Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen
Summary
Dieser Bericht beschreibt ein Bioengineering Verfahren zu entwerfen und neuartige Künstliches Spleißfaktoren (ASFs) zu konstruieren, die das Spleißen von Zielgenen in Säugetierzellen spezifisch modulieren. Dieses Verfahren kann weiter ausgebaut werden, um verschiedene künstliche Faktoren zu konstruieren, andere Aspekte des RNA-Metabolismus zu manipulieren.
Abstract
Die Verarbeitung der meisten eukaryotischen RNAs durch RNA-Bindungsproteine (RBPs) mit modularen Konfigurationen, einschließlich einer RNA-Erkennungsmodul, vermittelt, die spezifisch die prä-mRNA-Target und eine Effektor-Domäne bindet. Bisher haben wir die Vorteile des einzigartigen RNA-Bindungsmodus der PUF-Domäne in der menschlichen Pumilio 1 genommen ein programmierbares RNA-Binde Gerüst zu erzeugen, die verwendet wurde, verschiedene künstliche RBPs Ingenieur RNA-Metabolismus zu manipulieren. Hier wird ein detailliertes Protokoll wird beschrieben Engineered Spleißfaktoren (ESFs) zu konstruieren, die speziell darauf ausgelegt sind, die alternativen Spleißen von Zielgen zu modulieren. Das Protokoll enthält, wie ein maßgeschneidertes PUF Gerüst für ein bestimmtes RNA-Ziel zu entwerfen und zu konstruieren, wie ein ESF-Expressionsplasmid zu konstruieren, von einer Designer PUF Domäne Verschmelzen und eine Effektor-Domäne, und wie ESFs verwenden, um das Spleißen von Zielgen zu manipulieren. In den repräsentativen Ergebnissen dieser Methode haben wir beschrieben auch die gemeinsamen Testsdie ESF-Aktivitäten unter Verwendung von Splicing-Reportern, die Anwendung des ESF in kultivierten menschlichen Zellen und die anschließende Wirkung von Spleißen Änderungen. Indem Sie die detaillierten Protokolle in diesem Bericht ist es möglich, ESFs für die Regulierung der verschiedenen Arten von Alternative Splicing (AS) zu entwerfen und zu erzeugen, eine neue Strategie Bereitstellung Splicing Regulierung und die Funktion der unterschiedlichen Splicing-Isoformen zu untersuchen. Darüber hinaus kann durch verschiedene funktionelle Domänen mit einer projektierten PUF Domäne Verschmelzen können die Forscher künstliche Faktoren entwickeln, die spezifischen RNAs Ziel verschiedene Schritte von RNA-Prozessierung zu manipulieren.
Introduction
Die meisten menschlichen Gene werden einem alternativen Spleißen (AS) unterzogen, um mehrere Isoformen mit unterschiedlichen Aktivitäten zu produzieren, was die Kodierungskomplexität des Genoms 1 , 2 stark erhöht hat. AS bietet einen wichtigen Mechanismus zur Regulierung der Genfunktion, und es ist eng reguliert durch verschiedene Wege in verschiedenen zellulären und Entwicklungsstadien 3 , 4 . Weil das Spleißen der Fehlinformation eine häufige Ursache für die menschliche Erkrankung ist 5 , 6 , 7 , 8 , wird die Zielvermehrungsregelung zu einem attraktiven therapeutischen Weg.
Nach einem vereinfachten Modell der Spleißregulierung wird AS hauptsächlich durch Splicing Regulatory cis -Elements (SREs) in Pre-mRNA kontrolliert, die als Spleißverstärker oder Schalldämpfer von alternativen Exons fungieren. ThEse SREs rekrutieren spezifisch verschiedene transaktive Proteinfaktoren ( dh Spleißfaktoren), die die Spleißreaktion 3 , 9 fördern oder unterdrücken. Die meisten transaktiven Spleißfaktoren haben separate sequenzspezifische RNA-Bindungsdomänen, um ihre Ziele und Effektordomänen zu erkennen, um das Spleißen zu kontrollieren. Die bekanntesten Beispiele sind die Mitglieder der Serin / Arginin-reichen (SR) Proteinfamilie, die N-terminale RNA-Anerkennungs-Motive (RRMs) enthalten, die exonische Spleißverstärker binden und C-terminale RS-Domänen, die den Exon-Einschluss fördern . Umgekehrt bindet hnRNP A1 an exonische Spleißschalldämpfer durch die RRM-Domänen und hemmt den Exoneinschluss durch eine C-terminale Glycin-reiche Domäne 11 . Mit solchen modularen Konfigurationen sollten Forscher in der Lage sein, künstliche Spleißfaktoren durch die Kombination einer spezifischen RNA-Binding Domain (RBD) mit verschiedenen Effec zu entwickelntor-Domänen, die Splicing aktivieren oder hemmen.
Der Schlüssel für eine solche Gestaltung ist es, eine RBD zu verwenden, die Ziele mit programmierbaren RNA-Bindungsspezifität gegeben erkennt, die an die DNA-Bindungsmodus des TALE Domäne analog ist. Allerdings enthalten die meisten nativen Spleißfaktoren RRM oder K Homology (KH) Domänen, die kurze RNA – Elemente mit schwacher Affinität erkennen und somit fehlt eine prädiktive RNA-Protein – Erkennung „Code“ 12. Das RBD von PUF repeat Proteinen (dh der PUF – Domäne) hat einen einzigartigen RNA Erkennungsmodus für die Neugestaltung von PUF Domänen ermöglichen spezifisch an verschiedene RNA – Targets 13, 14 zu erkennen. Die kanonische PUF Domäne enthält acht Wiederholungen von drei α-Helices, die jeweils eine einzelne Base in einem 8-nt RNA-Ziel zu erkennen. Die Seitenketten der Aminosäuren an bestimmten Positionen der zweiten α-Helix bilden spezifische Wasserstoffbrücken mit dem Watson-Crick Rand ter RNA – Basen, die die RNA – Bindungsspezifität von jedem Rapport (1A) bestimmt. Der Code für die RNA – Basenerkennungs der PUF repeat ist überraschend einfach (Figur 1A), so dass für die Erzeugung von PUF – Domänen , die jeden möglichen 8-Basen – Kombination erkennen (rezensiert von Wei und Wang 15).
Dieses Baukastenprinzip ermöglicht die Erzeugung eines Engineered Splicing Factor (ESF), die aus einer angepassten PUF – Domäne und einer Spleiß – Modulations Domäne (also eine SR – Domäne oder eine Gly-reichen Domäne) besteht. Diese ESFs funktionieren kann entweder als Splicing Aktivatoren oder als Inhibitoren auf verschiedene Arten von Spleißereignisse zu steuern, und sie haben sich bewährt , als Werkzeuge , um das Spleißen endogener Gene zu manipulieren , 16 für die menschliche Krankheit verbundenen, 17. Als Beispiel haben wir PUF-Gly-Typ-ESFs konstruiert, um speziell das Spleißen des Gens Bcl-x zu verändernDie anti-apoptotische lange Isoform (Bcl-xL) an die pro-apoptotische kurze Isoform (Bcl-x S) umzuwandeln. Eine Verschiebung des Verhältnisses der Bcl-x – Isoform war ausreichend , um mehrere Krebszellen mehr Anti-Krebs – Chemotherapie – Medikament 16, zu sensibilisieren darauf hindeutet , dass diese künstlichen Faktoren als potentielle therapeutische Reagenzien nützlich sein können.
Zusätzlich Spleißen mit bekannten Spleißen Effektordomänen zu steuern (beispielsweise eine RS oder Gly-reiche Domäne) kann die engineered PUF Faktoren auch die Aktivitäten des neuen Spleißfaktoren zu untersuchen , verwendet werden. Zum Beispiel kann bei Verwendung dieses Ansatzes haben wir gezeigt , dass die C-terminale Domäne von mehreren SR – Proteine aktivieren oder Splicing hemmen , wenn auf verschiedene prä-mRNA – Bereiche 18, dass das Alanin-reiches Motiv von RBM4 Bindung kann Splicing 19, hemmen , und dass das Prolin-reiches Motiv DAZAP1 kann 20 Spleißen verbessern, 21 </ Sup>. Diese neuen funktionellen Domänen können verwendet werden, um zusätzliche Arten von künstlichen Faktoren Feinabstimmung Spleißen zu konstruieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung für die Konstruktion und den Bau von künstlichen Spleißfaktoren, die spezifisch das alternative Spleißen eines Zielgens manipulieren kann. Diese Methode nutzt den einzigartigen RNA-Bindungsmodus von PUF wiederholt ein RNA-bindenden Gerüst mit maßgeschneiderter Spezifität herzustellen. Es kann verwendet werden, um entweder aktiviert oder Spleißen unterdrücken.
Der kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Erzeugung der neu pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH Zuschuss R01-CA158283 und NSFC gewähren 31.400.726 zu ZWYW unterstützt von dem Young Thousand Talents-Programm und die National Natural Science Foundation of China (Zuschüsse 31471235 und 81422038) finanziert wird. XY wird durch die Habilitations Science Foundation of China (2015M571612) gefördert.
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
References
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