Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בשנת 1998, אש מלו דיווחו כי RNA פעמיים תקועים (dsRNA) יכול לגרום עיכוב של פונקציה גנים elegans Caenorhabditis 1. תגובה זו מופעלת על ידי dsRNA נקראה התערבות RNA (RNAi), ו להשתקת גנים RNAi בתיווך כזה נמסר ישומרו ב בעלי חיים, צמחים, ופטריות 2-7. בצמחים וכמה חיות, פונקציות RNAi מערכתית, כלומר ההשפעה יכולה להתפשט תאים / רקמות אחרות שבהן dsRNA לא הציג באופן ישיר (הנסקרת ב 8-10). מדענים עשו שימוש בתגובה RNAi הסלולר אנדוגני זאת על ידי תכנון dsRNAs למקד את הגנים של עניין, ובכך דריסה תפקוד הגן ללא מניפולציה של הגנום ישירות (הנסקרת ב 11-14).

RNAi הוא כלי רב עצמה עבור מחקרים תפקודיים בשל היתרונות הבאים. ראשית, אפילו עם מידע רצף הגן מינימלי, גן יכול להיות ממוקד באמצעות RNAi. זה חשוב במיוחד עבור studies של אורגניזמים שאינם מודל חסר הנתונים הגנומי או transcriptomic. שנית, באורגניזמים שבו תגובת RNAi היא מערכתית וחסון, מציאת גן בתיווך RNAi ניתן לבצע כמעט בכל שלב התפתחותי. תכונה זו שימושית מאוד ללימוד הפונקציה של גני pleiotropic. שלישית, במקרים מסוימים, תופעות RNAi להתפשט אל בלוטות המין וצאצאים, כך פנוטיפים הם נצפו בצאצאים 15,16. תופעה זו, המכונית RNAi ההורי (pRNAi), יש יתרון במיוחד עבור גני ההשפיע התפתחות עוברית, כמו צאצאים רבים המיוצרים על ידי הורה מוזרק אחת יכולים להיבחן ללא מניפולציה ישירה של ביצים. מסיבות אלה, pRNAi היא השיטה של ​​בחירה. עם זאת, אם pRNAi אינו יעיל, למשל עבור הגנים הדרושים oogenesis, אז העוברי RNAi (eRNAi) חייב לשמש. הרביעית, RNAi יכול לשמש כדי ליצור את המקבילה של סדרת אללים ב שכמות dsRNA לגידולים יכולות להיות מגוונות על פני טווח לייצר חלש לפגמים חזקים. כזה הדרגתיות של פנוטיפים יכולה להיות מועילה להבנת תפקוד גן כאשר הגן מעורב תהליך מורכב ו / או אובדן מוחלט של פונקציה הוא קטלני. חמישי, מסירת dsRNA קלה בדרך כלל ריאלית, במיוחד בחיות מראות תגובות RNAi מערכתיות חזקות. dsRNA יכול להיות מוצג על ידי microinjection 1,5, האכלה / בליעה 17,18, השריה, 19,20 ו וירוס / מסירה בתיווך חיידקים 21,22. השישית, בניגוד לשיטות מיקוד / עריכה כמה גן, אין צורך למסך אורגניזמים נושא את המוטציה או לבצע צלבים גנטיים לייצר הומוזיגוטים בעת שימוש RNAi. לכן, לעומת טכניקות רבות אחרות לחקר תפקוד גן, RNAi הוא מהיר, זול, והוא יכול להיות מיושם על מסכים גדול בקנה מידה 23-25.

השירות הרחב של RNAi מספק אמצעים לבצע מחקרים פונקציונליים במגוון רחב של אורגניזמים, הרחבת סל מינים לרשותנו בעבודה beyonד מערכות המודל המסורתי עבורו פותחו כלים גנטיים. לדוגמא, מחקרים באמצעות מערכות שאינם מודל נדרשים לתת תובנה על האבולוציה של גני רשתות גנים ידי השוואת הפונקציות של orthologs ממינים המייצגות מצבי פיתוח שונים או מפגין תכונות מורפולוגיות ברורות 26-29. אלו סוגים של מחקרים יספקו הבנה טובה יותר של מגוון ביולוגי, עם שפעות הוא למחקר יישומים ובסיסי.

להיות קבוצת החיה הגדולה ביותר בכדור הארץ, חרקים מספקים הזדמנות מצוינת לחקור את המנגנונים מגוונים בסיסית. בנוסף, החרקים קטנים בדרך כלל, יש מחזור חיים קצר, פוריות גבוהה, והם קלים אחוריים במעבדה. בשני העשורים האחרונים, RNAi יושם בהצלחה חרקים פורש הזמנות, כולל Diptera (זבובים נכון) 5, פרפראים (פרפרים ועשים) 30, Coleoptera (חיפושיות) 16,31, דבוראים (sawfשקרים, צרעות, נמלים ודבורים) 32, פשפשאים (באגים נכון), Isoptera (טרמיטים) 34, Blattodea (ג'וקים) 35, חגבאים (צרצרים, חגבים, ארבה, ו katydids) 36 ו Phthiraptera (כינים) 37. יישום מוצלח של RNAi ספק נתונים תפקודיים ללימודים של דפוסים ב העובר מוקדם (posterior-קדמי ציר 32, ציר-גחון הגבה 28, פילוח 26,38), קביעת הזוויג 39,40, כיטין / לציפורן ביוסינתזה 41, ecdysone איתות 42, התנהגות חברתית 43, ועוד. שיטות RNAi שפותחו עבור מיני חרקים שונים עשויות להועיל נוסף כי הם צפויים להיות שימושיים עבור דברה (הנסקרת ב 44-46). תופעות RNAi תהיינה גן ספציפי כמו גם מינים ספציפיים, כל עוד אזורים שאינם שמורה נבחרים למיקוד. עבור מינים של חרקים מועילים כמו דבורי דבש תולעי משי, מיקוד גנים חיוניים להישרדותו שלוירוסים או טפילים לשלוט הזיהום עלול לספק אסטרטגיה חדשנית להגן על מינים אלה 47,48.

