Generering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler fra Whole Blood
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
Dendrittiske celler (DCS) er de viktigste spesialiserte antigenpresenterende celler i immunforsvaret vårt. Umodne DC (IDCS) bor i huden eller i slimhinnene vev og er derfor blant de første immunceller til å samhandle med invaderende patogener. DC representerer bro mellom det medfødte og det adaptive immunsystemet 1, siden de kan aktivere T- og B-celle responser etter deteksjon av patogen. Videre bidrar de til pro-inflammatoriske immunrespons på grunn av sekresjon av høye mengder av cytokiner, slik som IL-1β, IL-6 og IL-12. DCs aktiverer også NK-celler og tiltrekke seg andre immunceller til stedet for infeksjon av chemotaxis.
DC kan deles inn i umodne dendrittceller (IDCS) og modne dendrittiske celler (mDCs) 2 basert på deres morfologi og funksjon. Etter erkjennelsen av fremmede antigener ved en av de mange mønstergjenkjenning reseptorer (f.eks toll-like reseptorene, C-typelektiner, reseptorer eller komplement) rikelig uttrykt på celleoverflaten, IDCS gjennomgå store forandringer og begynner å modnes. Under denne modningsprosess, er reseptorer for antigenerobring nedregulert, mens molekyler avgjørende for antigen presentasjon er oppregulert tre. Moden DCs up-regulere vevstypeantigen I og II (MHC I og II), co-stimulerende molekyler som CD80 og CD86, som er avgjørende for antigen presentasjon og aktivering av T-lymfocytter. I tillegg er ekspresjonen av kjemokinreseptoren CCR7 på celleoverflaten induseres, som muliggjør vandring av DC fra perifere vev til lymfeknutene. Migrasjonen er tilrettelagt av å "rulle" av DCs langs en chemokin ligand 19 (CCL19 / MIP-3b) og chemokin ligand 21 (CCL21 / SLC) gradient til lymfeknuter 4-6.
Etter migrasjon, mDCs presentere behandlet antigen til naive CD4 + og CD8 + T-celler, og dermed iniforhandle en adaptiv immunrespons mot invaderende patogen 7. Denne interaksjonen med T-celler i lymfeknutene er også forbundet med spredningen av viruset 8. Andre in vitro studier viste at DC effektivt fange og overføre HIV til T-celler, og at denne overføringen resulterer i en kraftig infeksjon 9-12. Disse eksperimentene markere at in vivo HIV utnytter DC som skyttelbussene fra periferien til lymfeknutene. Under antigen presentasjon, DCs utsondre nøkkel interleukiner som former differensiering av effektor T-hjelpeceller, og derfor er utfallet av hele immunrespons mot mikroben fastsatt i dette samspillet. Bortsett fra type 1 (Th1) og type 2 (Th2) effektor T-celler, andre undergrupper av CD4 + T-hjelpeceller (f.eks, type 17 (Th17) og type 22 (Th22) T-celler) har blitt beskrevet, og deres induksjon og funksjonen har blitt grundig undersøkt. DC er dessuten involvert igenerering av regulatoriske T-celler (tregs) 13,14. Disse cellene er immunundertrykkende og kan stoppe eller ned-regulere induksjon eller proliferasjon av effektor-T-celler og er således avgjørende for utvikling av immunitet og toleranse.
Menneskekonvensjonelle DC (CDC) omfatter flere undergrupper av celler med en myeloid opprinnelse (dvs. Langerhans-celler (LCS) og dermal og interstitiell DCs) eller en lymfoid opprinnelse (dvs. plasmacytoid DC (PDCs)). For in vitro eksperimenter eller DC vaksinasjonsstrategier, er moncyttavledede DC rutinemessig brukt som modell for dermal DC. Disse cellene viser likheter i fysiologi, morfologi, og funksjonen til vanlige myeloide dendrittiske celler. De er dannet ved tilsetning av interleukin 4 (IL-4) og granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) til monocytter ble isolert fra friske donorer 12,15-18. Dendrittiske celler kan også bli direkte isolert fra dermal eller slimhinne biopsier, eller kan til og med be utviklet seg fra CD34 + hematopoetiske stamceller isolert fra navlestreng blodprøver innhentet ex utero. Her viser vi hvordan monocytter blir isolert og stimulert fra anti-koagulert humant blod etter perifert blod mononukleære celler (PBMC) anrikning av tetthetsgradient-sentrifugering. Etter inkubasjon i 5 dager, humane monocytter under spesielle forhold er differensiert i IDCS og er klar for eksperimentelle prosedyrer i en ikke-klinisk setting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver dannelsen av monocytt-avledede dendrittceller (MDDCs) gjennom isoleringen av humane monocytter fra antikoagulert blod ved hjelp av et magnetisk nanopartikkel-baserte analysen. I denne protokollen blir sentrifugeringstrinn utføres oppstrøms cellen isolasjonsprosedyren, noe som fører til en anrikning av PBMC fraksjon. Selv om celler er mistet under sentrifugeringen, for å overlappe innholdet i en hel blod pakke ved densitetsgradient medium ville kreve 200-300 ml av densitetsgradient medium …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
