartse primer bevat een N-terminale FLAG-tag na de Nhe I-site. De omgekeerde primer bevat een BamHI plaats voor het klonen in expressievectoren ( Figuur 1C).
    2. Stel de standaard PCR-reactie op, zoals beschreven in stap 1.3, om de RS- of Gly-rijke domeinen te amplificeren. Stel het PCR-programma als volgt in: 5 minuten bij 95 ° C; 28 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 55 ° C en 30 s bij 72 ° C; En 5 minuten bij 72 ° C.
  3. Clone RS domeinen of Gly-rich domeinen door middel van directe DNA synthese. In plaats van het genereren van PCR-producten die coderen voor de effector domeinen in stap 2.2, syntheGrootte een oligonucleotide dat codeert voor een kortfragment RS domein (RSRSRSRSRSRS) of een Gly-rich domein (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) met behulp van een commerciële bron van DNA-oligonucleotiden.

3. Constructie van ESF Expression Plasmids

  1. Construeer ESF expressie plasmiden met behulp van elke expressievector.
    OPMERKING: Een expressieconstruct pGL-Gly-MS2 (een cadeau van dr. R. Breathnach van het Instituut de Biologie-CHR 11 ) werd oorspronkelijk gebruikt, die codeert van de N- tot de C-terminale, een FLAG-epitoop, een Gly -rich domein van hnRNP A1, en het MS2 coat protein. Daarom wordt dit expressieconstruct als voorbeeld gebruikt in de volgende stap.
    OPMERKING: Andere expressievectoren met meerdere kloneringsplaatsen kunnen ook worden gebruikt, en de standaardkloneringsstappen zullen worden toegepast om samen de fragmenten aan te sluiten.
  2. Digest 1,5 μg van de expressieplasmiden (pGL-Gly-MS2) genoemd in stap 3.1 om het MS2-coat-eiwitfragment te verwijderen. Gebruik de restrictieEndonucleasen BamHI en SalI gedurende 1 uur bij 37 ° C. Digest de herkenningsmodule van ESF's (coderen voor een NLS en herprogrammeerde PUF domeinen, gegenereerd in stap 1.5) met BamH I en Sal I in dezelfde staat.
  3. Voeg 5x laadkleuren toe aan de restrictieverwerkende reacties en langzaam elektroforeseer het totale volume met een 1,5% agarosegel die een DNA gelvlek bevat gedurende 40 minuten bij 120 V. Geluidsgeur de verteerde producten.
  4. Bereid 10 μL ligatie reacties op met een gezuiverde herkenningsmodule van ESF inserts en expressie vector DNA in een 3: 1 verhouding, 1 μL DNA ligase en 1 μl 10x ligatie buffer. Incubeer de ligeringsreacties overnacht bij 4 ° C; Het resulterende construct expresseert een Gly-PUF-type ESF (pGL-Gly-PUF) onder controle van een CMV promotor ( Figuur 1C).
  5. Verwijder het fragment dat codeert voor het FLAG / Gly-rijk domein met Nhe I en BamH I digestie gedurende 1 uur bij 37 ° C. Vervang het met een fragment dat codeert voor het RS domein (gegenereerd in stap 2.2, ook verteerd door Nhe I en BamH I); Het resulterende construct expresseert een RS-PUF-type ESF ( Figuur 1C).