Dermestes maculatus (ד maculatus), חיפושית להסתיר השם הנפוץ, מופץ ברחבי העולם למעט אנטארקטיקה. כמו חרק holometabolous, מחזור חי ד maculatus כולל עוברי, זחל, גלמים, ושלבי מבוגר (איור 1). כי זה נזון בשר, ד maculatus משמש במוזיאונים כדי skeletonize חיות מתות חוקרי חרקים משפטיים יכולים להשתמש בו כדי להעריך את זמן המוות 49,50. ד maculatus נזון מוצרים מן החי כוללים פגרים, בשר מיובש, גבינה, ואת הגלמים / פקעות של חרקים אחרים ובכך גורם לפגיעה במשקי בית, מזון מאוחסן, ואת המשי, גבינה, ותעשיות בשר 51,52. החלת RNAi ב חיפושית זו יכולה לספק דרך יעילה וידידותית לסביבה כדי למזער את ההשפעה הכלכלית שלה. המעבדה שלנו השתמשה ד maculatus כמו מ 'חדשחרק אודל ללמוד פילוח 53. בנוסף להיותו מקובל גידול במעבדה, ד maculatus הוא עניין למחקר בסיסי כמו זה הינה יזמית ביניים-נבט, מה שהופך אותו זן כדאי ללמוד את המעבר בין קצר ופיתוח-נבט ארוך.

איור 1
איור 1: מחזור החיים של ד maculatus. תצלומים של ד maculatus בשלבים שונים בחיים, כפי שצוין. מחזור החיים מביצה לבוגר לוקח שלושה שבועות על 30 מעלות צלזיוס אבל כבר בטמפרטורות נמוכות. (A, F) טרי עוברים הניח הם מלבן לצהוב סגלגל בהיר, כ 1.5 מ"מ אורך. העובר לוקח ~ 55 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. (B, C ו- G) זחלים יש פסי פיגמנט כהים מכוסים setae. הזחלים לעבור instars מספר בהתאם לסביבה ואורכם יכול להימשך עד מעל 1 ס"מ. (D, H) (E, I) זמן קצר לאחר eclosion, פיגמנטציה כהה מופיעה מעל גוף החיפושית המבוגרת. מבוגרים יכולים לחיות עד מספר חודשים ונקבה אפשר לגולל מאות עוברים במהלך חייה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בעבר, הראינו כי RNAi יעיל דריסת תפקוד גן ב ד maculatus 53. הנה הניסיון שלנו לגדל מושבות ד maculatus במעבדה משותף יחד עם צעד-אחר-צעד פרוטוקולים הן עובריים והורית RNAi הגדרת, זריקה, טיפול לאחר ההזרקה, וניתוח פנוטיפי. מציאת גן dsRNA בתיווך ושיטות ניתוח הציגו כאן לא רק לספק מידע מפורט לטיפול שאלות ב ד maculatus, אבל יש גם משמעות פוטנציאל FOr החלת RNAi ב חיפושית שאינם מודל אחר / מיני חרקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. גידול של ד maculatus

הערה: מושבת רבייה של ד maculatus הוקמה ב 'מעבדת המחברים באמצעות מבוגרים וזחלים לרכוש מסחרי. זהויות המינים אומתו באמצעות barcoding DNA 53.

  1. כדי להגדיר כלוב חדש במעבדה, מורחים עליו שכבה דקה של שבבי עץ לכלוב חרק בגודל בינוני (30.5 x 19 x 20.3 ס"מ 3). מניחים נתח ~ 10 x 6 x 3 ס"מ 3 של קלקר בכלוב לתת להסתיר הזחלים עבור התגלמות. להוסיף 20 - 50 חיפושיות (או מבוגרים או זחלי instar מאוחר). חיפושיות תסתרנה את שבבי העץ.
  2. הוספת מזון חתולים רטוב בצלחת פטרי או סירה במשקל. מכסים את הכלוב עם בד רשת ומניחים הכלוב באינקובטור.
  3. לשמירה על מושבת גידול במעבדה, לקבוע את הטמפרטורה בין 25 ל -30 מעלות צלזיוס. ד maculatus גדל מהר בטמפרטורות גבוהות, אבל זה גם מקדם את הצמיחה של פטריות קרדית. כדי לשמור על לרפאהמושבה עמך, להשתמש 25 - 28 מעלות צלזיוס במשך תחזוקה מלאי קבועה ו -30 מעלות צלזיוס במשך הרחבת המושבה במהירות. מחזור החיים לוקח כשלושה שבועות עד ארבעה חודשים בהתאם לגורמים סביבתיים 50 (איור 2).

איור 2
איור 2: ד maculatus מעבדת מושבה. תצלום של כלוב חרקים טיפוסי ד maculatus מוצג. שבבי עץ מפוזרים לתת החיפושיות להסתיר. מזון חתול מתווסף בצלחת קטנה פטרי או סירה במשקל. קלקר מושם לתוך הכלוב כמקלט זחלי instar סופיים pupate. הכלוב המוצג כאן הוא 30.5 x 19 x 20.3 ס"מ 3 ובתים כמה מאות זחלים, גלמים, ומבוגרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. אֲפָרve ביצים בכלוב להבשיל. כדי להרחיב את המושבה, להקים כלובי חדש עם ביצים (נאספו, כפי שמתואר בסעיף 2), זחלים, או מבוגרים, כנ"ל. ד maculatus להטיל ביצים לאורך כל הכלוב, במיוחד ליד מקור מזון.
  2. חלף מזון חתולים רטוב בערך פעמים בשבוע.
    הערה: בשל ריח לא נעים של מזון חתולים רטוב, מקורות מזון חלופיים נבדקו גם (ראה דיון).

