הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים
Summary
דו"ח זה מתאר שיטת Bioengineering לתכנן ולבנות גורמי שחבור מלאכותיים רומן (ASFs) כי דווקא לווסת את השחבור של גני המטרה בתאי יונקים. שיטה זו ניתן להרחיב עוד להנדס גורמים מלאכותיים שונים כדי לתפעל היבטים אחרים של חילוף החומרים RNA.
Abstract
העיבוד של רוב RNAs איקריוטיים מתווכת על ידי RNA מחייב חלבונים (RBPs) עם תצורות מודולרי, כולל מודול הכרה RNA, אשר דווקא נקשר היעד הרנ"א הראשוני תחום מפעיל. בעבר, נקטנו היתרון של מצב מחייב רנ"א ייחודי של תחום PUF ב האנושי Pumilio 1 כדי ליצור פיגום לתכנות RNA מחייב, אשר שימש מהנדס RBPs מלאכותית שונים כדי לתפעל את חילוף החומרים RNA. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לבנות גורמי שחבור Engineered (ESFs), אשר תוכננו במיוחד כדי לווסת את השחבור החלופי של גני המטרה. הפרוטוקול כולל איך לתכנן ולבנות פיגום PUF אישית עבור מטרה RNA ספציפי, כיצד לבנות פלסמיד ביטוי ESF ידי פיוזינג תחום PUF מעצב תחום מפעיל, וכיצד להשתמש ESFs לתפעל את שחבור של גני מטרה. בתוצאות הנציג של שיטה זו, יש לנו גם תארו את המבחנים הנפוציםפעילויות ESF באמצעות כתבי שחבור, היישום של ESF בתאים אנושיים בתרבית, ואת ההשפעה הבאה של שינויי שחבור. על ידי ביצוע פרוטוקולים מפורטים בדוח זה, אפשר לעצב וליצור ESFs להסדרת סוגים שונים של שחבור חלופי (AS), מתן אסטרטגיה חדשה ללמוד תקנה שחבור והפונקציה של isoforms שחבור שונים. יתר על כן, על ידי פיוזינג תחומים פונקציונליים שונים עם תחום PUF מעוצב, חוקרים יכולים להנדס גורמים מלאכותיים כי למקד RNAs הספציפי כדי לתפעל צעדים שונים של עיבוד RNA.
Introduction
רוב הגנים האנושיים עוברים רישוי אלטרנטיבי (AS) כדי לייצר מספר איסופורמים עם פעילויות נפרדות, אשר הגדילו מאוד את המורכבות של קידוד הגנום 1 , 2 . AS מספקת מנגנון מרכזי להסדרת תפקוד הגן, והוא מוסדר בחוזקה באמצעות מסלולים מגוונים בשלבים שונים של ההתפתחות הסלולרית והתפתחותית 3 , 4 . בגלל שחילוף שגוי הוא גורם שכיח למחלות אנוש 5 , 6 , 7 , 8 , מיקוד שחבור תקנה הופך נתיב טיפולי אטרקטיבי.
על פי מודל פשוט של רגולציה שחבור, AS נשלטת בעיקר על ידי שחבור רגולטורית CIS- אלמנטים (SREs) ב מראש mRNA שפועלים כמו משפרי שיפורים או משתיקי קול של אקסונים חלופיים. תEse SREs מגייסים באופן ספציפי גורמים שונים לחילוק גורמים לחילופין ( כלומר, גורמים שחבור) המקדמים או מדכאים את התגובה לחבור 3 , 9 . רוב transact גורמים שחבור יש רצף נפרד ספציפי RNA מחייב תחומים לזהות את המטרות שלהם תחומים אפקט לשלוט שחבור. הדוגמאות המפורסמות ביותר הן בני משפחת החלבון של SRine / arginine, המכילים מוטיבות זיהוי RNA (RRM) N-Terminal RNMs, המחייבים חיבורי שחבור אקסוני ותחנות RS-Term-RS, המקדמים את אקסון הכללה 10 . לעומת זאת, hnRNP A1 נקשר לשתיקי שחיקה אקזוטיים באמצעות דומיינים של RRM ומעכב הכללת אקסון באמצעות תחום C-Termin-glycine עשיר 11 . באמצעות תצורות מודולריות כאלה, החוקרים צריכים להיות מסוגלים להנדס גורמים שחבור מלאכותי על ידי שילוב של RNA ספציפי מחייב תחום (RBD) עם effec שוניםתחומים המפעילים או מעכבים שחבור.
