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Genetics

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

doi: 10.3791/54967 Published: April 26, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Dieser Bericht beschreibt ein Bioengineering Verfahren zu entwerfen und neuartige Künstliches Spleißfaktoren (ASFs) zu konstruieren, die das Spleißen von Zielgenen in Säugetierzellen spezifisch modulieren. Dieses Verfahren kann weiter ausgebaut werden, um verschiedene künstliche Faktoren zu konstruieren, andere Aspekte des RNA-Metabolismus zu manipulieren.

Abstract

Die Verarbeitung der meisten eukaryotischen RNAs durch RNA-Bindungsproteine ​​(RBPs) mit modularen Konfigurationen, einschließlich einer RNA-Erkennungsmodul, vermittelt, die spezifisch die prä-mRNA-Target und eine Effektor-Domäne bindet. Bisher haben wir die Vorteile des einzigartigen RNA-Bindungsmodus der PUF-Domäne in der menschlichen Pumilio 1 genommen ein programmierbares RNA-Binde Gerüst zu erzeugen, die verwendet wurde, verschiedene künstliche RBPs Ingenieur RNA-Metabolismus zu manipulieren. Hier wird ein detailliertes Protokoll wird beschrieben Engineered Spleißfaktoren (ESFs) zu konstruieren, die speziell darauf ausgelegt sind, die alternativen Spleißen von Zielgen zu modulieren. Das Protokoll enthält, wie ein maßgeschneidertes PUF Gerüst für ein bestimmtes RNA-Ziel zu entwerfen und zu konstruieren, wie ein ESF-Expressionsplasmid zu konstruieren, von einer Designer PUF Domäne Verschmelzen und eine Effektor-Domäne, und wie ESFs verwenden, um das Spleißen von Zielgen zu manipulieren. In den repräsentativen Ergebnissen dieser Methode haben wir beschrieben auch die gemeinsamen Testsdie ESF-Aktivitäten unter Verwendung von Splicing-Reportern, die Anwendung des ESF in kultivierten menschlichen Zellen und die anschließende Wirkung von Spleißen Änderungen. Indem Sie die detaillierten Protokolle in diesem Bericht ist es möglich, ESFs für die Regulierung der verschiedenen Arten von Alternative Splicing (AS) zu entwerfen und zu erzeugen, eine neue Strategie Bereitstellung Splicing Regulierung und die Funktion der unterschiedlichen Splicing-Isoformen zu untersuchen. Darüber hinaus kann durch verschiedene funktionelle Domänen mit einer projektierten PUF Domäne Verschmelzen können die Forscher künstliche Faktoren entwickeln, die spezifischen RNAs Ziel verschiedene Schritte von RNA-Prozessierung zu manipulieren.

Introduction

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Die meisten menschlichen Gene werden einem alternativen Spleißen (AS) unterzogen, um mehrere Isoformen mit unterschiedlichen Aktivitäten zu produzieren, was die Kodierungskomplexität des Genoms 1 , 2 stark erhöht hat. AS bietet einen wichtigen Mechanismus zur Regulierung der Genfunktion, und es ist eng reguliert durch verschiedene Wege in verschiedenen zellulären und Entwicklungsstadien 3 , 4 . Weil das Spleißen der Fehlinformation eine häufige Ursache für die menschliche Erkrankung ist 5 , 6 , 7 , 8 , wird die Zielvermehrungsregelung zu einem attraktiven therapeutischen Weg.

Nach einem vereinfachten Modell der Spleißregulierung wird AS hauptsächlich durch Splicing Regulatory cis -Elements (SREs) in Pre-mRNA kontrolliert, die als Spleißverstärker oder Schalldämpfer von alternativen Exons fungieren. ThEse SREs rekrutieren spezifisch verschiedene transaktive Proteinfaktoren ( dh Spleißfaktoren), die die Spleißreaktion 3 , 9 fördern oder unterdrücken. Die meisten transaktiven Spleißfaktoren haben separate sequenzspezifische RNA-Bindungsdomänen, um ihre Ziele und Effektordomänen zu erkennen, um das Spleißen zu kontrollieren. Die bekanntesten Beispiele sind die Mitglieder der Serin / Arginin-reichen (SR) Proteinfamilie, die N-terminale RNA-Anerkennungs-Motive (RRMs) enthalten, die exonische Spleißverstärker binden und C-terminale RS-Domänen, die den Exon-Einschluss fördern . Umgekehrt bindet hnRNP A1 an exonische Spleißschalldämpfer durch die RRM-Domänen und hemmt den Exoneinschluss durch eine C-terminale Glycin-reiche Domäne 11 . Mit solchen modularen Konfigurationen sollten Forscher in der Lage sein, künstliche Spleißfaktoren durch die Kombination einer spezifischen RNA-Binding Domain (RBD) mit verschiedenen Effec zu entwickelntor-Domänen, die Splicing aktivieren oder hemmen.

Der Schlüssel für eine solche Gestaltung ist es, eine RBD zu verwenden, die Ziele mit programmierbaren RNA-Bindungsspezifität gegeben erkennt, die an die DNA-Bindungsmodus des TALE Domäne analog ist. Allerdings enthalten die meisten nativen Spleißfaktoren RRM oder K Homology (KH) Domänen, die kurze RNA - Elemente mit schwacher Affinität erkennen und somit fehlt eine prädiktive RNA-Protein - Erkennung „Code“ 12. Das RBD von PUF repeat Proteinen (dh der PUF - Domäne) hat einen einzigartigen RNA Erkennungsmodus für die Neugestaltung von PUF Domänen ermöglichen spezifisch an verschiedene RNA - Targets 13, 14 zu erkennen. Die kanonische PUF Domäne enthält acht Wiederholungen von drei α-Helices, die jeweils eine einzelne Base in einem 8-nt RNA-Ziel zu erkennen. Die Seitenketten der Aminosäuren an bestimmten Positionen der zweiten α-Helix bilden spezifische Wasserstoffbrücken mit dem Watson-Crick Rand ter RNA - Basen, die die RNA - Bindungsspezifität von jedem Rapport (1A) bestimmt. Der Code für die RNA - Basenerkennungs der PUF repeat ist überraschend einfach (Figur 1A), so dass für die Erzeugung von PUF - Domänen , die jeden möglichen 8-Basen - Kombination erkennen (rezensiert von Wei und Wang 15).

Dieses Baukastenprinzip ermöglicht die Erzeugung eines Engineered Splicing Factor (ESF), die aus einer angepassten PUF - Domäne und einer Spleiß - Modulations Domäne (also eine SR - Domäne oder eine Gly-reichen Domäne) besteht. Diese ESFs funktionieren kann entweder als Splicing Aktivatoren oder als Inhibitoren auf verschiedene Arten von Spleißereignisse zu steuern, und sie haben sich bewährt , als Werkzeuge , um das Spleißen endogener Gene zu manipulieren , 16 für die menschliche Krankheit verbundenen, 17. Als Beispiel haben wir PUF-Gly-Typ-ESFs konstruiert, um speziell das Spleißen des Gens Bcl-x zu verändernDie anti-apoptotische lange Isoform (Bcl-xL) an die pro-apoptotische kurze Isoform (Bcl-x S) umzuwandeln. Eine Verschiebung des Verhältnisses der Bcl-x - Isoform war ausreichend , um mehrere Krebszellen mehr Anti-Krebs - Chemotherapie - Medikament 16, zu sensibilisieren darauf hindeutet , dass diese künstlichen Faktoren als potentielle therapeutische Reagenzien nützlich sein können.

Zusätzlich Spleißen mit bekannten Spleißen Effektordomänen zu steuern (beispielsweise eine RS oder Gly-reiche Domäne) kann die engineered PUF Faktoren auch die Aktivitäten des neuen Spleißfaktoren zu untersuchen , verwendet werden. Zum Beispiel kann bei Verwendung dieses Ansatzes haben wir gezeigt , dass die C-terminale Domäne von mehreren SR - Proteine aktivieren oder Splicing hemmen , wenn auf verschiedene prä-mRNA - Bereiche 18, dass das Alanin-reiches Motiv von RBM4 Bindung kann Splicing 19, hemmen , und dass das Prolin-reiches Motiv DAZAP1 kann 20 Spleißen verbessern, 21 </ Sup>. Diese neuen funktionellen Domänen können verwendet werden, um zusätzliche Arten von künstlichen Faktoren Feinabstimmung Spleißen zu konstruieren.

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Protocol

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1. Aufbau eines PUF Scaffold mit Customized RNA-bindende Spezifität von PCR Overlapping

  1. Entwerfen eine Reihe von PCR - Primern , die PUF - Sequenzen enthalten , die spezifisch verschiedene RNA - Nukleotide in jeder Position erkennen , 12 (siehe Tabelle 1 für die Primersequenzen siehe Abbildung 1 und A für den RNA: PUF Erkennungscode). Für jede PUF wiederholen, Design vier verschiedene Primer eine andere Basis, auf jeder Position zu erkennen.
    ANMERKUNG: Diese Primer werden in einer Reihe von vier Runden von PCR - Reaktionen verwendet werden PUF - Fragmente zu erzeugen , die zusammen (Abbildung 1 B) verbunden sind.
  2. Wählen Sie die Erkennungsstelle des Zielgens in der Nähe der alternative Spleißstelle.
    HINWEIS: Diese Seite kann vom Anwender festgelegt werden, und es wird in der Regel innerhalb von 10 gewählt - 50 nt von den alternativen Spleißstellen.
  3. Runde 1: Erzeugen Sie kodierenden Sequenzenfür 4 PUF-Repeats, universal Brücken Fragmente und Fragmente Kappe.
    1. Verwenden Sie die Zielstelle des Erkennungscodes für jede Wiederholung des individualisierten PUF zu definieren. Wählen Sie den Satz von PCR - Primern für PUF wiederholt 1 - 8. Durchführung vier aufeinanderfolgende Runden der PCR eine angepasste PUF - Domäne zu erzeugen, wie nachstehend beschrieben (Figur 1 B).
    2. In der ersten Runde der PCR, Standard-PCR-Reaktionsgemische (enthaltend 2,5 ul 10x-Puffer, 0,5 ul 10 mM dNTPs, 0,5 & mgr; l von 10 & mgr; M Vorwärts-und Rückwärts-Primer, 50 ng der DNA-Matrize (menschliche cDNA oder Expressionsvektor aufgebaut WT von PUF-Domäne), und 0,5 U High-Fidelity-DNA-Polymerase in einem 25 & mgr; l Endvolumen).
      ANMERKUNG: Diese Reaktionen werden DNA - Sequenzen zu erzeugen , um jedes PUF Repeat entsprechen, zu dem Universal Brücken Fragmente und zwei Kappen Fragmente mit unterschiedlichen Restriktionsstellen (Figur 1 B). Eine kurze Liste der Vorlagen, GrundierungenUnd erzeugten PCR - Produkte , die in diesem Schritt verwendet werden , in Tabelle 2 dargestellt.
    3. Stellen Sie das PCR-Programm wie folgt: 5 min bei 95 ° C; 28 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 15 s bei 72 ° C; und 5 min Inkubation bei 72 ° C. Verwenden Sie High-Fidelity DNA-Polymerase Punktmutationen während der PCR zu minimieren.
  4. Runde 2: Generieren Sequenzen, die für R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) und R5 / R6 / R7 / R8 (R 5 - 8).
    1. Trenne die PCR-Produkte, erhalten in Schritt 1.3.3 unter Verwendung von Elektrophorese mit einem 1,5% igen Agarosegel (25 Minuten bei einer konstanten Spannung von 120 V). Gel-reinigt alle Produkte der erwarteten Größe unter Verwendung eines Gel-Reinigungs-Kit. Verwenden Sie eine andere Mischung dieser Produkte als Vorlage in den folgenden Runden von PCR.
      HINWEIS: Mischen Sie die drei PCR-Produkte in etwa ein 1: 1: 1-Verhältnis. Sie müssen in der Regel nicht quantifiziert werden, solange die Intensität jedes Produkt in dem Gel ähnlich sieht.
    2. Mischen Sie etwa 5% der gereinigten PCR-Produkte als TemPlatte in der nächsten Runde des PCR. Alternativ Quantifizierung der gereinigten PCR-Produkte eines UV-Vis-Spektrophotometer und 15 ng von jedem PCR-Produkt in der Vorlage Mischung verwenden.
    3. Verwenden gereinigten PCR-Produkte R1 / R2, R3 / R4 und Brücke 2/3 als Misch Vorlagen und R1-R4 und F-R als Primer. Stellen Sie die PCR-Reaktion in Schritt 1.3 beschrieben als R1 überlappende PCR-Produkt zu erhalten, - 4.
    4. Verwenden gereinigten PCR - Produkte R5 / R6, R7 / R8 und Brücke 6-7 als gemischte Vorlagen und R5 und R8-F-R als Primer überlappende PCR - Produkt R5-8 (1 B) zu erhalten. Stellen Sie das PCR-Programm wie folgt: 5 min bei 95 ° C; 28 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 30 s bei 72 ° C; und 5 min bei 72 ° C. Gel-reinigen R1-4 und R5-8.
  5. Runde 3: Generieren Kodiersequenzen für R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 ohne Kappen).
    1. In der dritten Runde des PCR, um die gereinigte R1-4, R5-8 und Brücke 4/5 als gemischte Vorlagen und R1-F mit undR8-R als Primer, stellen die PCR-Reaktion wie in Schritt 1.3 beschrieben ein, um ein überlappendes PCR-Produkt R1-8 ohne Kappen zu erhalten.
    2. Stellen Sie das PCR-Programm wie folgt ein: 5 min bei 95 ° C; 28 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 55 s bei 72 ° C; Und 5 min bei 72 ° C. Gel-reinigen die R1-8 ohne Kappen.
  6. Runde 4: Kodierungssequenzen für komplette PUF-Domänen erzeugen.
    1. In der letzten Runde der PCR wurde unter Verwendung der gereinigten R1-8 ohne Kappen und 5'-End- und 3'-Endkappen als Mischvorlagen und Cap-F und Cap-R als Primer die PCR-Reaktion wie in Schritt 1.3 beschrieben aufgebaut Um die endgültigen mutierten PUF-Domänen zu erhalten.
    2. Das PCR-Programm wie folgt einstellen: 5 min bei 95 ° C; 28 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 1 min bei 72 ° C; Und 5 min bei 72 ° C.
    3. Gel-reinigen die PCR-Produkte der endgültigen umprogrammierten PUF-Domänen. Verwenden Sie diese Produkte für den Aufbau des ESF-Expressionsplasmids in den nachfolgenden Schritten. SequDas endgültige Konstrukt, um die umprogrammierten Sequenzen von PUF-Domänen zu verifizieren.
      HINWEIS: Cap-F kodiert NLS (PPKKKRKV) zwischen BamHI- und XbaI- Stellen und Cap-R kodiert ein Stopcodon und die SalI- Stelle (Restriktionsstellen wurden für die Konstruktion von Expressionsvektoren von ESFs, Abbildung 1 C ) entworfen.

2. Aufbau eines Funktionsmoduls von ESFs

  1. Zwei Strategien werden häufig verwendet, um funktionale Module von ESFs (RS-Domänen oder Gly-reiche Domänen) zu klonen: um diese Domänen durch PCR unter Verwendung der gesamten menschlichen cDNA als Matrize zu amplifizieren (Schritt 2.2) oder direkt zu synthetisieren, die DNA-Fragmente, die für verschiedene RS kodieren Oder Gly-reiche Domänen (Schritt 2.3).
  2. Verwenden Sie PCR, um RS-Domänen aus den Resten 123 - 238 von 9G8 (NP001026854), den Resten 180-272 von SRP40 (NP008856) oder den Resten 117 - 221 von SC35 (NP003007) zu klonieren. Klon Gly-reiche Domänen aus Resten 195 - 320 von hnRNP A1 (NP_002127), Rests 203 bis 353 von hnRNP A2 (NP112533) oder Reste 211-378 von hnRNP A3 (NP919223).
    1. Verwenden des NCBI-Primer-Design-Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) oder Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) Primer zu entwerfen für RS Domänen Klonieren oder Gly-reiche Domänen (Funktionsmodul von ESFs).
      HINWEIS: Der Vorwärts - Primer enthält einen N-terminalen FLAG - Tag nach der Website Nhel. Der Rückwärtsprimer enthält eine BamH I - Stelle für die Klonierung in Expressionsvektoren (Figur 1 C).
    2. Stellen Sie die Standard-PCR-Reaktion auf, wie in Schritt 1.3 beschrieben, wird die RS oder Gly-reiche Domänen zu amplifizieren. Stellen Sie das PCR-Programm wie folgt: 5 min bei 95 ° C; 28 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 30 s bei 72 ° C; und 5 min bei 72 ° C.
  3. Clone RS Domänen oder Gly-reiche Domänen durch direkte DNA-Synthese. Stattdessen PCR-Produkte zu erzeugen, die für die Effektor-Domänen in Schritt 2.2, kodieren syntheGröße eines Oligonukleotids, das eine Kurzfragment-RS-Domäne (RSRSRSRSRSRS) oder eine Gly-reiche Domäne (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) unter Verwendung einer kommerziellen Quelle von DNA-Oligonukleotiden kodiert.

3. Konstruktion von ESF-Expressionsplasmiden

  1. Konstruieren Sie ESF-Expressionsplasmide unter Verwendung eines beliebigen Expressionsvektors.
    HINWEIS: Es wurde ursprünglich ein Expressionskonstrukt pGL-Gly-MS2 (ein Geschenk von Dr. R. Breathnach vom Institut de Biologie-CHR 11 ) verwendet, das vom N- zum C-Terminal, einem FLAG-Epitop, einem Gly, kodiert -Region von hnRNP A1 und dem MS2-Hüllprotein. Daher wird dieses Ausdruckskonstrukt als Beispiel in dem folgenden Schritt verwendet.
    HINWEIS: Andere Expressionsvektoren mit mehreren Klonierungsstellen können ebenfalls verwendet werden, und die Standardklonierungsschritte werden angewendet, um die Fragmente zusammenzuhalten.
  2. Digg 1,5 μg der in Schritt 3.1 erwähnten Expressionsplasmide (pGL-Gly-MS2), um das MS2-Hüllproteinfragment zu entfernen. Verwenden Sie die restricEndonukleasen BamH I und Sal I für 1 h bei 37 ° C. Digest das Erkennungsmodul von ESFs (Codierung eines NLS und umprogrammierten PUF Domains, erzeugt in Schritt 1.5) mit BamH I und Sal I in der gleichen Bedingung.
  3. Fügen Sie 5x Beladungsfarbstoff zu den Restriktionsverdauungsreaktionen hinzu und elektrophorieren Sie das Gesamtvolumen langsam mit einem 1,5% igen Agarosegel, das einen DNA-Gelfleck für 40 min bei 120 V enthält. Gel-reinigen Sie die verdauten Produkte.
  4. Bereiten Sie 10 μl Ligationsreaktionen mit einem gereinigten Erkennungsmodul von ESF-Inserts und Expressionsvektor-DNA in einem 3: 1-Verhältnis, 1 μl DNA-Ligase und 1 μl 10x Ligationspuffer vor. Inkubieren der Ligationsreaktionen über Nacht bei 4 ° C; Das resultierende Konstrukt exprimiert einen ESF (PGL-Gly-PUF) vom Gly-PUF-Typ unter der Kontrolle eines CMV-Promotors (Abbildung 1 C ).
  5. Entfernen Sie das Fragment, das die FLAG / Gly-reiche Domäne kodiert, mit Nhe I und BamH I Verdauung für 1 h bei 37 ° C Ersetzen Sie es durch ein Fragment, das die RS-Domäne kodiert (erzeugt in Schritt 2.2, auch verdaut von Nhe I und BamH I); Das resultierende Konstrukt drückt einen ESF vom RS-PUF-Typ aus (Abbildung 1 C ).

4. Bau des Spleißreporters

  1. Synthese von Oligonukleotiden, die die Kandidatensequenzen enthalten ( dh Zielsequenzen von PUF-Domänen), die von XhoI- und ApaI- Stellen oder XhoI- und EcoRI- Stellen flankiert sind. Anneal die Oligonukleotide für 5 min bei 55 ° C, um doppelsträngige Inserts zu erhalten, die die Erkennungsstellen von PUF-Domänen enthalten, die von den zusammenhängenden Enden der Xho I- und Apa I- oder Xho I- und EcoR I-Stellen flankiert sind.
  2. Starten Sie von einem zuvor beschriebenen modularen Spleißreporter 22 , pGZ3, der zwei GFP-Exons enthält, die durch ein Test-Exon (Exon 12 des humanen IGF2BP1, Ensembl ID ENSG000001) getrennt sind59217) und seine flankierenden Introns.
    HINWEIS: Der Test Exon mit Xho I und Apa I - Stellen dazu entworfen wurde, die verwendet werden können synthetisierte Oligonukleotide einzufügen , enthaltend die Kandidatensequenzen (Zielsequenzen von PUF - Domänen). Dieser modulare Splicing Reporter (pGZ3) durch die Plasmid-Repository-Add-Gene zur Verfügung gestellt.
  3. Verdauen der Basis reporter pGZ3 (hergestellt in Schritt 4.2) mit der Xho I und Apa I - Restriktionsendonukleasen für 1 h bei 37 ° C.
  4. Gel-Reinigung der verdauten Produkte, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
  5. Herstellung von 10 ul Ligationsreaktionen mit den doppelsträngigen Inserts in Schritt erzeugten 4.1 und der verdauten Vektor pGZ3 in Schritt erzeugten 4,4 in einer 3: 1-Molverhältnis, 1 ul DNA-Ligase und 1 ul 10fach Ligationspuffer. Inkubieren der Ligationsreaktionen über Nacht bei 4 ° C der Konstruktions Splicing Reportervektor pGZ3 zu erhalten.
  6. Legen Sie die doppelsträngige erzeugten Einsätze in Schritt 4.1 in die zuvorVeröffentlichte Reporter, pEZ-1B (unter Verwendung von Xho I und EcoR I-Standorten) und pEZ-2F (unter Verwendung von Xho I und Apa I-Standorten) 23 , um den konkurrierenden 5's-Reporter und den konkurrierenden 3's-Reporter zu erhalten, wie in den Schritten beschrieben 4.3-4.5.
    HINWEIS: Beide Arten von Spleißreportern werden über Add-Gen zur Verfügung stehen.

5. Konstruktion von lentiviralen Expressionsvektoren für ESF

  1. Stellen Sie die Standard-PCR-Reaktion wie in Schritt 1.3 beschrieben ein, um die Volllängen-ESFs aus den ursprünglichen Expressionsvektoren (pGL-Gly-PUF oder pGL-RS-PUF) mit Primern, die Mlu I / SpeI- Stellen enthalten, zu amplifizieren. Das PCR-Programm wie folgt einstellen: 5 min bei 95 ° C; 28 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 1,5 min bei 72 ° C; Und 5 min bei 72 ° C.
  2. Durch eine Verdauungsreaktion, Gelreinigung und Ligationsreaktion integrieren die ESFs in den lentiviralen Expressionsvektor pWPXLd zwischen dem Mlu Spe I-Standorte, wie in den Schritten 3.2-3.4 beschrieben.
  3. Verwenden Sie das Standard-Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren, wie bereits berichtet, um Lentiviren durch Cotransfektion von HEK293T-Zellen durch Verpacken der Vektoren psPAX2 und pMD2.G mit entweder pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF ( Wt) (als Spezifitätskontrolle) oder pWPXLd-GFP (Mock).
    1. Samen 5x10 6 HEK293T Zellen in 10 cm Schalen und wachsen die Zellen über Nacht in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) pro Schale in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 . Führen Sie die Transfektion durch, wenn die Zellen 70 - 90% konfluent sind.
    2. Die Plasmidmischung durch Zugabe der drei Plasmide (7,5 μg des Verpackungsvektors, psPAX2, 2,5 μg pMD2.G und 10 μg entweder pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (wt) , Oder pWPXLd-GFP) zu einem 2-ml-Röhrchen.
    3. Fügen Sie 560 μl 0,25 M CaCl hinzu2 und 560 μl 2x BBS-Lösung zum 2-ml-Röhrchen. Mischen Sie es vorsichtig mehrmals und inkubieren Sie es für 15 min bei RT, um die Transfektionsmischung herzustellen.
    4. Fügen Sie alle Transfektionsmischungen zu den 10-cm-Gerichten hinzu. Die Gerichte vorsichtig umrühren und über Nacht bei 3% CO 2 und 37 ° C inkubieren.
    5. Entfernen Sie das Medium, fügen Sie 10 ml frisches DMEM mit 2% FBS zu jeder Schale hinzu und inkubieren Sie sie mit 10% CO 2 und 37 ° CO / N.
    6. Sammle den ersten Überstand aus dem Geschirr. Füge 10 ml frisches DMEM mit 2% FBS zu jeder Schale hinzu. Inkubieren Sie das Geschirr O / N bei 10% CO 2 und 37 ° C. Den Überstand bei 4 ° C aufbewahren.
    7. Sammle den zweiten Überstand aus dem Geschirr. Pool der Überstand von der ersten und zweiten Ernte. Löschen Sie den Überstand von Zelltrümmer, indem Sie ihn durch ein 0,4 μm Filter filtrieren. Den gereinigten Überstand direkt verwenden oder bei -80 ° C aufbewahren.
  4. Bestimmen Sie den Titer des Lentivirus durch Infektion von HEK293T-Zellen mit seriellen Verdünnungen der Viruspräparation, wie bereits berichtet, 25 .

6. Speziell modulierende Exon-Inclusion und die alternative Verwendung von Splice-Sites mit ESFs

  1. Seed 2 x10 5 HEK293T Zellen in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Wachsen Sie die Zellen über Nacht in 500 μl DMEM, ergänzt mit 10% FBS in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 .
  2. Mischen Sie das liposomale Transfektionsreagenz durch sanftes Umkehren der Flaschen vor Gebrauch. 2 μl liposomales Transfektionsreagenz in 50 μl reduziertem Serummedium verdünnen. Mischen Sie sanft und inkubieren Sie sie für 5 min bei RT.
  3. Verdünnen Sie 0,04 μg pGL-Gly-PUF-Expressionsvektoren und 0,2 μg pGZ3-Reporterplasmide in 50 μl reduziertem Serummedium in einem sterilen Röhrchen. 0,4 μg pGL-RS-PUF-Expressionsvektoren und 0,2 μg pGZ3-Reporterplasmide in 50 μl reduziertem Serummedium in einem sterilen Röhrchen verdünnen. DIlute 0,4 μg pGL-RS-PUF-Expressionsvektoren und 0,2 μg pEZ-1B oder pEZ-2F-Reporterplasmide in 50 μl reduziertem Serummedium in einem sterilen Röhrchen.
  4. Nach 5 min Inkubation bei RT mischen Sie das in Schritt 6.2 hergestellte verdünnte liposomale Transfektionsreagenz vorsichtig mit den in Schritt 6.3 hergestellten verdünnten Plasmiden. Inkubieren Sie die Mischung für 20 min bei RT.
  5. Fügen Sie die gesamten Transfektionsmischungen, die die in Schritt 6.4 hergestellten Expressionsvektoren und Transfektionsreagenz enthalten, in jede Vertiefung und inkubieren für mindestens 12 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 .
  6. Nach 12 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 verwerfen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und waschen sie mit 500 μl Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) / Vertiefung.
  7. Verwerfe das PBS und füge 200 μl Trypsin zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 für 5 min. Füge 1 ml des Mediums hinzu, um die Di zu stoppengestion und die Zellen in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen übertragen.
  8. Zentrifugieren der Röhrchen für 3 min bei 5000 xg und verwerfen das Medium. 0,5 mL RNA-Extraktionspuffer pro Röhrchen, die Zellen durch wiederholtes Pipettieren lysieren. Inkubieren der homogenisierten Proben für 5 min.
  9. Für jede RNA-Extraktionspuffer behandelten Probe, fügen 0,1 ml Chloroform pro 0,5 mL RNA-Extraktionspuffer. Invertieren die Röhrchen für 15 s und inkubieren sie für 3 min bei RT.
  10. Zentrifugieren der Röhrchen für 15 min bei 12.000 × g und 4 ° C. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. Zugabe von 0,25 ml Isopropanol pro 0,5 mL RNA-Extraktionspuffer für die anfängliche Homogenisierung verwendet.
  11. Mix durch Vortexen und Inkubation sie bei RT für 10 min. Zentrifugiere die Röhrchen bei 12.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation wird die RNA Niederschlag auf dem Boden des Rohrs in der Regel sichtbar.
  12. Überstand verwerfen und waschen das RNA-Pellet mit 0,5 ml 75% igem Ethanol pro 0,5 mL RNA-Extraktionspuffer.
  13. Kräftig vortexen und zentrifugiert es bei 7.500 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie die RNA-Pellet. Man löst die RNA in 50 & mgr; l RNase-freiem Wasser.
  14. Fügen Sie 2 ul 5 U / & mgr; l DNase I, 7 ul 10fach Puffer und 11 & mgr; l H 2 O zu jeder 50-ul RNA - Lösung. Inkubieren der Röhrchen bei 37 ° C für 1 h. Erhitzen sie bei 70 ° C für 15 min, um die DNase zu inaktivieren.
  15. Für jede Probe, die folgenden Komponenten zu einem 0,2 ml Nuklease-freien Röhrchen: 1 ul 50 uM Oligo dT, 5 ul von 400 ng / & mgr; l RNA (2 & mgr; g), 1 ul 10 mM dNTP, und 3 ul H 2 O. Führen Sie die Reverse - PCR.
    1. Das Gemisch wird auf 65 ° C für 5 min und Inkubation auf Eis für mindestens 2 min, um die Reformation der Sekundärstruktur zu verhindern. Fügen Sie die folgenden Komponenten mit dem gleichen Röhrchen: 4 ul 5x Erststrang-Puffer, 1 ul 0,1 M DTT, 1 & mgr; l 200 U / & mgr; l reverse Transkriptase und 4 & mgr; l H 2 </ Sub> O Mischen durch Pipettieren vorsichtig auf und ab und inkubieren bei 50 ° C für 60 min. Stoppen Sie die Reaktion durch Erhitzen bei 70 ° C für 15 min.
  16. Für jede Probe fügen Sie die folgenden Komponenten zu einer PCR-Röhre hinzu, um die körpermarkierte PCR zu vervollständigen: 2,5 μl 10x PCR-Puffer, 0,5 μl 10 mM dNTP-Mischung, 1 μl 10 μM Vorwärtsprimer, 1 μl 10 μM Reverse-Primer, 0,25 & mgr; l 5 U / & mgr; l Taq-DNA-Polymerase, 0,5 & mgr; l 25 nM Cy5-dCTP und 2 & mgr; l der in Schritt 6.15 hergestellten cDNA.
    1. Die Reaktion auf 94 ° C für 2 min erhitzen, um die Moleküle zu denaturieren, 25 Zyklen der PCR durchführen (94 ° C für 30 s, 60 ° C 30 s und 72 ° C 30 s), halten die Reaktion bei 72 ° C für 7 min, und dann bei 4 ° C halten.
  17. Lösen Sie die PCR-Produkte durch Elektrophorese durch ein 10% Polyacrylamidgel mit einem 1x Tris-Base, Borsäure und EDTA (TBE) -Puffer. Führen Sie einen Scan mit einem Fluoreszenzscanner durch. Messen Sie dieMenge jeder Splicing-Isoform eine Densitometrie Software.

7. Verwenden ESF Modulierung Endogene Bcl-x Spleiß- und Messen Sie Ihre Auswirkungen auf die Apoptosis

  1. Platte 2 x 10 5 HeLa - Zellen zu jeder Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. Wachsen die Zellen über Nacht in 500 ul DMEM , ergänzt mit 10% FBS in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
  2. Nach 12 h die Zellen mit 2 ug pGL-Gly-PUF (WT) Transfizieren oder 0,2 ug, 1 ug und 2 ug pGL-Gly-PUF (531) (eine Domäne PUF umprogrammiert, die Bcl-x prä- erkennt mRNA mit hohen Affinität, 2 A) sehen.
  3. 24 Stunden später, erntet die Zellen. 1/3 der Zellen sind für die RNA-Isolierung und PCR-Analyse (Schritte von 6,8 bis 6,17) und 2/3 sind für die Proteinisolierung.
  4. Für die Western-Blot-Analyse, sieden die Gesamtzellpellets in 2X Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Ladepuffer für 10 minUnd dann die Proteine ​​in einem 12% SDS-PAGE-Gel lösen. Übertragung der Proteine ​​auf einen Nitrocellulose-Membran.
  5. Blockieren der Membran mit 5% Milch für 1 h bei RT und Inkubieren der Membran O / N mit Caspase-3 (1: 1.000), PARP (1: 1000) oder beta-Actin (1: 5.000) primäre Antikörper (verdünnt in 5% Milch) bei 4 ° C.
  6. Waschen der Membran mit PBS 0,1% Tween 20 (PBS-T) für 5 min bei RT 3x auf einem Schaukelschüttler enthält. Inkubieren der Membran mit HRP-verknüpften Antikörpern (1: 5000 in 5% Milch verdünnt) für 1 h bei RT.
  7. Waschen Sie die Membran mit PBS-T 3x bei RT und dann entwickeln die Membran ECL-Western-Blot-Nachweisreagenzien verwendet wird.
  8. Nach Eintragen von 250 & mgr; l Poly-L-lysin (PLL) auf Deckgläser, inkubieren sie für 15 min bei RT und abzuschöpfen der Flüssigkeit. Waschen Sie die PLL-beschichteten Glasdeckgläsern mit PBS 3x für jeweils 5 min. Für die Immunofluoreszenztest Messung der Apoptose, Samt 5 × 10 5 HeLa - Zellen auf mit Poly-Lysin beschichtete Deckgläser in einer 6-Well - Platte. transfizierbaren pGL-Gly-PUF (WT) oder pGL-Gly-PUF (531) Plasmide in die HeLa-Zellen eine liposomale Transfektionsreagenz (siehe Schritte 6,1-6,5).
  9. 24 h nach der Transfektion fixiert die Zellen auf dem Deckgläschen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1 × PBS für 20 min bei RT. ACHTUNG: PFA ist giftig; sollte diese sorgfältig behandelt in einem Abzug.
  10. waschen behutsam die Zellen auf dem Deckgläschen durch Zugabe von 2 ml 1x PBS. Inkubieren sie für 5 min. Entfernen Sie die PBS mit Pipetten. Wiederholen Sie die Wäsche 3x.
  11. Permeabilisierung der Zellen mit 0,2% Triton X-100 in 1 × PBS für 10 min und dann wäscht sie mit 1x PBS 3x.
  12. Blockiert die Zellen mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS für 10 min und wäscht sie mit 1x PBS 3x.
  13. Verdünne den FLAG-Antikörper 1: 1000 in 3% BSA / PBS und Pipette 30 ul des verdünnten FLAG-Antikörpers auf ein Blatt Parafilm.
  14. Nehmen Sie das Deckglas mit den Zellen, sorgfältig trocknet die überschüssigen Puffer mit Labortüchern, und legt sie auf dem Kopf nach unten (Zellseite nach unten) auf dem 30 & mgr; l anti-FLAG solution. Inkubieren für 1 h bei RT.
  15. Gebe etwa 500 ul 1x PBS auf der Seite des Deckglases mit dem primären Antikörper inkubiert, bis das Deckglas auf der Lösung schwimmt. Sendet sie der 6-well-Platte mit 1x PBS in die Vertiefungen.
  16. Waschen Sie es mit 1x PBS für jeweils 5 min 3x.
  17. Verdünne den Anti-Maus-Sekundär-Antikörper (1: 500) in 3% BSA / PBS; wieder, 30 & mgr; l für jedes Deckglas verwenden. Setzen Sie das Deck upside-down auf der sekundären Antikörper-Lösung und Inkubation für 15 min bei RT.
  18. Entfernen Sie das Deck aus dem Parafilm, wie in Schritt 7.15 beschrieben. Legen Sie es zurück in die 6-Well-Platte und waschen Sie es mit 1x PBS 3x für jeweils 5 Minuten.
  19. Montiert die Deckgläser mit Befestigungsmedium (mit DAPI), das überschüssigen Medium und versiegeln die Kante mit Nagellack.
  20. Visualisieren der Zellen ein Fluoreszenzmikroskop (bei 100-facher Vergrößerung) und fotografieren, sie mit einer Digitalkamera.
    HINWEIS: Die Expression von ESF wird durch die Fluoreszenz-labele visualisiertd sekundäre Antikörper gegen den FLAG-Tag, und die Kernfragmentierung verwendet visualisiert DAPI-Färbung.

8. Messen Sie die Apoptosis verschiedener Krebszellen ESF Ausdruck

  1. Split 2 x 10 6 HeLa - Zellen, MDA-MB-231 - Zellen und A549 - Zellen in 60-mm - Schalen mit 4 ml DMEM , ergänzt mit 10% FBS in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 zu erkennen , die Apoptose mit Propidium Iodid (PI) Färbung.
  2. 24 Stunden später, aktualisieren Sie die mittlere und bereiten den Lentiviren, wie zuvor 24 berichtet.
  3. Verdünne 10 x 10 6 Lentivirus pWPXld-Gly-PUF (WT), pWPXld-Gly-PUF (531) oder pWPXld-GFP Bestände in 4 ml frischem Medium , das Verhältnis von Virus zu Zellenzahl gleich 5 zu machen.
  4. Ändern , das Medium in den Platten auf 4 ml des virushaltigen Mediums in Schritt hergestellten 8,3 und inkubiere die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. 12 h nach der Infektion, verändert das Medium.
  5. Nach 24 h Infektion sammeln und färben die Zellen für 5 min in einer PBS-Lösung, die eine Endkonzentration von 2 μg / ml PI enthält.
  6. Analysieren Sie die PI-gefärbten Zellen mit einem Durchflusszytometer, wie zuvor beschrieben 16 .

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Representative Results

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Dieser Bericht beschreibt das vollständige Protokoll für die Gestaltung und den Bau von ESFs und Spleißreportern. Es skizziert auch die weitere Anwendung von ESFs bei der Manipulation der AS von endogenen Genen 16 . Um typische Ergebnisse von ESF-vermittelten Spleißänderungen zu veranschaulichen, verwenden wir die Daten aus unserer bisherigen Arbeit als Beispiel. Die ESFs mit unterschiedlichen Funktionsdomänen können verwendet werden, um die Einbeziehung des Zielkassettenexons zu fördern oder zu hemmen (Abbildung 1 D & E ). ESFs können auch die Verwendung von alternativen 5'- und 3'-Spleißstellen im Reportersystem beeinflussen (Abbildung 1 F & G ).

Das alternative Spleißen des endogenen Gens kann auch spezifisch mit Designer-ESFs reguliert werden. Wir haben diese Anwendung nach Spezifikation gezeigtIf-Targeting auf Bcl-x, die in zwei antagonistische Isoformen mit alternativen 5'-Spleißstellen gespleißt werden können. Wir haben einen ESF, Gly-PUF (531) entworfen, der ein 8-nt-RNA-Element zwischen den alternativen 5'-Spleißstellen erkennt. Diese Gly-PUF (531) verschob insbesondere das Spleißen zur Herstellung von Bcl-xS (Abbildung 2 A ). Nach der Transfektion des Gly-PUF (531) in HeLa-Zellen erhöhte sich der Gehalt an Bcl-xS-Isoformen und Bcl-xS-Proteinen dosisabhängig, während die Kontrolle ESF, Gly-PUF (WT) das Verhältnis nicht beeinflusste Von Bcl-xS zu Bcl-xL (Abbildung 2 B & C ). Darüber hinaus kann der Designer ESF die Spaltung von Caspase 3 und Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP), zwei bekannte molekulare Marker der Apoptose (Abbildung 2 D ) induzieren. Wie erwartet, sind die Designer-ESFs überwiegend in den Kernen von transfizierten Zellen lokalisiert, als DemoDurch Immunfluoreszenzmikroskopie (Abbildung 2 E ). Konsequent führte die Spleißverschiebung durch Gly-PUF (531) die Fragmentierung von nuklearer DNA, was darauf hinweist, dass diese Zellen Apoptose durchlaufen (Abbildung 2 E ). Die Zunahme der apoptotischen Zellen wurde durch die Untersuchung von mehr als 200 Zellen aus zufällig ausgewählten Feldern und durch Quantifizierung des Prozentsatzes der Zellen mit fragmentierter nuklearer DNA weiter bestätigt (Abbildung 2 F ).

Abbildung 1
Abbildung 1 : Design von ESFs und ihre Aktivität beim Modulieren von Exon Skipping. ( A ) Die spezifische Bindung zwischen der PUF-Domäne und den RNA-Targets ist mit der RNA-PUF-Struktur und einem schematischen Diagramm dargestellt. Der PUF - Bindungscode für jeden derVier RNA-Basen, die auf der rechten Seite mit verschiedenen Farben gezeigt werden, werden verwendet, um PUF-Mutationen zu entwerfen. ( B ) Flußdiagramm, um eine benutzerdefinierte PUF-Domäne zu erhalten. Die PUF, die "UGUAUAUA" erkennt, wurde als Beispiel verwendet. Eine 4-Runden-PCR-Strategie wird verwendet, um ein PUF-Gerüst mit maßgeschneiderter RNA-Bindungsspezifität zusammenzusetzen (farbcodiert ähnlich wie Panel A). In der ersten Runde wird eine Reihe von PCR-Primern, die die gewünschten RNA-Erkennungscodes für zwei benachbarte PUF-Wiederholungen enthalten, verwendet, um vier Fragmente zu erzeugen, die die acht RNA-Erkennungscodes eines vollständigen PUF-Proteins (R1 / R2, R3 / R4) einschließen , R5 / R6 und R7 / R8). Cap-Fragmente, die ein N-terminales Kernlokalisierungssignal, ein C-terminales Stopcodon und Brückenfragmente codieren, werden ebenfalls separat hergestellt (5'-Ende und 3'-Endkappe, Brücke 2/3, Brücke 4/5 und Brücke 6) / 7). In der zweiten Runde werden neue Vorlagen durch Mischen von überlappenden Fragmenten erzeugt, die benachbarte Wiederholungen mit der entsprechenden Brücke codieren ( z. B. Mischen von R1 / R2,R3 / R4 und 2/3 Brücke erzeugen die Vorlage für R1 - 4) und dann mit DNA-Polymerase-Verlängerung, die Lücken zu füllen. In ähnlicher Weise schließt sich die dritte Runde R1-4, R5-8 und Brücke 4/5. Schließlich fügt die vierte Runde der 5'-Ende und 3'-Endkappen der PUF-Domäne zusammen mit den Klonierungsstellen für die nachfolgende Klonierung zur Expressionsvektoren. (C) Modulare Domänenorganisation von ESFs. ein FLAG-Epitop (für die Detektion von ESFs), ein Funktionsmodul (a Gly-reiche Domäne oder eine RS-Domäne), eine NLS: ESFs werden von CMV Promotor (Pfeil) und codiert, vom N- zur C-terminalen getrieben (Erleichterung der Kernlokalisation von ESFs) und eine RNA-Erkennungsdomäne (a PUF-Domäne). NHE I und BamH I sind entworfen , ein Funktionsmodul einzufügen, während Xba I und Sal I entworfen werden , um eine RNA-Erkennungsdomäne einzufügen. (D) Gly-PUF ESFs coexprimiert mit Exon - Skipping - Reportern, und das Spleiß - Muster , das durch RT-PCR untersucht wird. Das modifizierte PUF a b spezifisch an die 8-mer-Ziele A bzw. B (in den gleichen Farben). Alle Kombinationen werden verwendet, so dass die PUF-Zielpaare unterschiedlicher Farbe als Kontrollen dienen. Die Effekte von RS-PUF auf Exon-Skipping ( E ), die konkurrierende 5'-Spleißstelle ( F ) oder der konkurrierende 3'-Spleißstellen-Reporter ( G ) wurden durch ähnliche Verfahren wie Panel D untersucht. Die Daten der RT-PCR Sind von Wang et al. 16 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2 : Regulation von endogenem Bcl-x-Pre-mRNA-Spleißen mit ESFs. ( A ) Schematische Darstellung des alternativen Spleißens von endogenem Bclx pre-mRNA. Zwei alternative 5'-Spleißstelle in Exon 2 von Bcl-x verwendet werden, zu erzeugen, zwei Isoformen in verschiedenen Größen, Bcl-xL und Bcl-x S. Die Sequenz zwischen den beiden UGUGCGUG 5'-Spleißstellen als ESF Ziel ausgewählt, und WT PUF wiederholt 1, 3, und 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) sind neu programmiert (Sternchen) diese Zielsequenz zu erkennen. Die sich ergebende ESF eine Gly-reiche Domäne enthält, hemmt die Verwendung des Downstream-5' ss (durch den roten Pfeil angedeutet). (B) Modulation von Bcl-x 5' ss - Nutzung. Unterschiedliche Mengen des Gly-PUF (531) Expressionskonstrukts in HeLa-Zellen transfiziert. Gly-PUF (WT) als eine Kontrolle verwendet. Zwei Isoformen von Bcl-x mit RT-PCR unter Verwendung von Primern nachgewiesen entsprechend Exons 1 und 3 des Bcl-x-Gens. Der Prozentsatz der Bcl-x S-Isoform wird quantifiziert und unten gezeigt. (C) ESFs beeinflussen die Expression von Bcl-x L und Bcl-x S. Die Proben werden in der gleichen Reihenfolge wie in Panel B geladen, und alle Proteine ​​arE von Western Blots erkannt. Die Expression von ESFs wird durch den Anti-FLAG-Antikörper nachgewiesen und der Tubulinspiegel wird als Kontrolle verwendet. ( D ) Verschiedene Mengen an ESF-Expressionskonstrukten werden in HeLa-Zellen transfiziert, was zu einer Spaltung von PARP und Caspase 3 führt. Proben werden durch Western-Blot 24 h nach der Transfektion nachgewiesen. Der Aktin-Level wird als Kontrolle erkannt. ( E ) Die subzelluläre Lokalisierung von ESFs in transfizierten HeLa-Zellen wird durch Immunfluoreszenzmikroskopie mit dem Anti-FLAG-Antikörper nachgewiesen. Die Zellen werden mit DAPI zusammengefasst, um die Kerne zu zeigen. Einige Kerne, insbesondere in mit Gly-PUF (531) transfizierten Zellen, sind aufgrund der Apoptose fragmentiert. Maßstab: 5 μm. ( F ) Der Prozentsatz der apoptotischen Zellen ( dh Zellen mit fragmentierter nuklearer DNA) wird aus zufällig ausgewählten Feldern von Fluoreszenzmikroskopiebildern gemessen. Die Balken geben den Mittelwert an, während die Punkte die Daten aus den beiden Experimenten angeben. Die FigurS werden aus unserem früheren Bericht von Wang et al. 16 im Einklang mit der Politik der Nature Publishing Group. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung für die Konstruktion und den Bau von künstlichen Spleißfaktoren, die spezifisch das alternative Spleißen eines Zielgens manipulieren kann. Diese Methode nutzt den einzigartigen RNA-Bindungsmodus von PUF wiederholt ein RNA-bindenden Gerüst mit maßgeschneiderter Spezifität herzustellen. Es kann verwendet werden, um entweder aktiviert oder Spleißen unterdrücken.

Der kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Erzeugung der neu programmiert PUF-Domäne, die die Spezifität des ESFs definiert. Ein PCR-Stitching-Protokoll wurde für die schnelle Erzeugung des PUF Gerüst entwickelt und optimiert. Der Schlüssel für den Erfolg ist das Verhältnis der verschiedenen überlappenden Vorlagen auf 1 einzustellen: 1: 1. Die Reinigung der PCR-Produkte nach jeder Runde ist auch entscheidend, weil ungereinigtem Produkte Primer Kontamination aus der letzten Runde haben. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Splicing-Verhältnis unter Verwendung von semi-quantitative RT-PCR zu untersuchen. Im Allgemeinen auch der MenschY-Amplifikationszyklen sollten vermieden werden, da sie die PCR-Reaktion sättigen können. In unseren Experimenten mit der Co-Expression eines Spleißreporters wurden 20 - 25 Zyklen routinemäßig verwendet, aber dies kann je nach Häufigkeit der mRNA variieren, wenn das Spleißen von endogenen Genen gemessen wird. Bei der Quantifizierung der Spleiß-Isoformen unter Verwendung eines neuen Paares von Primern empfehlen wir, das PCR-Experiment jedes Mal zu kalibrieren, wie zuvor beschrieben.

Eine potentielle Einschränkung bei Designer-ESFs ist ihre Off-Target-Effekte, da die Spezifität durch die Anzahl der Wiederholungen im PUF-Gerüst bestimmt wird. Wildtyp PUF erkennt eine 8-nt-Stelle, die mit der Spezifität einer siRNA vergleichbar ist, die ihr Ziel durch "Samen-Match" erkennt. Da jedoch jede 8-nt-Sequenz einmal durch Zufall in einer Transkription von 65.000 nt lang (4 8 = 65.536) auftreten könnte, werden andere Off-Target-Transkripte, die vom Designer PUF erkannt werden, vorhanden sein. Das off-target effect kann durch die Verwendung PUFs mit zusätzlichen Wiederholungen reduziert werden; jedoch ist es nach wie vor sinnvoll, die Spezifität und Nebeneffekte von ESFs zu bewerten. Um mögliche Nebeneffekte zu minimieren, die die Expression einer Kombination mehrerer Designer ESFs auf einem niedrigeren Niveau kann auch durchgeführt werden. In einem solchen Fall sind die off-Zielgene können nicht durch die geringe Menge an ESFs beeinflusst werden, wohingegen das Spleißen der eigentliche Ziel wird durch die mehrfachen ESFs die synergistisch funktionieren, beeinträchtigt werden. Diese Lösung ist ähnlich dem, was Forscher mit RNAi in gene silencing verwendet, wobei die gepoolten siRNAs (jeweils bei einer reduzierten Konzentration), die mehrere Seiten einer einzelnen mRNA-Ziel können die Nebeneffekte verringern.

Die anderen Hauptverfahren zu manipulieren ist, Antisense-Oligonukleotide zu verwenden, die mit bestimmten Regionen der prä-mRNA koppeln. Im Vergleich zu diesen bestehenden Verfahren können die ESFs verursachen verlängerte Effekte in stabil transfizierten Zellen. Darüber hinaus ist die in vivo - Abgabe von ESF kann das zunehmende Arsenal der Gentherapievektoren nutzen, während die in vivo- Zufuhr von Antisense-Oligonukleotiden sehr schwer zu kontrollieren ist. Darüber hinaus kann dieses Verfahren komplizierte und kostspielige Modifikationen von Oligonukleotiden vermeiden. Mit verschiedenen induzierbaren Promotoren kann auch eine genauere Kontrolle der ESF-Expression in den richtigen Zelltypen und zu den richtigen Zeiten erreicht werden. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens ist die relativ geringe Spezifität (eine 8-nt-Erkennungsstelle gegenüber einer 16- bis 20-nt-Erkennungsstelle in typischen Antisense-Oligonukleotiden).

Die Dysregulation der alternativen Spleißen verursacht viele Krankheiten, einschließlich Krebs 26 , 27 . Genom-weite Studien haben mehr als 15.000 Tumor-assoziierte Spleißvarianten in verschiedenen Arten von Krebserkrankungen 28 , 29 , 30 aufgedeckt. Zum Beispiel, intronicSplice-Site-Mutationen von Tumorsuppressorgenen verursachen oft Exon-Skipping-Ereignisse und produzieren aberrante Proteine, die zur Tumor-Genese beitragen können 26 , 31 , 32 . Darüber hinaus sind einige Spleißfaktoren bei vielen Krebsarten überexprimiert, was zur Zelltransformation 33 , 34 beiträgt, was darauf hinweist, dass Spleißfaktoren auch eine wichtige Rolle bei der Krebs-Biogenese spielen können. Daher kann neben der Bereitstellung eines nützlichen Instruments, um die Genfunktion zu modulieren, die Manipulation des Spleißens mit Designer-ESFs fehlgeordnete Spleißereignisse in Krebs wiederherstellen, wodurch ein potentielles therapeutisches Werkzeug bereitgestellt wird. Darüber hinaus können durch die Verschmelzung einer Designer-PUF-Domäne mit unterschiedlichen funktionalen Domänen mehrere künstliche Faktoren, die verschiedene RNA-Metabolismusprozesse manipulieren, entworfen werden. Zum Beispiel die Verschmelzung eines Translationsaktivators (GLD2) oder eines TranslationsrepräsentantenRESSOR (CAF1) mit den PUF - Domäne produziert neuartige Faktoren, die 27 Übersetzung mRNA aktivieren oder hemmen können. Unter Verwendung des gleichen Haupt Design kombinierten wir eine nicht-spezifische RNA - Endonuklease - Domäne (PIN) mit einer Reihe von Designer - PUF Domänen künstlichen ortsspezifische RNA - Endonukleasen (ASRES) zu erzeugen , die analog zu DNA - Restriktionsenzyme 17 funktionieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH Zuschuss R01-CA158283 und NSFC gewähren 31.400.726 zu ZWYW unterstützt von dem Young Thousand Talents-Programm und die National Natural Science Foundation of China (Zuschüsse 31471235 und 81422038) finanziert wird. XY wird durch die Habilitations Science Foundation of China (2015M571612) gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen
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Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).More

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).

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