אוסף העובר 2.

  1. כדי להגדיר אוסף, להפריד לפחות 50 גברים ו -50 נשים מהמושבה. צעירים הם הטובים ביותר. מבוגרים מקום בכלוב בגודל מיני (17.8 x 10.2 x 12.7 ס"מ 3) ללא שבבי עץ. הוספת מזון חתולים בסירה במשקל.
  2. לפני תחילת איסוף, לבדוק את הכלוב בזהירות לכל עוברים נוכחיים ולהסיר אותם. שים כדור צמר גפן נמתח אל תוך הכלוב, ולהשאיר את הכלוב C חממה 30 °. לאחר תום חלון הזמן המתאים, את כדור צמר גפן יהיה מוכן לאיסוף עובר.
  3. לְקַפֵּלפיסת נייר הבנייה שחור (גודל A4) בחצי ליצור קמט, ולאחר מכן להתפתח.
  4. הסר את הכדור כותנה נמתח מהכלוב. סור מבוגרים מכדור הכותנה ולשים אותם בחזרה אל תוך הכלוב.
  5. בעוד צובט את כדור צמר גפן נמתח בעדין מאוד, קורע אותו לגזרים לאט לתוך סיבי כותנה דקים לתת את הביצים לנפול על הנייר השחור.
    הערה: עוברים ד maculatus שבירים וקשה לראות בכותנה. הם ניתן לכתוש בקלות אם מחזיקים את כדור הכותנה חזקה מדי.

3. הכנת dsRNA

  1. הכנת תבנית ה- DNA סינתזת dsRNA
    1. הפעל 4 - 6 50 μl PCR תגובות באמצעות פריימרים המכילים רצפי אמרגן T7 ב 5 שני 'קצוות כדי להגביר תבנית ה- DNA על פי הפרוטוקול של היצרן.
    2. לטהר מוצר PCR באמצעות ערכת טיהור מסחרית PCR, בעקבות הוראות היצרן. הריכוז הסופי האידיאלי של תבנית ה- DNA הוא ≥100 ng / μl.
  2. הכנת מאגר הזרקה
    1. הכן 100 מ"ל של חיץ הזרקה (0.1 מ"מ לאא 2 4 PO, 5 מ"מ KCl). התאם ל- pH 6.8 עם 5 M NaOH.
    2. aliquots חנות ב -20 ° C.
  3. סינתזת dsRNA
    1. הגדרת התגובה בצינור 0.2 מ"ל PCR על הקרח לבצע בתגובה שעתוק במבחנה עם פולימראז T7, בעקבות הוראות היצרן, תוך שימוש ~ 500 תבנית ng לכל תגובה.
    2. דגירת הצינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. לעכל את תבנית ה- DNA עם DNase, בעקבות הוראות היצרן.
    4. מחמם את הצינור כדי 94 מעלות צלזיוס והחזקה ב 94 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
    5. כדי לחשל dsRNA, לאט לקרר את הצינור ב -1 ° C / min עד שהוא מגיע 45 מעלות צלזיוס לאחר 1 שעה.
      הערה: שלבים 3.3.2 דרך 3.3.5 יכול להתבצע ב thermocycler.
    6. אתנול משקע של dsRNA, להוסיף 280 μlמים חינם RNase עד 20 μl של התגובה להתאים לנפח סופי של 300 μl. הוסף 30 μl של 3 M NaOAc (pH 5.2) ו 650 μl של אתנול. מניחים צינור במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    7. לאחר centrifuging ב 15,682 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C, לשטוף את הכדור dsRNA עם 70% אתנול. גלולה יבשה להתמוסס 20 μl חיץ הזרקה.
    8. למדוד את הריכוז של dsRNA באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260. הריכוז האידיאלי הוא 3 - 5 מיקרוגרם / μl. בדוק את איכות על ידי הפעלת 5 μl של 1:25 דילול של dsRNA על ג'ל agarose 1% ב 90 V למשך 30 דקות. להקה אחת של גודל צפוי תהיה גלויה בקלות.
    9. אחסן את dsRNA ב -20 ° C או קר.
      הערה: עבור כל ניסוי RNAi מציאה, לכלול שליטה dsRNA, אשר לא צפוי להשפיע על תהליך הנלמד. GFP dsRNA הוא פקד מעולה עבור רוב הניסויים. הכן ולהזריק את dsRNA מלא Side-by-side עם experimeפתיחות opening סגירות closures dsRNA.

4. האסיפה של microinjector ו Micromanipulator

הערה: ראה איור 3.

  1. חבר חנקן או אספקת אוויר שנייה לכניסת הלחץ של מכשיר משאבת פנאומטי. אם משאבה פנאומטי אינה זמינה, להפעיל לחץ באמצעות מזרק 50 מ"ל מחובר צינורות בסדר.
  2. חבר מתג רגל למחבר מרחוק של המשאבה כדי לשלוט על זרימת לחץ שליפה.
  3. צרף בעל נימי זכוכית ליציאת לחץ השליפה של המשאבה עם צינור.
  4. תקן בעל נימים על micromanipulator קרוב מיקרוסקופ לנתח.

5. עובריים RNAi

הערה: איור 4 הראה תרשים זרימה של ד maculatus העוברי RNAi.