המפתח של עיצוב כזה הוא להשתמש RBD שמזהה מטרות נתון עם RNA לתכנות ספציפיות מחייב, אשר מקביל למצב מחייב DNA של תחום הסיפור. עם זאת, רוב הגורמים שחבור ילידים מכילים RRM או K הומולוגיה (KH) תחומים, אשר לזהות אלמנטים קצרים RNA עם זיקה חלשה ולכן חסר ניבוי RNA חלבון הכרה "קוד" 12 . RBD של חלבונים PUF חוזרים ( כלומר תחום PUF) יש מצב הכרה ייחודית RNA, המאפשר לעצב מחדש של תחומים PUF לזהות באופן ספציפי מטרות RNA שונים 13 , 14 . תחום PUF הקנוני מכיל שמונה חזרות של שלושה α-סלסלות, שכל אחת מהן מזהה בסיס בודד ביעד RNA 8-nt. שרשראות הצד של חומצות אמינו בתנוחות מסוימות של השני α- סליל טופס קשרי מימן ספציפיים עם הקצה ווטסון קריק של tהוא RNA בסיס, אשר קובע את הספציפיות RNA מחייב של כל חוזר (איור 1A). הקוד להכרת בסיס RNA של חוזרי PUF הוא פשוט להפליא (איור 1A), המאפשר את הדור של תחומי PUF שמזהים כל שילוב 8-בסיס אפשרי (נבדק על ידי ויי ו וואנג 15).
עיקרון עיצוב המודולרי מאפשר לדור של גורם שחבור Engineered (ESF) שמורכב תחום PUF ומותאם תחום אפנון שחבור (כלומר תחום SR או תחום גלאי עשירי). ESFs אלה יכול לשמש גם ממריצי שחבור או כמו מעכבים לשלוט סוגים שונים של אירועי שחבור, והם הוכיחו שימושים ככלים כדי לתפעל את השחבור של גני אנדוגניים הקשורים למחלות אנושיות 16, 17. כדוגמה, בנינו PUF-גלאי-סוג ESFs לשנות את שחבור במיוחד של הגן Bcl-x, המרת איזופורם ארוך אנטי אפופטוטיים (Bcl-XL) כדי איזופורם קצר פרו-אפופטוטיים (Bcl-XS). העברת היחס של איזופורם Bcl-x הייתה מספיק כדי לרגש תאי מספר סרטן לתרופות כימותרפיות אנטי-סרטני מרובות 16, דבר המצביע על כך גורמים המלאכותיים אלה עשויים להיות שימושיים כמו ריאגנטים טיפולי פוטנציאל.
בנוסף לשליטת שחבור עם תחומי מפעיל שחבור ידועים (למשל, תחום RS או גלאי עשירי), גורמי PUF המהונדסים יכולים לשמש גם כדי לבחון את פעילות גורמי שחבור חדשים. לדוגמא, באמצעות גישה זו, אנו הוכחנו כי תחום C- מסוף של חלבונים כמה SR יכול להפעיל או לעכב שחבור כאשר מחייבים לאזורים תעתיקי רנ"א ראשוני שונים 18, כי המוטיב עשיר-אלנין של RBM4 יכול לעכב שחבור 19, וכי מוטיב עשיר פרולין של DAZAP1 יכול לשפר שחבור 20, 21 </ Sup>. תחומים פונקציונליים חדשים אלה יכולים לשמש לבניית סוגים נוספים של גורמים מלאכותיים שחבור לכוונן.
Protocol
Representative Results
Discussion
דוח זה מספק תיאור מפורט לתכנון ובנייה של גורמים שחבור מלאכותי שיכולים לתמרן במיוחד את השחזור האלטרנטיבי של הגן היעד. שיטה זו מנצלת את מצב מחייב RNA ייחודי של PUF חוזר לייצר RNA מחייב פיגום עם סגוליות אישית. זה יכול לשמש או להפעיל או לדכא שחבור.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01-CA158283 ו NSFC מענק 31400726 ל ZWYW ממומן על ידי תוכנית הכשרונות צעירים אלף הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מעניקה 31471235 ו 81422038). XY ממומן על ידי קרן המדע הפוסט-דוקטורט של סין (2015M571612).
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
- Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
- Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
- Wang, G. -. S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
- Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
- Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
- Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -. C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
- Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
- Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
- Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
- Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
- Wang, Y., Cheong, C. -. G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
- Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
- Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
- McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
- Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
- Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
- Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
- Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
- Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
- Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
- He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732 (2009).
- Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
- Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).
- David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
- Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
- Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
- Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).
