Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l'alternanza di splicing nelle cellule umane
Summary
Questa relazione descrive un metodo bioingegneria per progettare e costruire nuovi fattori artificiali splicing (ASF) che specificamente modulano la giunzione di geni bersaglio in cellule di mammifero. Questo metodo può essere ulteriormente ampliata per progettare vari fattori artificiali di manipolare altri aspetti del metabolismo dell'RNA.
Abstract
Il trattamento della maggior parte RNA eucariotici è mediata da RNA Binding Proteins (RBPs) con configurazioni modulari, tra cui un modulo di riconoscimento di RNA, che si lega specificamente al bersaglio pre-mRNA e un dominio effettore. In precedenza, abbiamo preso vantaggio della modalità di legame dell'RNA unica del dominio PUF in pumilio umano 1 per generare un ponteggio programmabile vincolante RNA, che è stato utilizzato per progettare vari RBPs artificiali per manipolare il metabolismo dell'RNA. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per costruire fattori di splicing Engineered (ESFS) che sono specificamente progettati per modulare lo splicing alternativo di geni bersaglio. Il protocollo comprende come progettare e costruire un ponteggio PUF personalizzato per uno specifico bersaglio RNA, come costruire un plasmide di espressione FSE fondendo un designer dominio PUF e un dominio effettore, e come utilizzare ESFS per manipolare lo splicing di geni bersaglio. Nei risultati rappresentativi di questo metodo, abbiamo anche descritto i saggi comuniDelle attività di ESF che utilizzano reporter di splicing, l'applicazione di ESF nelle cellule umane colte e l'effetto successivo di cambiamenti di splicing. Seguendo i protocolli dettagliati in questa relazione, è possibile progettare e generare ESF per la regolazione di diversi tipi di Splicing Alternativo (AS), fornendo una nuova strategia per studiare la regolazione di splicing e la funzione di diverse isoforme di splicing. Inoltre, fondendo diversi domini funzionali con un dominio PUF progettato, i ricercatori possono progettare fattori artificiali che mirano a specificare gli RNA per manipolare varie fasi di elaborazione RNA.
Introduction
La maggior parte dei geni umani subiscono splicing alternativo (AS) per produrre molteplici isoforme con attività distinte, che ha notevolmente aumentato la complessità di codifica del genoma 1, 2. AS fornisce un meccanismo importante per regolare la funzione del gene, ed è strettamente regolata attraverso percorsi diversi in diverse fasi cellulari e dello sviluppo 3, 4. Perché splicing misregulation è una comune causa di malattie umane 5, 6, 7, 8, il targeting regolamentazione splicing sta diventando un percorso terapeutico attraente.
Secondo un modello semplificato di regolazione di splicing, AS è controllata principalmente mediante splicing Regulatory cis -Elementi (SRE) in pre-mRNA che funziona come enhancers splicing o silenziatori di esoni alternativi. thEse SRE specificamente reclutano vari fattori proteici trans- attivi ( cioè fattori di splicing) che promuovono o sopprimono la reazione di splicing 3 , 9 . La maggior parte dei fattori di splicing trans- attivi dispongono di domini specifici di sequenza RNA specifici di sequenza per riconoscere i loro obiettivi e domini effettivi per controllare la splicing. Gli esempi più noti sono i membri della famiglia di proteine ricca di serina / arginina (SR) che contengono N-terminali RNA Recognition Motifs (RRMs) che legano gli enzimi di splicing esoni e domini RS-terminali RS che promuovono l'inclusione di esone 10 . Al contrario, hnRNP A1 si lega ai silenziatori esogeni di splicing attraverso i domini RRM e inibisce l'inclusione di esone attraverso un dominio C-terminale ricco di glicina 11 . Utilizzando tali configurazioni modulari, i ricercatori dovrebbero essere in grado di progettare fattori di splicing artificiali combinando un determinato dominio RNA-binding (RBD) con differenti effecDomini che attivano o inibiscono lo splicing.
La chiave di un tale progetto è quella di utilizzare un RBD che riconosca determinati target con specificità di legame di RNA programmabile, che è analogo al modo di legame del DNA del dominio TALE. Tuttavia, la maggior parte dei fattori naturali di splicing contengono domini RRM o K Homology (KH), che riconoscono elementi di RNA corti con debole affinità e quindi non dispongono di un "codice" di riconoscimento di proteine RNA predittivo 12 . Il RBD delle proteine di ripetizione PUF ( ovvero il dominio PUF) ha una modalità di riconoscimento RNA unico, consentendo la ridefinizione dei domini PUF per riconoscere in modo specifico diversi target RNA 13 , 14 . Il dominio PUF canonico contiene otto ripetizioni di tre α-eliche, ciascuno riconoscendo una singola base in un target RNA a 8 nt. Le catene laterali di amminoacidi in determinate posizioni della seconda elica a forma di legami idrogeno specifici con il bordo di Watson-CrickBase RNA, che determina la specificità di binding di RNA di ogni ripetizione ( Figura 1A ). Il codice per il riconoscimento base di RNA della ripetizione del PUF è sorprendentemente semplice ( Figura 1A ), consentendo la generazione di domini PUF che riconoscono qualsiasi possibile combinazione di 8 basi (riesaminate da Wei e Wang 15 ).
Questo principio di progettazione modulare consente la generazione di un Fattore di Splicing Engineered (ESF) costituito da un dominio PUF personalizzato e da un dominio di modulazione di splicing ( cioè un dominio SR o un dominio ricco di Gly). Questi ESF possono funzionare come attivatori di splicing o come inibitori per controllare vari tipi di eventi di splicing e si sono dimostrati utili come strumenti per manipolare la splicing di geni endogeni legati alla malattia umana 16 , 17 . Ad esempio, abbiamo costruito ESF di tipo PUF-Gly per alterare in modo specifico la splicing del gene Bcl-x, Convertendo la lunga isoforma anti-apoptotica (Bcl-xL) per il pro-apoptotica breve isoforma (Bcl-XS). Spostando il rapporto tra la Bcl-x isoforma era sufficiente per sensibilizzare varie cellule tumorali a più farmaci chemioterapici anti-cancro 16, suggerendo che questi fattori artificiali possono essere utili come potenziali reagenti terapeutici.
Oltre a controllare splicing con noti domini effettori splicing (ad esempio, un RS o Gly-ricca dominio), i fattori ingegnerizzati PUF possono anche essere utilizzati per esaminare le attività dei nuovi fattori di splicing. Ad esempio, utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato che il dominio C-terminale di diverse proteine SR può attivare o inibire splicing quando associa alle regioni differenti 18 pre-mRNA, che il motivo ricco-alanina di RBM4 può inibire splicing 19, e che il motivo ricco di prolina di DAZAP1 può migliorare splicing 20, 21 </ Sup>. Questi nuovi domini funzionali possono essere usati per costruire altri tipi di fattori artificiali per perfezionare splicing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo rapporto fornisce una descrizione dettagliata per la progettazione e la costruzione di fattori di splicing artificiali che possono specificatamente manipolare splicing alternativo di un gene bersaglio. Questo metodo sfrutta la modalità di legame dell'RNA unico PUF ripete per produrre un ponteggio RNA-binding con specificità personalizzato. Può essere utilizzato per attivare o reprimere splicing.
Il passaggio critico in questo protocollo è la generazione del dominio PUF reprogr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NIH concedere R01-CA158283 e NSFC concedere 31.400.726 di ZWYW è finanziato dal programma Talents Giovani Mille e la National Science Foundation naturali della Cina (borse di studio 31471235 e 81422038). XY è finanziato dalla fondazione post-dottorato di scienza della Cina (2015M571612).
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
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