  1. הכנת eRNAi
    1. הכן לעובר איסוף מכסת צלחת פטרי (90 מ"מ קוטר). מניחים פיסת נייר פילטר שחור געל החלק הפנימי של המכסה. שים שקופיות מיקרוסקופ רגילות על הנייר השחור.
    2. לדלל dsRNA לריכוז המתאים עם חיץ ההזרקה. השתמש 2 - 3 מיקרוגרם / μl עבור ניסויים ראשוניים. תמיד לשמור dsRNA על קרח לפני ההזרקה.
    3. להוסיף צבע מאכל בשעה 1:40 דילול אל dsRNA ו פיפטה בעדינות כמה פעמים כדי לערבב היטב.
  2. עובר איסוף עבור הזרקה
    הערה: בגיל 25 מעלות צלזיוס, גרעינים בעוברים 6 - 8 שעות לאחר ההטלה (AEL) נודדים לעבר הביצית בפריפריה 53. Blastoderm הסלולר מוקם בתוך 8 - 10 שעות AEL 53. כדי להבטיח עובר לפני שלב blastoderm הסלולר משמש להזרקה, 3 - 0 hr עובר AEL מומלץ לשימוש 53. אוסף עובר, הכנה, ואת הזריקה בדרך כלל לוקחים פחות מ 2 שעות אם נימי הזכוכית הן בכושר טוב. לכן, כל התהליך יכול להסתיים בתוך 5 שעות AEL.
    1. איסוף עוברים כמתואר בשלבים 2.2-2.5.
    2. קש על נייר הבנייה השחור להעביר עובר לתוך איסוף מכסת צלחת פטרי.
    3. סטיק דבק דו צדדי לאורך הקצה של השקופית.
    4. בעזרת מברשת צבע, ליישר את העוברים בקלטת בניצב קצה שקופיות עם הקדמי או האחורי סוף בקצה. ראוי לציין, כי הקצוות הקדמיים ואת אחוריים של עוברים מוקדם אינם שונים בקלות, ובכך על חצי ממוצע יהיה להזריק בקצה האחורי שהוא אידיאלי.
  3. טעינת dsRNA לתוך זכוכית נימי
    1. קח את 2 - 4 μl של dsRNA לתוך קצה פיפטה microloader 20 μl.
    2. הכנס את הקצה לתוך נימי זכוכית טרום שלף (המכונה מחט) בעדינות פיפטה פתרון dsRNA לתוך הנימים. כן מחטים מן הנימים מסחריים זכוכית באמצעות חולץ micropipette. דוגמא מחט משך אידיאלית מוצגת באיור 5. אורך וחידוד של מחטים ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה afניסויי הזרקת ter.
    3. תקן את נימי זכוכית לתוך מחזיק נימי זכוכית.
    4. הרכב את בעל נימים לתוך micromanipulator.
  4. הזרקת dsRNA לעוברים
    1. להעביר בזהירות את השקף עם עוברים על הבמה של מיקרוסקופ לנתח.
    2. להעביר את השקף להביא עובר אחד למרכז של המיקרוסקופ השדה ומיקוד.
    3. מקם את הקצה של הנימים עם micromanipulator תוך מבט לתוך מיקרוסקופ לנתח. תביא את הקצה הקרוב לסוף של העובר הראשון בשורה.
    4. הפעל את החנקן או אספקת אוויר אחרת.
    5. הזיזו את המתג בורר קלט סולנואיד כדי ואקום.
    6. התאם את ווסת לחץ הפליטה כדי 10 - 15 psi. התאם את הלחץ בהתאם למנגנון.
    7. פתח את נימי במידת הצורך. לאחר הקצה פתוח, פתרון dsRNA בצבע ימלא הקצה.
    8. להזיז את קצה הנימים קדימה לנקב את הדוארmbryo. אם הגדרת הלחץ היא אידיאלית, לא נוזל עוברי יזרום לתוך הנימים.
    9. לדרוך על מתג הרגל להוציא פתרון dsRNA לתוך העובר עד סכום של פתרון הולם הוא נפלט. איור 5 מציג דוגמאות של מורפולוגיה העובר אחרי כמויות מתאימות והלא ראויה של פתרון כבר מוזרק.
    10. לשמור על קצה הנימים בתוך העובר ~ 2 שניות, ולאחר מכן מסיר אותו.
    11. הזז את הנימים לעובר הבא וחזור על שלבי 5.4.8 - 5.4.10 עד שכל העוברים מוזרקים. שנת נימי זכוכית אם הוא מקבל סתומים או הפסקות.
  5. שחזור ו דגירה לאחר הזרקה
    1. לאחר ההזרקה, במקום להחליק בצלחת פטרי.
    2. הוספת כדור צמר גפן רטוב כדי בצלחת פטרי. אל תתנו את הכדור כותנה לגעת שקופיות.
    3. מכסים את צלחת פטרי ועוטפים אותו עם איטום הסרט. לייבל את המנה עם השם של dsRNA, ריכוז, תאריך, שעה, ומספר מוזרקעוברי.
    4. מניחים את צלחת פטרי C חממה 30 ° עד הפתח עוברים.