4. Constructie van de Splicing Reporter

  1. Synthese oligonucleotiden die de kandidaatsequenties bevatten ( dwz doelsequenties van PUF-domeinen) die flankeren door XhoI- en ApaI- plaatsen of XhoI- en EcoRl-plaatsen. Ontleed de oligonucleotiden gedurende 5 minuten bij 55 ° C om dubbelstrengde inserts te verkrijgen die de herkenningsplaatsen van PUF-domeinen bevatten die door de cohesieve einden van XhoI- en Apa I- of XhoI- en EcoRl-plaatsen flankeren.
  2. Begin van een eerder beschreven modulair splicing reporter 22 , pGZ3, die twee GFP exonen bevat die gescheiden zijn door een test exon (exon 12 van de menselijke IGF2BP1, Ensembl ID ENSG00000159217) en zijn flankerende introns.
    OPMERKING: De testexon werd geconstrueerd met Xho I en Apa I sites, die gebruikt kunnen worden om gesynthetiseerde oligonucleotiden te bevatten die de kandidaatsequenties bevatten (doelsequenties van PUF domeinen). Deze modulaire splicing reporter (pGZ3) wordt door het Add-gen van het plasmide-repository verschaft.
  3. Digest de base reporter pGZ3 (bereid in stap 4.2) met de Xho I en Apa I restrictie endonucleasen gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  4. Gel-zuiveren de verteerde producten zoals beschreven in stap 3.3.
  5. Bereid 10 μl ligeringsreacties op met de dubbelstrengige inserts die gegenereerd werden in stap 4.1 en de verteerde pGZ3-vector die bij stap 4.4 werd gegenereerd in een 3: 1 molaire verhouding, 1 μl DNA-ligase en 1 μl 10x ligatiebuffer. Incubeer de ligeringsreacties overnacht bij 4 ° C om de constructie-splitsende reportervector pGZ3 te verkrijgen.
  6. Plaats de dubbelstrengige inzetstukken die in stap 4.1 zijn gegenereerd in de vorigegepubliceerd reporters Pez-1B (via Xho I en EcoR I plaatsen) en PEZ-2F (via Xhol en Apal sites) 23, om de concurrerende 5' krijgen ss reporter en de concurrerende 3'ss reporter, zoals beschreven in stap 4.3-4.5.
    OPMERKING: Beide typen splicing reporters zullen beschikbaar zijn via Add-gen.

5. Constructie van Lentiviral expressievectoren voor ESF

  1. Stel de standaard PCR-reactie zoals beschreven in stap 1.3 de volledige lengte ESFT van de oorspronkelijke expressievectoren (pGL-Gly-PUF of pGL-RS-PUF) met primers die MluI / SpeI plaatsen amplificeren. Stel het PCR-programma als volgt: 5 min bij 95 ° C; 28 cycli van 30 seconden bij 95 ° C, 30 seconden bij 55 ° C en 1,5 min bij 72 ° C; en 5 min bij 72 ° C.
  2. Via een ontsluitingsreactie, gelzuivering, en ligatiereactie, integreren ESFS in het lentivirale expressievector pWPXLd tussen de Mlu Spe I sites, zoals beschreven in stappen 3.2-3.4.
  3. Gebruik de standaard calcium fosfaat precipitatie methode, zoals eerder gerapporteerd 24 , om lentivirussen te genereren door cc-transfectie van HEK293T cellen door de vectoren, psPAX2 en pMD2.G te verpakken, met ofwel pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF Wt) (als specificiteitscontrole), of pWPXLd-GFP (mock).
    1. Zaad 5x10 6 HEK293T cellen in 10 cm gerechten en groei de cellen 's nachts in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), aangevuld met 10% Fetal Bovine Serum (FBS) per schotel in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 . Voer de transfectie uit wanneer de cellen 70 tot 90% samenvloeien.
    2. Bereid het plasmide mengsel door de drie plasmiden toe te voegen (7,5 μg van de verpakkingsvector, psPAX2; 2,5 μg pMD2.G; en 10 μg van hetzij pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (wt) , Of pWPXLd-GFP) aan een 2 ml buis.
    3. Voeg 560 μl 0,25 M CaCl toe2 en 560 μL 2x BBS oplossing aan de 2-ml buis. Meng verscheidene malen zachtjes en incubeer het gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om het transfectiemengsel te bereiden.
    4. Voeg alle transfectie mengsels toe aan de 10 cm-schotels. Wissel de afzettingen zachtjes en incubeer ze overnacht bij 3% CO 2 en 37 ° C.
    5. Verwijder het medium, voeg 10 ml frisse DMEM toe met 2% FBS aan elk gerecht, en incubeer ze bij 10% CO 2 en 37 ° CO / N.
    6. Verzamel de eerste supernatant uit de afwas. Voeg 10 ml frisse DMEM toe met 2% FBS aan elk gerecht. Incubeer de afwas O / N bij 10% CO 2 en 37 ° C. Bewaar het supernatant bij 4 ° C.
    7. Verzamel de tweede supernatant uit de afwas. Pool de supernatant van de eerste en tweede oogst. Verwijder de supernatant van celresten door het filter te filteren via een 0,4 μm filter. Gebruik de gecontroleerde supernatant direct of opslaan bij -80 ° C.
  4. Bepaal de titer van de lentivirus door HEK2 te infecteren93T cellen met seriële verdunningen van het viruspreparaat, zoals eerder gemeld 25 .

6. Specifiek modulerende Exon Inclusion en het alternatieve gebruik van Splice Sites met ESFs

  1. Zaad 2 x10 5 HEK293T cellen in elke put in een 24-putjesplaat. Groei de cellen 's nachts in 500 μl DMEM aangevuld met 10% FBS in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Meng het liposomale transfectie-reagens door de flessen voorzichtig te omkeren. Verdun 2 μL liposomaal transfectie-reagens in 50 μl gereduceerd serummedium. Meng het voorzichtig en incubeer ze gedurende 5 minuten bij RT.
  3. Verdun 0,04 μg pGL-Gly-PUF expressievectoren en 0,2 μg pGZ3-reporterplasmiden in 50 μl gereduceerd serummedium in een steriele buis. Verdun 0,4 μg pGL-RS-PUF expressievectoren en 0,2 μg pGZ3-reporterplasmiden in 50 μl gereduceerd serummedium in een steriele buis. Dilute 0,4 ug pGL-RS-PUF expressievectoren en 0,2 ug Pez-1B of Pez-2F reporterplasmiden in 50 ui gereduceerd serum medium in een steriele buis.
  4. Na 5 minuten incubatie bij KT, meng het verdunde liposomale transfectie reagens bereid in stap 6.2 met verdund plasmiden bereid in stap 6.3. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Voeg de gehele transfectie mengsels die de expressie vectoren en transfectie reagens bereid in stap 6.4 aan elk putje en incubeer gedurende ten minste 12 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  6. Na 12 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2, gooi het medium uit elk putje en wassen met 500 pl fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) / well.
  7. Gooi de PBS en voeg 200 ul trypsine aan elk putje. Incubeer de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5 minuten. Voeg 1 ml van het medium aan de di stoppengestion en overbrengen van de cellen naar een steriele 1,5 ml buis.
  8. Centrifugeer de buisjes gedurende 3 min bij 5.000 xg en gooi het medium. Voeg 0,5 ml RNA-extractiebuffer per buis om de cellen door herhaalde pipetteren lyseren. Incubeer de gehomogeniseerde monsters gedurende 5 min.
  9. Voor elk RNA-extractie-buffer behandelde monster, voeg 0,1 ml chloroform per 0,5 ml RNA-extractiebuffer. Keren de buizen gedurende 15 s en incubeer ze gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Centrifugeer de buisjes gedurende 15 min bij 12.000 xg en 4 ° C. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. Voeg 0,25 ml isopropanol 0,5 ml per RNA extractiebuffer toegepast voor de initiële homogenisatie.
  11. Door vortexen gemengd en incubeer ze bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer de buisjes bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Na centrifugeren, het RNA neerslag gewoonlijk zichtbaar op de bodem van de buis.
  12. Verwijder het supernatant en was de RNA-pellet met 0,5 ml 75% ethanol per 0,5 ml RNA-extractiebuffer.
  13. Vortex krachtig en centrifugeer deze bij 7,500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en droog de RNA pellet. Los het RNA op in 50 μl RNase-vrij water.
  14. Voeg 2 μL 5U / μL DNase I, 7 μL 10x buffer en 11 μL H20 toe aan elke 50 μL RNA oplossing. Incubeer de buizen bij 37 ° C gedurende 1 uur. Hitte ze bij 70 ° C gedurende 15 minuten om de DNase te inactiveren.
  15. Voor elk monster voeg de volgende componenten toe aan een 0,2 ml nuclease-vrije buis: 1 μL 50 μM oligo dT, 5 μl 400 ng / μL RNA (2 μg), 1 μl 10 mM dNTP en 3 μl H 2 O. Voer de omgekeerde PCR uit.
    1. Verhit het mengsel gedurende 5 minuten tot 65 ° C en incubeer het op tenminste 2 minuten op ijs om de secundaire structuur te hervormen. Voeg de volgende componenten toe aan dezelfde buis: 4 μl 5x eerste strandbuffer, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl 200 U / μL omgekeerde transcriptase en 4 μl H 2 </ Sub> O. Meng door voorzichtig pipetteren en neer en incubeer bij 50 ° C gedurende 60 min. Stop de reactie door gedurende 15 minuten te verhitten bij 70 ° C.
  16. Voor elk monster, de volgende componenten aan een PCR buis om het lichaam gemerkte PCR ronden: 2,5 pl 10x PCR-buffer, 0,5 ui 10 mM dNTP mix, 1 ui van 10 uM voorwaartse primer, 1 pl 10 pM reverse primer, 0,25 pl van 5 U / ul Taq DNA-polymerase, 0,5 pl 25 nM Cy5-dCTP en 2 pi van het cDNA bereid in stap 6.15.
    1. Verwarm de reactie tot 94 ° C gedurende 2 minuten om de moleculen denatureren Voer 25 PCR cycli (94 ° C gedurende 30 s, 60 ° C 30 s en 72 ° C 30 s), houdt de reactie bij 72 ° C 7 min, en laat het op een greep 4 ° C.
  17. Los de PCR producten door elektroforese door een 10% polyacrylamidegel met 1x Tris base, Boorzuur en EDTA (TBE) buffer. Uitvoeren van een scan met een fluorescentie scanner. Meet dehoeveelheid van elke isovorm splicing densitometrie onder toepassing van een software.

7. Gebruik ESF moduleren Endogene Bcl-x Splicing en meet de effecten op apoptose

  1. Plaat 2 x 10 5 HeLa-cellen aan elk putje van een 24-wells plaat. Groeien de cellen overnacht in 500 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Na 12 uur transfecteren van de cellen met 2 ug pGL-Gly-PUF (WT) of 0,2 ug, 1 ug, 2 ug pGL-Gly-PUF (531) (a geherprogrammeerd PUF domein herkent dat Bcl-x pre- mRNA met een hoge affiniteit, zie figuur 2A).
  3. 24 uur later te oogsten van de cellen. 1/3 van de cellen voor RNA-isolatie en PCR-analyse (stappen 6,8-6,17) en 2/3 zijn van eiwit isolatie.
  4. Voor de Western blot-analyse, kook de totale celpellets in 2X natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) laadbuffer gedurende 10 minEn vervolgens het oplossen van de eiwitten in een 12% SDS-PAGE gel. Overdracht van de eiwitten op een nitrocellulose membraan.
  5. Blokkeer het membraan met 5% melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en incubeer het membraan O / N met Caspase-3 (1: 1000), PARP (1: 1000), of beta-actine (1: 5000) primaire antilichamen (verdund in 5% melk) bij 4 ° C.
  6. Spoel het membraan met PBS dat 0,1% Tween 20 (PBS-T) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur 3x op een rocking shaker. Incubeer het membraan met aan HRP gekoppelde antilichamen (1: 5.000 verdund in 5% melk) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  7. Spoel het membraan met PBS-T 3x bij kamertemperatuur, en vervolgens ontwikkelen van de membraan onder toepassing van ECL Western blotting detectie reagentia.
  8. Voeg 250 ul van poly-L-lysine (PLL) op dekglaasjes, incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en sifon van de vloeistof. Was de PLL-beklede dekglaasjes met PBS 3 x 5 minuten elk. Voor de immunofluorescentie assay die apoptose zaad 5 x 10 5 cellen op HeLa-polylysine gecoate dekglaasjes in een 6-wells plaat. transfecteren pGL-Gly-PUF (WT) of pGL-Gly-PUF (531) plasmiden in de HeLa-cellen met behulp van een liposomaal transfectiereagens (zie stap 6,1-6,5).
  9. 24 uur na de transfectie, bevestig de cellen op de dekglaasjes met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. WAARSCHUWING: PFA is giftig; ga er voorzichtig in een zuurkast.
  10. Voorzichtig te wassen de cellen op de dekglaasjes door toevoeging van 2 ml 1x PBS. Incubeer ze gedurende 5 minuten. Verwijder de PBS met pipetten. Herhaal het wassen 3x.
  11. Permeabel de cellen met 0,2% Triton X-100 in 1 x PBS gedurende 10 min, en vervolgens 3x wassen met 1 x PBS.
  12. Blokkeer de cellen met 3% runderserumalbumine (BSA) in 1 x PBS gedurende 10 minuten en 3x wassen met 1 x PBS.
  13. Verdun het FLAG antilichaam 1: 1000 in 3% BSA / PBS en pipet 30 pi van de verdunde FLAG antilichaam op een vel parafilm.
  14. Neem het dekglaasje met de cellen voorzichtig droog het overtollige buffer met een lab doekjes, en zet het omgekeerde (cel naar beneden) op 30 pl anti-FLAG solution. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  15. Voeg 500 ul van 1 x PBS om de zijkant van het dekglaasje geïncubeerd met het primaire antilichaam tot het dekglaasje drijft bovenop de oplossing. Breng het terug naar de 6-wells plaat met 1x PBS in de putten.
  16. 3x wassen met 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
  17. Verdun het anti-muis secundair antilichaam (1: 500) in 3% BSA / PBS; Gebruik nogmaals 30 ui per dekglaasje. Zet het dekglaasje ondersteboven op de secundaire antilichaamoplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  18. Verwijder het dekglaasje uit de parafilm, zoals beschreven in stap 7.15. Zet het terug in de 6-well plaat en was het met 1x PBS 3x gedurende telkens 5 min.
  19. Monteer de dekglaasjes met montage medium (met DAPI), het overtollige medium en verzegel de rand met nagellak.
  20. Visualiseer de cellen met behulp van een fluorescentie microscoop (bij een vergroting van 100X) en fotograferen met een digitale camera.
    OPMERKING: De expressie van ESF wordt gevisualiseerd door de fluorescentie-labeleD secundair antilichaam tegen de FLAG-tag, en de nucleaire fragmentatie wordt gevisualiseerd met behulp van DAPI-kleuring.

8. Meet de apoptose van verschillende kankercellen die ESF uitdrukken

  1. Verdeel 2 x 10 6 HeLa cellen, MDA-MB-231 cellen en A549 cellen in 60 mm schalen met 4 ml DMEM aangevuld met 10% FBS in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 om apoptose te detecteren met Propidium Iodide (PI) kleuring.
  2. 24 uur later, vernieuw het medium en berei de lentivirus voor, zoals eerder gerapporteerd 24 .
  3. Verpakt 10 x 10 6 lentivirus pWPXld-Gly-PUF (WT), pWPXld-Gly-PUF (531) of pWPXld-GFP-voorraden in 4 ml vers medium om de verhouding van virus tot celgetal gelijk te maken aan 5.
  4. Vervang het medium in de platen naar 4 ml van het virusbevattende medium bereid in stap 8.3 en incubeer de platen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. 12 uur na de infectie, verander het medium.
  5. Na 24 uur van infectie, verzamelen en vlekken op de cellen gedurende 5 min in een PBS-oplossing bevattende een eindconcentratie van 2 ug / ml PI.
  6. Analyseer de-PI gekleurde cellen met een flow cytometer, zoals hiervoor 16 beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit rapport beschrijft de volledige protocol voor het ontwerp en de bouw van ESFS en splicing verslaggevers. Schetst ook de verdere toepassing van ESFS manipuleren van de AS van endogene genen 16. Om typische resultaten van het ESF-gemedieerde splicing veranderingen te illustreren, gebruiken we de gegevens uit onze eerdere werk als voorbeeld. Het ESFT met verschillende functionele domeinen kunnen worden gebruikt voor het bevorderen of remmen de opname van de beoogde exon cassette (Figuur 1 D & E). ESFT kan ook van invloed op het gebruik van alternatieve 5'- en 3'-splitsingsplaatsen in het reporter systeem (Figuur 1 F en G).

De alternatieve splicing van het endogene gen kan ook specifiek worden gereguleerd met designer ESFT. We hebben deze toepassing door spec aangetoondifically targeting Bcl-x, die kan worden gesplitst in twee antagonistische isovormen door alternatieve 5'-splice sites. We ontwierpen ESF, Gly-PUF (531), dat een 8-nt RNA element tussen de alternatieve 5'-splitsingsplaatsen herkent. Dit Gly-PUF (531) specifiek verschoven de splitsing op de productie van Bcl-XS (figuur 2A). Na het transfecteren van de Gly-PUF (531) in HeLa-cellen, het niveau van Bcl-xS isovormen en Bcl-XS eiwitten stegen op een dosisafhankelijke wijze, terwijl de controlegroep ESF, Gly-PUF (WT), had geen invloed op de verhouding Bcl-XS aan Bcl-xL (figuur 2 B & C). Bovendien kan de ontwerper ESF de splitsing van caspase 3 en poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), twee bekende moleculaire merkers van apoptose (figuur 2 D) induceren. Zoals verwacht, worden de ontwerper ESFS overwegend gelokaliseerd in de kernen van getransfecteerde cellen, zoals demonstrated van immunofluorescentie microscopie (figuur 2E). Consequent, de splicing verschuiving Gly-PUF (531) veroorzaakte de fragmentatie van nucleair DNA, wat aangeeft dat deze cellen ondergaan apoptose (figuur 2E). De toename van apoptotische cellen werd verder bevestigd door het onderzoeken van meer dan 200 cellen van willekeurig geselecteerde velden en door het kwantificeren van het percentage cellen met gefragmenteerde nucleair DNA (Figuur 2F).

Figuur 1
Figuur 1: Ontwerp van ESFS en hun activiteiten bij het moduleren van exon skipping. (A) Specifieke binding tussen de PUF domein en RNA targets wordt geïllustreerd met de RNA-PUF structuur en een schema. De PUF bindende code voor elk van devier RNA basen rechts getoond met verschillende kleuren, wordt gebruikt om mutaties te ontwerpen PUF. (B) Stroomdiagram een aangepaste PUF domein te verkrijgen. De PUF dat "UGUAUAUA" erkent werd gebruikt als een voorbeeld. Een 4-round PCR-strategie wordt gebruikt om een ​​PUF scaffold aanpassen met RNA-bindingsspecificiteit (kleur gecodeerd om soortgelijke paneel A) monteren. In de eerste ronde, een reeks PCR-primers die de gewenste RNA-herkenningscodes twee aangrenzende PUF herhalingen bevatten gebruikt vier fragmenten die de acht RNA-herkenningscodes van een volledige PUF eiwit omvatten (R1 / R2, R3 / R4 genereren R5 / R6 en R7 / R8). Cap fragmenten die coderen voor een N-eindstandig nucleair lokalisatiesignaal, een C-terminaal stopcodon en brug fragmenten worden eveneens afzonderlijk geproduceerd (5'-uiteinde en 3'-end cap, bridge 2/3, 4/5 brug en de brug 6 / 7). In de tweede ronde worden nieuwe sjablonen gegenereerd door mengen overlappende fragmenten die coderen aangrenzend herhalingen met de juiste brug (bijvoorbeeld mengen R1 / R2,R3 / R4 en brug 2/3 genereert het sjabloon van R1 - 4) en zich uitstrekt met DNA polymerase om de gaten te vullen. Ook de derde ronde joins R1-4, R5-8 en brug 4/5. Tenslotte de vierde ronde voegt het 5'-uiteinde en 3'-eindkappen van de PUF-domein tezamen met de kloneringsplaatsen voor daaropvolgende klonering van expressievectoren. (C) Modulaire domein organisatie van het ESFS. ESFT worden aangedreven door CMV promoters (pijl) en coderen van de N- naar de C-terminal: een FLAG-epitoop (voor het detecteren van ESFT), een functiemodule (een Gly-rijke domein of een RS-domein), een NLS (vergemakkelijkt de nucleaire lokalisatie van ESFS), en een RNA-herkenningsdomein (a PUF domein). NheI en BamHI zijn ontworpen om een functiemodule voegen, terwijl XbaI en SalI zijn ontworpen om een RNA-herkenningsdomein voegen. (D) Gly-PUF ESFT mede tot expressie gebracht met exon skipping reporters en de splicing patroon wordt bepaald door RT-PCR. De gewijzigde PUF een b binden specifiek aan 8-mer doelen A en B, respectievelijk (in dezelfde kleuren). Alle combinaties worden gebruikt, dus de PUF-doelparen van verschillende kleuren dienen als de controles. De effecten van RS-PUF op exon-overspringen ( E ), de concurrerende 5'-splitsingsplaats ( F ) of de concurrerende 3'-splitsingsreporter ( G ) werden geanalyseerd door methoden die vergelijkbaar zijn met paneel D. De gegevens van de RT-PCR Zijn van Wang et al. 16 . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 : Regeling van endogene Bcl-x pre-mRNA splitsing met ESF's. ( A ) Schematisch van de alternatieve splitsing van endogene Bclx pre-mRNA. Twee alternatieve 5'-splitsingsplaats in exon 2 of Bcl-x worden gebruikt om twee isovormen van verschillende afmetingen, Bcl-xL en Bcl-XS genereren. De sequentie UGUGCGUG tussen de twee 5' splice site wordt geselecteerd als doelwit ESF en WT PUF herhalingen 1, 3 en 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) worden geherprogrammeerd (sterretjes) deze doelwitsequentie herkennen. De verkregen ESF bevattende een Gly-rijke domein remt het gebruik van de downstream 5'ss (aangegeven met de rode pijl). (B) Modulatie van Bcl-x 5' ss gebruik. Verschillende hoeveelheden de Gly-PUF (531) expressieconstruct worden getransfecteerd in HeLa-cellen. Gly-PUF (WT) wordt als controle gebruikt. Twee isovormen van Bcl-x worden gedetecteerd met RT-PCR met behulp van primers overeenkomend met exons 1 en 3 van de Bcl-xL gen. Het percentage van de Bcl-xS isovorm wordt gekwantificeerd en onderin. (C) ESFT invloed op de expressieniveaus van Bcl-xL en Bcl-XS. Monsters worden geladen in dezelfde volgorde als in paneel B en alle eiwitten are gedetecteerd door Western blots. De expressie van ESFT wordt gedetecteerd door het anti-FLAG antilichaam en het tubuline niveau gebruikt als controle. (D) Verschillende hoeveelheden ESF expressieconstructen worden getransfecteerd in HeLa-cellen, wat resulteert in de splitsing van PARP en caspase 3. De monsters worden gedetecteerd door Western blot 24 uur na transfectie. Het actine wordt gedetecteerd als een controle. (E) De subcellulaire lokalisatie van ESFS in getransfecteerde HeLa-cellen wordt gedetecteerd door immunofluorescentie microscopie met het anti-FLAG antilichaam. De cellen zijn co-gekleurd met DAPI om de kernen te tonen. Aantal kernen, met name in cellen getransfecteerd met Gly-PUF (531), versnipperd gevolg van apoptose. Schaalbalk: 5 um. (F) percentage apoptotische cellen (dwz cellen met gefragmenteerde nucleair DNA) worden gemeten van willekeurig gekozen gebieden van fluorescentiemicroscopie beelden. De balken geven het gemiddelde, terwijl de stippen de gegevens van de twee experimenten aan te geven. Het figuurs worden gewijzigd ten opzichte van onze eerdere rapport van Wang et al. 16 in overeenstemming met het beleid van Nature Publishing Group. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van het ontwerp en de bouw van kunstmatige splicing factoren die specifiek de alternatieve splicing van een doelwitgen kan manipuleren. Deze methode maakt gebruik van de unieke RNA binding wijze van PUF herhaald om een ​​RNA-bindende scaffold aanpassen met specificiteit. Het kan worden gebruikt om ofwel activeren of onderdrukken splicing.

De kritische stap in dit protocol is het genereren van de reprogramed PUF domein dat de specificiteit van ESFT definieert. Een PCR stiksel protocol is ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de snelle vorming van de PUF scaffold. De sleutel voor het succes is de verhouding van verschillende overlappende sjablonen 1 aanpassen: 1: 1. De zuivering van de PCR producten na elke ronde is ook kritisch, omdat ongezuiverde producten primer verontreiniging van de laatste ronde kan hebben. Een andere belangrijke stap is om de verhouding splicing middel van semi-kwantitatieve RT-PCR assay. In het algemeen, ook de mensy amplificatiecycli moeten worden vermeden, aangezien zij de PCR reactie kan verzadigen. In onze experimenten met co-expressie van een reporter splicing, 20 - 25 cycli werden routinematig gebruikt, maar dit kan variëren afhankelijk van de overvloed aan mRNA bij het meten van de splicing van endogene genen. Bij de berekening van de splicing-isovormen met een nieuw stel primers, stellen wij voor het kalibreren van de PCR-experiment telkens, zoals hiervoor beschreven 16.

Een mogelijke beperking designer ESFT hun off-doeleffecten, omdat de specificiteit wordt bepaald door het aantal herhalingen in de PUF scaffold. Wildtype PUF herkent een 8-nt site, die vergelijkbaar is met de specificiteit van een siRNA dat zijn doel herkent door middel van "seed match." Aangezien elke 8-nt sequentie eenmaal in een transcript 65.000 zou kunnen ontstaan door toeval nt lang (4 8 = 65.536), zullen er andere off-target transcripten die door de ontwerper PUF. De off-target effEct kan verminderd worden door PUF's te gebruiken met extra repeats; Het is echter nog handig om de specificiteit en off-target effecten van ESF's te evalueren. Om mogelijke off-target effecten te minimaliseren, kan ook de expressie van een combinatie van meerdere ontwerper ESF's op een lager niveau worden uitgevoerd. In zo'n geval kunnen de off-targeted genen niet beïnvloed worden door de lage hoeveelheid ESF's, terwijl de splitsing van het echte doel zal worden beïnvloed door de meerdere ESF's die synergistisch functioneren. Deze oplossing is vergelijkbaar met wat onderzoekers gebruikt bij gensturing met RNAi, waar de gecombineerde siRNA's (elk met een verminderde concentratie) die meerdere sites van een enkel mRNA richten, de off-target effecten kunnen verminderen.

De andere belangrijkste methode om AS te manipuleren is het gebruik van antisense oligonucleotiden die met bepaalde gebieden van het pre-mRNA koppelen. Vergeleken met deze bestaande methode kunnen de ESF's langdurige effecten veroorzaken bij stabiele getransfecteerde cellen. Daarnaast is de in vivo aflevering van ESF kunnen profiteren van de toenemende arsenaal van gentherapie vectoren, terwijl de in vivo afgifte van antisense oligonucleotiden is zeer moeilijk te beheersen. Bovendien kan deze methode voorkomen gecompliceerde en kostbare modificaties van oligonucleotiden. Toepassing van verschillende induceerbare promoters, kan een nauwkeurige regeling van de ESF expressie in de juiste celsoorten en op de juiste momenten worden bereikt. Het belangrijkste nadeel van deze werkwijze is de relatief lage specificiteit (8 nt herkenningsplaats versus een 16- tot 20-nt herkenningsplaats in typisch antisense oligonucleotiden).

De ontregeling van alternatieve splitsing veroorzaakt veel ziekten, waaronder kanker 26, 27. Genoom-brede studies hebben meer dan 15.000 tumorgeassocieerde splice varianten onthuld in verschillende vormen van kanker 28, 29, 30. Bijvoorbeeld, intronischesplice-plaats mutatie van tumorsuppressorgenen veroorzaken vaak exon-skipping evenementen en produceren afwijkende eiwitten die kunnen bijdragen aan tumor genesis 26, 31, 32. Bovendien zijn sommige splicingfactoren gevonden dat overexpressie gebracht in veel soorten kanker, wat bijdraagt aan celtransformatie 33, 34, wat aangeeft dat splicingfactoren ook een belangrijke rol kunnen spelen bij kanker biogenese. Derhalve naast het verschaffen van een nuttig instrument om genfunctie te moduleren, manipulatie van splicing designer ESFT kan herstellen misregulated splicing gebeurtenissen bij kanker, aldus een mogelijk therapeutisch hulpmiddel. Bovendien, door het fuseren van een ontwerper PUF domein met verschillende functionele domeinen, verschillende kunstmatige factoren die RNA verschillende stofwisselingsprocessen manipuleren worden ontworpen. Bijvoorbeeld de fusie van een translationeel activator (GLD2) of translationele repRessor (CAF1) met het PUF domein produceerde nieuwe factoren die mRNA translatie 27 kunnen activeren of remmen. Met dezelfde ontwerpprincipe combineren we een niet-specifiek RNA endonuclease domein (PIN) met een reeks ontwerper PUF domeinen om kunstmatige site-specifieke RNA endonucleases (ASRE's) te genereren die analoog functioneren met DNA-restrictie enzymen 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie ​​R01-CA158283 en NSFC verlenen 31.400.726 aan ZWYW wordt gefinancierd door de Young Duizend Talents Program en de National Natural Science Foundation of China (subsidies 31.471.235 en 81.422.038). XY wordt gefinancierd door de postdoctorale Science Foundation of China (2015M571612).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14, (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18, (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8, (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352, (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17, (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72, (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1, (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19, (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34, (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286, (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7, (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6, (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6, (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20, (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186, (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19, (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23, (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64, (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4, (3), 4732 (2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68, (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7, (8), 1002218 (2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24, (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14, (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60, (1), 105-117 (2015).
Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).More

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter