Facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement l'épissage alternatif dans les cellules humaines
Summary
Ce rapport décrit une méthode de bio-ingénierie pour concevoir et construire de nouveaux Facteurs d'épissage artificiel (ASF) qui modulent spécifiquement l'épissage des gènes cibles dans les cellules de mammifères. Cette méthode peut être élargie pour englober divers facteurs artificiels pour manipuler d'autres aspects du métabolisme de l'ARN.
Abstract
Le traitement de la plupart des ARN eucaryotes est médié par des protéines de liaison à l'ARN (RBP) avec des configurations modulaires, y compris un module de reconnaissance d'ARN, qui lie spécifiquement la cible pré-ARNm et un domaine effecteur. Auparavant, nous avons profité du mode unique de liaison de l'ARN du domaine PUF dans le Pumilio humain 1 pour générer un échafaudage de liaison d'ARN programmable, qui a été utilisé pour concevoir divers RBP artificiels pour manipuler le métabolisme de l'ARN. Ici, un protocole détaillé est décrit pour construire Engineered Splicing Factors (ESF) qui sont spécifiquement conçus pour moduler l'épissage alternatif des gènes cibles. Le protocole comprend la façon de concevoir et de construire un échafaudage PUF personnalisé pour une cible d'ARN spécifique, comment construire un plasmide d'expression ESF en fusionnant un domaine PUF concepteur et un domaine effecteur, et comment utiliser les ESF pour manipuler l'épissage des gènes cibles. Dans les résultats représentatifs de cette méthode, nous avons également décrit les tests communsDes activités du FSE en utilisant les journalistes d'épissage, l'application du FSE dans les cellules humaines cultivées et l'effet subséquent des changements d'épissage. En suivant les protocoles détaillés dans ce rapport, il est possible de concevoir et de générer des ESF pour la régulation de différents types d'épissage alternatif (AS), en fournissant une nouvelle stratégie pour étudier la régulation de l'épissage et la fonction des différentes isoformes d'épissage. De plus, en fusionnant différents domaines fonctionnels avec un domaine PUF conçu, les chercheurs peuvent concevoir des facteurs artificiels qui ciblent des ARN spécifiques pour manipuler diverses étapes du traitement de l'ARN.
Introduction
La plupart des gènes humains subissent Alternative Splicing (AS) pour produire des isoformes multiples avec des activités distinctes, ce qui a considérablement augmenté la complexité du codage du génome 1, 2. AS fournit un mécanisme important pour réguler la fonction des gènes, et il est étroitement régulée par des voies différentes à différents stades cellulaires et de développement 3, 4. Parce que l' épissage misregulation est une cause fréquente de la maladie humaine 5, 6, 7, 8, ciblage régulation de l' épissage devient une voie thérapeutique intéressante.
Selon un modèle simplifié de la régulation de l' épissage, comme cela est principalement contrôlée par épissage cis Regulatory -elements (SRE) dans le pré-ARNm qui fonctionnent comme activateurs d'épissage d'exons ou des silencieux de remplacement. thSRE ese recruter spécifiquement divers facteurs protéiques trans -acting ( à savoir les facteurs d'épissage) qui favorisent ou inhibent la réaction d'épissage 3, 9. La plupart des facteurs d'épissage trans -acting ont des domaines de liaison d'ARN spécifiques de séquence distincts pour reconnaître leurs cibles et domaines effecteurs pour contrôler l' épissage. Les exemples sont les membres de la sérine / riche en arginine (SR) de la famille de protéines qui contiennent de l' ARN N-terminaux de reconnaissance motifs (RRMS), qui se lient activateurs d'épissage d' exons, et des domaines RS C-terminaux, qui favorisent l' inclusion de l' exon 10 les plus connus . A l' inverse, hnRNP A1 se lie à des silencieux d'épissage d' exons dans les domaines RRM et inhibe l' inclusion de l' exon à travers un domaine riche en glycine C-terminal 11. L'utilisation de ces configurations modulaires, les chercheurs devraient être en mesure de concevoir des facteurs d'épissage artificiels en combinant un domaine ARN liaison spécifique (RBD) avec différents effecdomaines tor qui activent ou inhibent l'épissage.
La clé d'une telle conception consiste à utiliser un RBD qui reconnaît les cibles donné avec une spécificité de liaison d'ARN programmable, qui est analogue au mode de liaison à l'ADN du domaine CONTE. Cependant, la plupart des domaines contiennent des facteurs d'épissage RRM ou K Homologie (KH) natifs, qui reconnaissent des éléments d'ARN courts avec une faible affinité , et donc un manque de reconnaissance prédictive d'ARN-protéine « code » 12. Le RBD des protéines de répétition MPU ( à savoir le domaine PUF) dispose d' un mode de reconnaissance de l' ARN unique, permettant pour la refonte des domaines PUF de reconnaître spécifiquement l' ARN cibles différentes 13, 14. Le domaine PUF canonique contient huit répétitions de trois hélices a, en reconnaissant chacun une base unique dans une cible d'ARN de 8 nt. Les chaînes latérales des acides aminés à certaines positions des secondes liaisons hydrogène spécifiques forment α-hélice avec le bord de Watson-Crick de tLa base d'ARN, qui détermine la spécificité de liaison de l'ARN de chaque répétition ( figure 1A ). Le code pour la reconnaissance par ARN de la répétition PUF est étonnamment simple ( Figure 1A ), permettant la génération de domaines PUF qui reconnaissent toute combinaison possible de 8 bases (examinée par Wei et Wang 15 ).
Ce principe de conception modulaire permet la génération d'un Factor d'épissage Engineered (ESF) qui consiste en un domaine PUF personnalisé et un domaine de modulation d'épissage ( c'est-à-dire un domaine SR ou un domaine riche en Gly). Ces ESF peuvent fonctionner comme activateurs d'épissage ou comme inhibiteurs pour contrôler différents types d'événements d'épissage, et ils se sont révélés utiles comme outils pour manipuler l'épissage des gènes endogènes liés à la maladie humaine 16,17 . Par exemple, nous avons construit des ESF de type PUF-Gly pour modifier spécifiquement l'épissage du gène Bcl-x, La conversion de l'isoforme longue anti-apoptotique (Bcl-xL) en isoforme courante pro-apoptotique (Bcl-xS). Le changement du rapport de l'isoforme Bcl-x était suffisant pour sensibiliser plusieurs cellules cancéreuses à de multiples médicaments contre la chimiothérapie anticancéreux 16 , ce qui suggère que ces facteurs artificiels peuvent être utiles en tant que réactifs thérapeutiques potentiels.
En plus de contrôler l'épissage avec des domaines effecteurs d'épissage connus ( par exemple, un domaine RS ou Gly), les facteurs PUF modifiés peuvent également être utilisés pour examiner les activités de nouveaux facteurs d'épissage. Par exemple, en utilisant cette approche, nous avons démontré que le domaine C-terminal de plusieurs protéines SR peut activer ou inhiber l'épissage lors de la liaison à différentes régions pré-ARNm 18 , que le motif riche en alanine de RBM4 peut inhiber l'épissage 19 et Le motif riche en proline de DAZAP1 peut améliorer l'épissage 20 , 21 </ Sup>. Ces nouveaux domaines fonctionnels peuvent être utilisés pour construire des types supplémentaires de facteurs artificiels pour affiner l'épissage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce rapport fournit une description détaillée de la conception et la construction de facteurs d'épissage artificiels qui peuvent manipuler spécifiquement l'épissage alternatif d'un gène cible. Ce procédé met à profit le mode de liaison unique de l'ARN de PUF répète pour produire un échafaudage de liaison à l'ARN avec une spécificité personnalisée. Il peut être utilisé pour activer ou réprimer épissage.
L'étape critique dans ce protocole est la gén…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par subvention du NIH R01-CA158283 et NSFC accorde à 31.400.726 ZWYW est financé par le programme Jeunes Talents Mille et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions 31471235 et 81422038). XY est financé par la fondation scientifique post-doctorale de la Chine (2015M571612).
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
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