6. RNAi הורים

  1. בידוד גלמים עבור pRNAi
    1. אסוף גלמים מהמושבה.
    2. מיין זכר וגלמים נשיים תחת מיקרוסקופ (ראה איור 6). שמור אותם בשתי מנות נפרדות פטרי C חממת 30 °, כדי לוודא ששום הזדווגות מתרחשת לפני הזריקה.
    3. בדוק בכל יום למבוגרים eclosed. התגלמות בדרך כלל לוקח 5 - 7 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.
    4. העברת eclosed זכרים ונקבות (ראו איור 6) לשתי צלחות פטרי נפרדות ולהאכיל אותם מזון חתולים בכל יום אחר עד שהם מוכנים להזרקה.
    5. המשך בזריקה אחת יש מספיק נשים וגברים בגיל מתאים. נקבות 4 עד 8 ימים לאחר eclosion הם טובים ביותר. לניתוח טיפוסי, 8 - 12 נקבות משמשות. מספר שווה של גברים נדרשים לצורך הזדווגות 54.
    הזרקת לתוך dsRNA נקבה בטן
    1. כן dsRNA על קרח (5.1.2 ו 5.1.3).
    2. צרף מחט 32-מד מזרק 10 μl.
    3. לטשטש נקבות על במת 2 CO.
    4. טען פתרון dsRNA לתוך מזרק ללא תופס את כל האוויר.
    5. יש לאחוז את צד נשי גחון עד ביד אחת להחזיק את המזרק עם אחרים.
    6. בעדינות לחדור segmacoria (ממברנה) בין sternites 2 ו -3 עם קצה המחט. איור 7 מראה נשי במהלך ההזרקה. אם המחט לא לחדור את הרקמה בקלות, זווית המחט כלפי מעלה לאט ומהדקים. הכנס כ 2 מ"מ של המחט אל תוך הגוף.
    7. בדוק את היקף המזרק תוך דחיפת הבוכנה לאט, הזרקה ~ 2 μl לכל נקבה.
    8. לאחר ההזרקה, להחזיק את המחט עדיין עבור שניות לפחות 5 לפני הסרתו מן הבטן של הנקבה.
    9. מעביר את הנקבות המוזרקות אל צלחת פטרי (90 מ"מ קוטר) ולהאכיל עם מזון חתולים.
    10. לייבל צלחת פטרי עם שם dsRNA, הכמות המוזרקת, התאריך ומספר הנקבות.
  2. ההתאוששות שלאחר הזרקת הזדווגות
    1. דגירת צלחת פטרי C חממת 30 °.
    2. לאחר 24 שעות, העברת מוזרק נקבות לכלוב מיני.
    3. הוסף הכלוב מספר שווה של גברים צעירים uninjected, ולתייג את הכלוב.
    4. הוסף סירה במשקל עם מזון חתולים לתוך הכלוב.
    5. השאירו את הכלוב C חממה 30 ° לאפשר הזדווגות. לאחר 24 שעות, נקבות צריכות להתחיל להטיל ביצים ועובר ניתן לאסוף יומי או במרווחי זמן הנדרשים.

7. ניתוח פנוטיפי לאחר RNAi

הערה: על 30 מעלות צלזיוס, זה לוקח ~ 55 שעות לביצים לבקוע 50.

  1. ניתוח כדאיות eRNAi
    1. חישוב צוהר שיעור על ידי השוואת מספר הזחלים בקעו אל נו הכוללmber של עוברים מוזרקים. הקפד לכלול הזרקת שליטה שלילית כמו עוברים עלולים להיפגע או נהרגו על ידי הליך ההזרקה. שיעורי צוהר אופייניים לנוע בין 30% - 60%. היזהר זחלים בקעו לאכול ביצים שלא נולדו.
  2. ניתוח כדאיות pRNAi
    הערה: אם כדאיות נשית מושפעת הגן על הכוונת של RNAi, נקבות מוזרקות עם ספציפיים dsRNA אבל לא כביקורת שלילית dsRNA תתחיל למות. אם ייצור ביצים או הטלה מושפעת, נקבות תפגנה עקרות חלקיות או מלאות. ציון הישרדות נשית בהשוואה לקבוצת ביקורת שלילית או להשוות מספר כולל של ביצים המוטלות על ידי נקבות ניסיון ובקרה (7.2.3).
    1. הגדרת אוסף העובר לאחר שלב 2.2.
    2. לאחר 24 שעות, לאסוף עוברים ביצוע השלבים 2.4 - 2.5.
    3. לספור את המספר הכולל של העוברים.
    4. מעבירים את העוברים על צלחת פטרי 90 מ"מ. לייבל צלחת פטרי עם הגן ממוקד, תאריך אוסף, ומספר העוברים. דגירה עוברת בתוך חממת 30 מעלות צלזיוס עד שהם בוקעים. מאז להאכיל זחלים שבקעו בעוברים שלא נולדו, לבדוק את צלחת פטרי תדיר נפרד זחלים בקעו מעובר שלא נולד באמצעות מלקחיים (ראה דיון).
    5. לספור את מספר העוברים בקעו ולחשב את שיעור הצוהר.
  3. בחינת פגמים לציפורן ב בקע זחלים
    1. אסוף הזחלים בקעו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    2. במנדף קטר, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת קיבוע.
    3. השאר צינור microcentrifuge על 4 מעלות צלזיוס לפחות לילה לתת הפתרון לחדור לרקמת הזחל.
    4. כדי להמחיש, להסיר מקבע ככל מהצינור ככל האפשר.
    5. הזחלים יש לשטוף לפחות שלוש פעמים עם PBST.
    6. העברת זחלים לצלחת זכוכית רב גם עם PBST באמצעות קצה פיפטה P-1000 עם סוף לנתק להרחיבו.
    7. תחת מיקרוסקופ לנתח, למתוח זחלים באמצעות מלקחיים לבחון פגמים. אניt הוא קריטי להשתרע זחלים לבחון ליקויים כחוזה גופם מקבעים.
  4. בחינת פגמים לציפורן ב שלא נולד זחלים
    הערה: הליך זה הוא שימושי עבור בחינת פנוטיפים עובריים מוקדם, במיוחד עבור עוברים כי אינו שורד בקיעה.
    1. לקבלת pRNAi, להוסיף PBST לתוך צלחת פטרי (7.2.4) ולהעביר עובר שלא נולד כדי צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge באמצעות קצה פיפטה P-1000 עם התום מנותק. לקבלת eRNAi, להוסיף PBST לתוך צלחת פטרי (5.5.4), עוברים שלא נולדה מברשת את השקופית מיקרוסקופ ולהעבירם צינור microcentrifuge.
    2. תקן את העוברים עם פתרון קיבוע ולשטוף אותם עם PBST להדמיה ביצוע השלבים 7.3.2 - 7.3.6.
    3. בעזרת מלקחיים, לנתח עוברים מתוך קליפת הביצה תחת מיקרוסקופ לנתח ב PBST.
    4. מעבירים את העוברים חזרה 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge (~ 200 μl של עוברים בצינור אחד).
    5. סר כמו סול הרבהution ככל האפשר.
    6. הוסף 1 מ"ל של 90% לקטית חומצה / 10% EtOH. השאר את צינור צנטריפוגות C חממת 60 ° לפחות לילה.
      הערה: עוברים ניתן שמאלה 60 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.
    7. כדי לעגן את העוברים, פיפטה אותם לשקופית מיקרוסקופ באמצעות קצה פיפטה P-1000 עם התום מנותק.
    8. באופן ידני למקם את העוברים עם מלקחיים כדי אורינטציה אידיאלית.
    9. מכסים את העוברים עם תלוש כיסוי ולדמיין תחת מיקרוסקופ באמצעות דסק"ש.
  5. בחינת פגמים תאיים ומולקולריים
    הערה: הליך זה שימושי חוקר את הסיבות גורם פנוטיפים לציפורן או קטלני שאינו מלווים פגמים לציפורן.
    1. לקבלת pRNAi, עובר נפרד מן כדורי צמר גפן בשלב פיתוח מתאים ולהעביר אותם לתוך סל איסוף עובר. סל האוסף יכול להיות זהה או דומה לזה המשמש עבור אוספים העובר תסיסנית.
      1. עשהסל ביצה מבקבוקון הנצנץ פלסטיק 25 מ"ל עם החלק התחתון של הבקבוקון מוסר, חתך עיגול מתוך המכסה (בערך בקוטר 1 ס"מ). מניחים עיגול של קנס סופר רשת כ -2.5 ס"מ קוטר בתוך המכסה, ולאחר מכן להבריג את בקבוקון הנצנץ על ולהשתמש במהופך.
      2. כמו הרשת ניתן להסירו בקלות פעם עוברת נשטפות, לטבול את הרשת בצינור microcentrifuge במים לשחזר שום עוברי דבק הרשת.
    2. לקבלת eRNAi, בשלב המתאים, להוסיף PBST כדי בצלחת פטרי. מברישים את העוברים את השקופית מיקרוסקופ ולהעבירם סל איסוף העובר.
      הערה: קיבוע, כלאה באתרו, מכתים נוגדן, ופרוטוקולים מכתימים גרעיניים ניתן למצוא שיאנג et al. 2015 53.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המעבדה של המחברים השתמשה בטכנולוגית RNAi בחקר האבולוציה התפקודית של גני ויסות פילוח בחרקים 53,55. בעוד כל החרקים מפולחים, הגנים המסדירים את התהליך הזה נראה שיש לך התפצלו במהלך וקרינה חרקים 26,38,56-63. מסך גנטי תסיסנית זיהה קבוצה של תשעה גני פילוח זוג-כלל אחראים לקידום ההיווצרות של מגזרי גוף 64-70. כאן, ortholog של אחד הגנים האלה, לזווג (PRD), משמש לתעד את התועלת של RNAi לחקר תפקוד הגנים ד maculatus.

eRNAi ו pRNAi היו כל יעיל הוכחת תפקידים Dmac - PRD במבנה המגזר מין זה. 3 - 2 מיקרוגרם / μl של dsRNA שנועד למקד Dmac - PRD (8B הדמוי, 8D ו 8F GFP dsRNA, מוזרק כביקורת שלילית (איורים 8 א, 8 ג ו 8E).

בקרת הצאצאים בקעו עם פס פיגמנט אחד לכל קטע. פסי פיגמנט סמוכים היו מופרדים פער בלתי פיגמנט (איור 8 א). לאחר PRD pRNAi, צאצא מושפע בקע עם פסי פיגמנט שכנות התמזגו, גבולות מגזריים מציינים היו פגומים (האיור 8B). בהתאם לחומרת פנוטיפי, בשילובים אחד או כמה אותרו זחלים פגועים. אף על פי כן, בשילובים הופיעו באופן עקבי על אזורי הגבול בין T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, המציין זוג-שלטון דמוי פגמים. פנוטיפים לציפורן לאחר מציאת PRD הראו פסד של קטעי בטן כמו גם אורך גוף מקוצר (8D איור). Engrailed (צמוד) מכתים נוגדן בוצע על מנת לבחון פגמים מולקולריים בתחילהעובר לאחר מציאת PRD. בעוד עוברי ביקורת הראו פסים צמודים ביטוי בעצמה שווה בכל מגזר (האיור 8E), ביטוי הצמוד מופחת זוהו פסים חלופיים אצל צאצאיהם מן Dmac-PRD dsRNA מוזרק נקבות (כוכביות באיור 8F). דפוס ביטוי צמוד מופחת עולה בקנה אחד עם הדפוס לציפורן הפגום שנצפה זחלי בקעיו פגועים. לקבלת תוצאות מפורטות יותר של פנוטיפים לאחר מציאת PRD ב ד maculatus ראה שיאנג et al. 2015 53.

איור 3
איור 3: מכשירי הזרקה. תצלום של המיקרוסקופ לנתיחת micromanipulator המשמש להזרקה עוברית ד maculatus מוצג. אספקת חנקן מחוברת לשקע כניסת לחץ של משאבת פנאומטי. בעל נימי זכוכית מחובר ejecיציאת לחץ t של המשאבה. מתג רגל מחובר המשאבה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: תרשים זרימה עבור ד maculatus העוברי RNAi. (AD) איסוף עובר להזרקה. הנקבות מטילות עוברי (כתום) בכדורי צמר גפן (עיגול אפור). עובר נפרד מן כדורי צמר גפן והניחן על גבי פיסת נייר הבנייה שחורה. ברים לבנים מצביעים דמעות כדור צמר גפן. העברה עוברת אל מכסה צלחת פטרי איסוף, מרופד בנייר שחור. (E, F) הזרקת dsRNA לעוברים. יישר עוברים בשקופיות על קלטת מקל כפול ולהזריק אותם בנפרד תחת מיקרוסקופ לנתח. מחט עם צבע מאכל ירוק מוצגת. (GJ) לאחר הזרקת התאוששות incubation. מניחים כדור צמר גפן רטוב בצלחת פטרי לספק לחות. מכסים את צלחת פטרי ועוטפים אותו עם איטום הסרט (תכלת). מניחים את צלחת פטרי באינקובטור ולהסיר הזחלים בקעו לניתוח פנוטיפי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: טוב מול דוגמאות הזרקת Bad עובריים. (א) העובר uninjected. (ב) העובר מוזרק עם מעט מדי dsRNA. (ג) העובר מוזרק עם כמות מתאימה של dsRNA. (ד) העובר שבור עם תגלוש dsRNA נגרמת על ידי יתר הזרקה. צבע מאכל התווסף dsRNA לשם ויזואליזציה. (E) דוגמאות של צינורות נימי משך משמשים מחטים להזרקה. הערה אורך להתחדד טיפ fאו שתי דוגמאות של מחטים פונקציונליות. ברי סולם עבור לספירה מייצגת 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: זכר מבוגרים נקבה וגלמים. (א) להציג גחון של גולם זכר. (א ') הגדלה של האחורי חלק א (א') איור של אברי מין גולם זכר. (ב) לאור הגחון של גולם נקבה. (ב ') הגדלה של החלק האחורי של גלמים ב נקבה יש שתי גבשושיות באברי המין (לבן חיצים). (ב ') איור של אברי מין גולם נקבה. (ג) צפה גחון של גבר בוגר. (ג ') יתגדל לאור בחלק האחורי של ג שם לב מבוגרי זכר יש Trident דמוי איברי מין וכן מבנה עגול דמוי האונה על sternite ה 4 (חיצים לבנים ושחורים, בהתאמה). (ד) צפה גחון של מבוגר נקבה. (ד ') יתגדל לאור בחלק האחורי של ד עבור כל לוחות, מוטות סולם עולה 1 מ"מ. לפרטים ראה שיאנג et al. 2015 53. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: נקבה במהלך ההזרקה. נקבות מורדמות והניחו בצד עד גחון. מחט לחדור segmacoria בין 2 ו -3 sternites להזריק dsRNA מוצגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

EP-together.within-page = "1"> הספרה 8
איור 8: פנוטיפים נציג לאחר pRNAi Dmac-PRD. (א) הזרקת בקרה. נוף צדדי של צאצאי pRNAi GFP הסוג פראיים בקעו עם שלושה פרקי חזה ועשרה קטעי בטן. לכל פרק setae ופסי פיגמנט. (ב) עם נוף צדדי של צאצאי pRNAi בקעו PRD. הפער בין פסי שכנות פיגמנט שכותרתו הוא צמצם או חסר לחלוטין. (C) פנוטיפ לציפורן של עובר סוג פראי שליטה שלא נולדה. (ד) פנוטיפ לציפורן של אחד מצאצאיו pRNAi שלא נולדו PRD עם קטעי בטן פחות. (E, F) גזור germband מ: (E) בקרה, GFP pRNAi הביעה צמודה באופן שווה בכל מגזר, (F) PRD pRNAi, ביטוי הצמוד מצטמצם במגזרים חלופיים (כוכביות). לכל חלוניתls, ברי סולם עולים 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בעוד מספר קטן של מערכות מודל משוכללות (עכברים, זבובים, תולעים) פותח במהלך המאה ה -20, המאה ה -21 התאפיינה בגל של מערכות חיה חדשות שמפתח במעבדות ברחבי העולם. מערכות החדשות אלה מאפשרים מדענים לעסוק בשאלות השוואתיות, אבולוציוני כי לא יכול להיות נחקרת אך ורק באמצעות מערכות מודל "הרגילות". פריסה זו של דגמים חדשים דורשת ההתפתחות המהירה של שיטות culturing מעבדה, זיהוי גנים, וגישות תפקודיות מינים חדשים. הנה, נהלים לגידול ד maculatus במעבדה צעד-אחר-צעד פרוטוקולים RNAi עובריים, הורים RNAi, וניתוח פנוטיפי ב חיפושית זה הוצגו. המטרה היא שתיאורים אלה לעודד אחרים להשתמש ד maculatus בניסויים שלהם לעשות שימוש הגישות שהוצגו כאן לפתח מיני דגם חדשים נוספים.

בעוד ד maculatus lמושבות ab קלות מאוד לשמור, מגבלה אחת של גידול מין זה היא הריח לא הנעים של מזון החתולים הרטוב שגבה את החיפושיות כמקור מזונם. כדי למנוע זאת, מזונות חלופיים כגון אבקת חלבון מי גבינה / סויה, גבינה, מזון לכלבי קרקע, ואבקת חלב, נבדקו עם או בלי צמר גפן רטוב לשנות לחות. מזון כלבי קרקע היה האלטרנטיבה היעילה ביותר וניתן המשמש להזנת מושבה קבועה. ההישרדות הייתה מצוינת (> 90%) מביצה לבוגר בכלובים שגדלו על רק מזון כלבים יבש ב 80% לחות יחסית, עם או בלי רטובה כותנה הוסיפה. עם זאת, השלים הדיאטה הזאת עם מזון חתולים רטוב בעת איסוף ביצים להגדיל פוריות עשוי להיות נחוץ בעת איסוף מספר גדול של ביצים. אם מזון לכלבים משמש, מזון ישן צריך להיות מוסר באופן קבוע, כמו מזון כלבים מותנה נמצא לעכב הטלה 54. Kibbles מזונות כלבים (KR, תוצאות ראשוניות), שעם, עץ, נייר, וחומרים אחרים יכולים לשמש גם פליטי 71.מעניין, לפירוק הקלקר באמצעות זחלי mealworm חיפושית דווח 72. לכן, זה נבדק עבור זחלי ד maculatus. ד יאנג maculatus הזחלים שרדו עד לבגרות עם קלקר בלבד או חומרים צמר גפן רטוב המכילים אסבסט (מידע לא מוצג) אבל אם הם אוכלים ולעכל חומרים אלו עדיין לא נקבע.

דו"ח זה הוא הפרוטוקול המפורט הראשון לביצוע מחקרים גנטיים תפקודיים ד maculatus. שימוש RNAi כאן מייצג הרחבה בטכניקה זו כדי מערכת דגם חדשה. תצפיות ספציפיות כמה ראויות לציין ביחס ניסויי מציאת RNAi ב ד maculatus ומינים שאינם מודל אחרים. ראשית, כדי להבטיח כי RNAi יהיה יעיל ד maculatus, באותו זן של ד maculatus משמש כאן צריך להיות מועסק. יש ראיות מן castaneum Tribolium כי זנים שונים מראים וריאציה RNAi phenotypes 24,73, ו פנוטיפים מוטנטים לעתים קרובות להראות תלות רקע גנטי במיני מודל 74-76. כמו כן, יש ראיות אנקדוטיות על-תלות מתח פרוטוקולים אחרים, כולל הכלאה באתרה. שנית, עיתוי ההזרקה המתאים הוא קריטי עבור RNAi המוצלח ד maculatus. מעט counterintuitively, את segmacoria חודרים ביותר בקלות לאחר לציפורן יש sclerotized לחלוטין, לפחות יומיים לאחר eclosion. לכן, נקבות בתולה 4 - 8 ימים לאחר eclosion אמורות לשמש. מבוגרים נקבות לחוות פוריות נמוכה מאשר נקבות eclosed החדש ועל כן אינם מתאימים להזרקה. שלישית, מוזרק dsRNA עשוי לקבל דחף החוצה על ידי הלחץ הפנימי של הבטן הנשית. כדי למזער את האפשרות לאבד כמות גדולה של dsRNA לאחר ההזרקה, להחזיק את מחט לבטן עבור ~ 5 שניות לאחר ההזרקה ולאחר מכן הסר אותו לאט (6.2.8). בינתיים, להימנע לחיצה על הבטן של הנקבה במהלך או מידלאחר ההזרקה. כדי לעקוף תוצאות מוטות נגרמת מבעיה זו, להזריק לפחות 8 נקבות לכל dsRNA להשיג מספיק הצאצאים (~ 200 עוברים מדי יום) לניתוח פנוטיפי. רביעית, תשואת ביצה גבוהה חשובה לספק נתונים משוחדים לניתוח פנוטיפי לאחר הזרקה. בממוצע, כל נקבה ד maculatus מייצרת כ 35-55 עוברים מדי יום. תשואה ביצה תלוי בגודל האוכלוסייה, אישה, לחות, זמינות מזון, טמפרטורה (מידע לא מוצג), וגורמים סביבתיים אחרים 54. בדרך כלל, נקבות מטילות יותר על 30 מעלות צלזיוס מ -25 מעלות צלזיוס. חמישית, ניתן פריו עוברים שלא נולדה על ידי הזחלים בקעו. כמו זחלים בקעו הם בדרך כלל wild-type דמוי או רק מושפע במתינות, בעוד עובריים שלא נולד הם בדרך כלל יותר קשות מושפע שההרגל של זחלי ד maculatus יכול לגרום לתוצאות מוטות ניתוח פנוטיפי כמותית. לכן, הסרת הזחלים בקעו מוקדם ככל האפשר מומלץ מאוד.

המעבדה שלנו התמקדה פילוח ד maculatus, אף שהיבטים רבים של מינים, כולל זו פיזיולוגיה, אקולוגיה, דברה-הם עניין רב. ללימוד עובר ופילוח, סדרה של פסי פיגמנט כהה בצד הגבי של זחלי ד maculatus יכולה לשמש כסמן טבעי התפתחות לא תקינה. כמו כן, setae מאפיין מושרש על פסים פיגמנט של הזחלים יכול לשמש כאינדיקציה מגזרים. תכונות מורפולוגיות אלה, יחד עם הממצא כי במתינות או די עוברים מושפע יכול לשרוד עד הבקיעה, הם היתרונות של המודל ד maculatus כדי לחקור את המנגנונים המעורבים patterning תוכנית הגוף הבסיסי.

לבסוף, את החשיבות של ביצוע ניסויים-כולל מבוקרת מאוד כביקורת שלילית כגון dsRNA GFP ובדיקת שני אזורי היעד שאינו חופפים עבור כל גן-היא קריטית כדי למנוע פרשנות שגויה עקב effects של הזרקת כשלעצמה ואפקטים מחוץ היעד. עבור ד maculatus, 4 - 6 מיקרוגרם (2 μl של 2 או 3 מיקרוגרם / μl) dsRNA הוזרקו כל הנשי ואת dsRNA היה 200-250 נ"ב ארוך. סכומים ופרטים נוספים של הפרוטוקול ייתכן שיהיו צורך אופטימיזציה אם מיקוד גנים מתפקדים בהמשך פיתוח או בתהליכי חילוף חומרים / פיסיולוגיים שונים. תגליות קודמות הראו כי השפעות RNAi ניתן מועברות לדורות הבאים מעבר דור F1 ב C. elegans 15. מיעוטם של הזחלים בקעו ד maculatus עם מומים פילוח בשל RNAi יכול לשרוד עד לבגרות והוא יכול להתרבות. ניסויים ראשוניים הצליחו לחשוף ליקויים ברורים בדור F2. מחקרים עתידיים עשויים לחשוף השפעות בין דוריות של RNAi של מין זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208 (2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822 (2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674 (2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440 (2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602 (2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32 (2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490 (2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5 (2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).
התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).More

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter